Quantification en temps réel des effets du TnpB associé à la famille IS200/IS605 sur l’activité des transposons

Résumé

Un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en temps réel en direct afin de quantifier comment la protéine accessoire TnpB affecte la dynamique de transposition dans les cellules vivantes individuelles d’Escherichia coli .

Résumé

Ici, un protocole est décrit pour effectuer une imagerie en direct et en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules bactériennes vivantes à l’aide d’une suite de rapporteurs fluorescents couplés à la transposition. En particulier, il démontre comment l’imagerie en temps réel peut être utilisée pour évaluer les effets de la protéine accessoire TnpB sur l’activité de l’élément transposable IS608, membre de la famille des éléments transposables IS200/IS605. La famille IS200/IS605 d’éléments transposables sont des éléments mobiles abondants liés à l’un des gènes les plus innombrables trouvés dans la nature, tnpB. Les homologies de séquence suggèrent que la protéine TnpB pourrait être un précurseur évolutif des systèmes CRISPR/Cas9. De plus, le TnpB a suscité un regain d’intérêt, ayant été montré comme une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN de type Cas. Les effets de TnpB sur les taux de transposition de l’IS608 sont quantifiés, et il est démontré que l’expression de TnpB de l’IS608 entraîne une augmentation ~5x de l’activité du transposon par rapport aux cellules dépourvues d’expression de TnpB.

Introduction

Les éléments transposables (ET) sont des éléments génétiques qui se mobilisent au sein de leur génome hôte par excision ou catalysent la copie suivie d’une réintégration génomique. Les ET existent dans tous les domaines de la vie, et la transposition restructure le génome de l’hôte, mutant les régions codantes et de contrôle¹. Cela génère des mutations et une diversité qui jouent un rôle important dans l’évolution^2,3, le développement ^4,5, et plusieurs maladies humaines^6, dont le cancer⁷.

Protocole

1. Préparation de cultures bactériennes

1. Cultiver la souche MG1655 d’E. coli avec des constructions de transposons plasmidiques (décrites précédemment dans Kim et ^coll.8) pendant une nuit dans LB avec les antibiotiques appropriés (25 μg/mL de kanamycine, voir le tableau des matériaux) à 37 °C.
   REMARQUE : Les séquences des constructions utilisées et les séquences associées sont disponibles sous les numéros d’acquisition GenBank²⁰ OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 et OP717085.
2. Pour obtenir une croissance exponentielle à l’état d’équilibre, diluer les cul....

Résultats

Cette méthode de visualisation de l’activité des transposons dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence, tout en ayant un débit inférieur à celui des mesures de fluorescence en vrac, permet une visualisation directe de l’activité des transposons dans les cellules vivantes individuelles. Les événements d’excision de transposons entraînent la reconstitution du promoteur de mCerulean3 (Figure 1), permettant l’identification des cellules subissant une activité de transposon par fluorescence bleu vif (

Discussion

La méthode unique présentée ici pour l’imagerie en temps réel de l’activité des éléments transposables dans les cellules vivantes est un test sensible qui peut détecter directement la transposition dans les cellules vivantes et en temps réel et corréler cette activité avec l’expression de protéines accessoires. Bien que le débit soit inférieur à ce qui peut être accompli par des méthodes en vrac, cette méthode permet d’obtenir des mesures détaillées de l’activité TE et de l’expression des protéines dans les cellules viva.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2 tonnes d’époxy transparent	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Sulfate d’ammonium	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Chlorhydrate d’anhydrotétracycline	Sigma-Aldrich	37919
Laser à argon	Melles Griot	35-IMA-840-015
Bleu Filtre Cube	Chroma	Ex : Z457/10X, Em : ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon
Eppendorf epTIPS abandonné Boîtes et plateaux de recharge, volume : 0,1 à 10 & micro ; L, Longueur : 3,4 cm, 1,33 po, PP (polypropylène)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boîtes et plateaux de recharge, Volume : 50 à 1000 & micro ; L, Longueur : 7,1 cm, 2,79 po, PP (polypropylène)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Sulfate ferreux Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fidji Fidji			(imagej.net)
Fisher BioReagents  ;LB Bouillon, Miller (granulé)	Fisher Scientific	BP9723-2  ;
Glissière de protection en verre	Fisher Scientific	12-542B  ;
Sulfate de kanamycine	Sigma-Aldrich	1355006
Sulfate de magnésium Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Phosphate de potassium monobasique	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Rouge Filtre Cube Chroma	Ex	: ET560/40X, Em : ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent 1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Chlorhydrate de thiamine	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Jaune Filter Cube	Chroma	Ex : Z514/10X, Em : ET535/30M