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Système de détection de virus à ADN basé sur RPA-CRISPR/Cas12a-SPM et Deep Learning

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DOI :

10.3791/64833

⸱

10 mai 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole qui combine l’amplification de la polymérase recombinase avec un système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN et construisons une microscopie portable pour smartphone avec une classification assistée par l’intelligence artificielle pour la détection des virus à ADN au point de service.

Résumé

Nous présentons un système de détection de virus à ADN rapide, facile à mettre en œuvre, très sensible, spécifique à une séquence et au point de service (POC), qui combine l’amplification par polymérase recombinase (RPA) et le système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN. L’ADN cible est amplifié et reconnu séparément par RPA et CRISPR/Cas12a, ce qui déclenche l’activité de clivage collatéral de Cas12a qui clive un rapporteur d’ADN marqué par fluorophore et généralise la fluorescence. Pour la détection POC, la microscopie portable pour smartphone est conçue pour prendre des images fluorescentes. En outre, des modèles d’apprentissage profond pour la classification binaire d’échantillons positifs ou négatifs, atteignant une grande précision, sont déployés au sein du système. Le virus de la grenouille 3 (FV3, genres Ranavirus, famille des Iridoviridae) a été testé à titre d’exemple pour ce système de détection POC de virus à ADN, et les limites de détection (LoD) peuvent atteindre 10 aM en 40 min. En l’absence d’opérateurs qualifiés et d’instruments encombrants, le RPA-CRISPR/Cas12a-SPM portable et miniature avec classification assistée par l’intelligence artificielle (IA) présente un grand potentiel pour la détection des virus ADN POC et peut aider à prévenir la propagation de ces virus.

Introduction

Ces dernières années, des épidémies de maladies infectieuses causées par différents virus se sont produites fréquemment, notamment l’épidémie de maladie à virus Ebola (MVE) en 20141 et 20182, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) en 20153, l’épidémie de maladie à virus Zika en 20154, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2)5 et la variole du singe persistante causée par le virus de la variole du singe (MKPV) en 20226. Ces épidémies soudaines de maladies infectieuses épidémiques causent un grand nombre de décès et entraînent d’énormes pertes économiques et des troubles sociaux. Il est urgent de disposer d’un système de détection rapide et précis pour diagnostiquer rapidement l’infection et empêcher la propagation du virus.

Récemment, les répétitions palindromiques courtes (CRISPR) et les protéines associées à CRISPR (Cas) ont attiré l’attention du monde entier et ont montré des résultats prometteurs dans la détection des acides nucléiques 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . La protéine CRISPR/Cas12a, guidée par l’ARN CRISPR (ARNcr), se lie à l’ADN cible et le clive. Cette activité conduit à la libération d’ADN simple brin non spécifique (ADNsb), connu sous le nom de trans-clivage, et peut être utilisée pour améliorer le signal de détection pour la détection des acides nucléiques. Certaines méthodes de détection traditionnelles, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et le test immuno-enzymatique (ELISA) sont compliquées, longues et coûteuses pour la détection au point de service (POC). Nos travaux précédents ont permis de développer un système de détection automatisé, intégré et rentable du virus de la peste porcine africaine (PPA) basé sur la technologie CRISPR/Cas12a. Dans ce système, nous avons atteint une limite de détection de 1 pM dans un laps de temps de 2 h sans avoir besoin d’amplification. Le système CRISPR/Cas12a et l’amplification par polymérase recombinase (RPA) sont combinés pour améliorer la sensibilité et la spécificité de la détection de l’ADN trace. Comparé à d’autres techniques d’amplification isotherme, le RPA est simple dans sa conception et pratique dans son fonctionnement car il a un temps de réaction plus court sans équipement sophistiqué de contrôle de la température.

Pour la détection des agents pathogènes au point de service, des instruments tels que la microscopie sur smartphone (SPM), le fluorimètre portable ou les bandelettes à flux latéral ont été développés pour la lecture des résultats 16,17,18. SPM capture des images via une caméra et les télécharge sur certaines applications mobiles pour une analyse rapide des données. Une telle microscopie constitue un système d’acquisition de signaux portable, bon marché et miniature avec une sensibilité élevée et a montré des avantages dans la détection d’agents pathogènes tels que H5N1, le virus Zika et le SRAS-CoV-219,20. Par conséquent, nous construisons un SPM portable pour capter les signaux de fluorescence déclenchés par la détection RPA-CRISPR/Cas12a du virus à ADN cible. La sonde rapporteure d’ADNsb reliant un fluorophore et un quencher sera clivée lorsque CRISPR/Cas12a reconnaîtra le virus à ADN cible, et la fluorescence émise par le fluorophore pourra être capturée par SPM.

Par rapport aux logiciels professionnels habituellement utilisés pour obtenir les informations sur les résultats des images de fluorescence de SPM21, certains experts utilisent l’apprentissage automatique et l’apprentissage profond pour quantifier les concentrations d’ADN viral après avoir obtenu des images de fluorescence22, ce qui prend plus de temps. Lorsqu’il s’agit de classifier des images médicales, les réseaux neuronaux conventionnels (CNN) sont souvent utilisés pour apprendre des caractéristiques à partir d’images pixélisées brutes de bout en bout 23,24,25,26. Des modèles populaires d’apprentissage profond basés sur CNN tels que AlexNet, DenseNet-121 et EfficientNet-B7 ont été appliqués avec succès dans ce domaine27,28. Cependant, l’obtention de grands ensembles de données dans des domaines spécifiques peut être difficile, nécessitant un apprentissage par transfert 29,30. Cette approche pré-entraîne un modèle de Deep Learning avec un grand ensemble de données, et le modèle pré-entraîné est utilisé comme point de départ pour une nouvelle tâche avec un petit jeu de données. Cette technique peut réduire le besoin de grands ensembles de données, lutter contre le surajustement et réduire le temps d’entraînement31. Ici, nous utilisons des modèles d’apprentissage profond avec apprentissage par transfert pour la classification binaire des images de fluorescence des échantillons positifs et négatifs.

Dans cette méthode, nous combinons la RPA et le système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN. L’ADN cible est amplifié et reconnu séparément par RPA et CRISPR/Cas12a, ce qui déclenche l’activité de clivage collatéral de Cas12a qui clive un rapporteur d’ADN marqué par fluorophore et généralise la fluorescence. Nous construisons un SPM portable pour prendre les images fluorescentes pour la détection POC et développons des modèles d’apprentissage profond pour la classification binaire. Le schéma du système de détection POC construit est illustré à la figure 1. En l’absence d’opérateurs qualifiés et d’instruments encombrants, le RPA-CRISPR/Cas12a-SPM avec classification assistée par l’intelligence artificielle (IA) présente un grand potentiel pour la détection des virus ADN POC.

figure-introduction-1
Figure 1 : Le schéma du système de détection RPA-CRISPR/Cas12-SPM ainsi que la classification par IA des images collectées. Les acides nucléiques des échantillons d’origine animale sont libérés par le PINDBK. L’ADN cible du virus est amplifié et reconnu spécifiquement par le système RPA-CRISPR/Cas12a. Les liaisons CRISPR/Cas12a avec l’ARNcr et le complexe Cas12a-ARNcr se lie à l’ADN cible, ce qui déclenche le clivage collatéral de CRISPR/Cas12a sur les sondes rapporteures de l’ADNss. Le fluorophore sur le rapporteur est libéré et la fluorescence est détectée par un lecteur de plaques commercialisé ou le SPM que nous construisons. Trois modèles d’apprentissage profond différents, dont AlexNet, DenseNet-121 et EfficientNet-B7 avec apprentissage par transfert, sont utilisés pour classer les images de fluorescence. Cette figure est réutilisée avec la permission de Lei et al.35. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. Traitement des échantillons

  1. Prenez le virus de la grenouille 3 (FV3, genres Ranavirus, famille des Iridoviridae), un virus à ADN double brin. Sélectionnez le gène de la capside majeure (mcp) comme cible pour la détection du FV3, car il est hautement conservé et généralement considéré comme la cible de la détection du ranavirus. La séquence cible sélectionnée est indiquée dans le Tableau 1.
    REMARQUE : Frog Virus 3 est pris comme exemple dans ce protocole.
  2. Pour la préparation des fragments d’ADN cibles, utilisez des fragments d’ADN du gène mcp du FV3 et du virus de la nécrose infectieuse de la rate et du rein (ISKNV, un autre ranavirus).
    REMARQUE : Dans cette étude, les fragments d’ADN cibles ont été obtenus commercialement auprès d’une entreprise figurant dans la Table des matières. Ils sont considérés comme la cible et le contrôle de la détection ultérieure.
NomSéquence
FV3 MCPSNRC : 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg... 3 pi (240 pb)
TS : 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcgcgaaagc... 3 pi (240 pb)
ISKNV MCPSNRC : 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3 pi (231 pb)
TS : 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3 pi (231 pb)

Tableau 1 : Séquence cible sélectionnée dans cette méthode.

2. Réaction RPA

  1. Concevez et synthétisez les paires d’amorces RPA pour la séquence cible. Les séquences des paires d’amorces RPA sont décrites dans le tableau 2.
  2. Préparez le tampon de réaction RPA 5x (Tableau 3) et le MgCl2 (100 mM).
  3. Mélangez les quatre enzymes clés de la RPA (UvsX, UvsY, GP32, protéine Bsu) dans le tampon de réaction 1x RPA, ainsi que les amorces conçues à l’avance, comme détaillé dans le tableau 4.
  4. Mélangez soigneusement le mélange.
  5. Ajoutez 1 μL de la cible obtenue à l’étape 1 pour chaque réaction RPA, et mélangez-le soigneusement par vortex à nouveau.
  6. Ajouter 7 μL de MgCl2 (100 mM) pour amorcer la réaction. Le volume final de chaque réaction RPA est de 50 μL.
  7. Effectuez le test à 37 °C pendant 30 min.
  8. Le produit RPA peut être conservé à 4 °C pendant quelques jours. Au fur et à mesure que les produits RPA se dégradent, utilisez-les pour une détection plus poussée dès que possible afin d’obtenir de meilleurs résultats de diagnostic.
  9. [Facultatif] Effectuer une électrophorèse sur gel d’ADN.
    1. Prélever 5 μL de produits RPA, ajouter un volume approprié de tampon de charge d’ADN 6x et effectuer une électrophorèse sur gel d’ADN dans le tampon Tris-acétate EDTA (TAE).
    2. Faites fonctionner l’électrophorèse sous 120 V pendant environ 20 minutes jusqu’à ce que les bandes de tampon de charge atteignent le fond du gel.
    3. Déterminez si la séquence cible est amplifiée avec succès à partir de l’échantillon en comparant la taille des bandes de l’échantillon avec les bandes du marqueur.
NomSéquence
Apprêt RPA FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Apprêt RPA RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tableau 2 : Amorces RPA utilisées dans cette méthode.

ComposantConcentration d’origineAddition
PEG 20 000-114 mg
ATP100 millions de mètres125 μL
dNTP25 millions d’euros48 μL
Tris-HCl1 M125 μL
La TNT1 M125 μL
Phosphocréatine1 M250 μL
Créatine kinase10 μg/μL50 μL
jjH2O-277 μL
Total Volume-1 mL

Tableau 3 : La composition du tampon de réaction 5x RPA (pH 7,5).

ComposantConcentration d’origineAddition
5x tampon de réaction RPA-10 μL
Protéine UvsX5 mg/mL2,6 μL
Protéine UvsY5 mg/mL0,9 μL
Protéine GP325 mg/mL2,54 μL
Protéine Bsu5 mg/mL0,88 μL
apprêt avant100 μM0,25 μL
apprêt inversé100 μM0,25 μL
jjH2O-24,58 μL
Cible-1 μL
*MgCl2100 millions de mètres7 μL
Total Volume50 μL
*MgCl2 doit être ajouté en dernier lieu pour initier la réaction RPA.

Tableau 4 : Composition de la réaction RPA.

3. Détection CRISPR/Cas12a sans SPM

  1. Utilisez les ARNc (Table des Matériaux) de la séquence cible et la sonde rapporteure d’ADNsb reliant un fluorophore et un quencher pour CRISPR/Cas12a. Ici, la carboxy tétraméthylrhodamine (TAMRA) est liée en tant que fluorophore aux extrémités 5' des sondes rapporteures d’ADNss et le trou noir Quencher-2 (BHQ2) en tant que quencher aux extrémités 3'. La séquence détaillée de l’ARNcr et du rapporteur d’ADNsb est décrite dans le tableau 5.
  2. Préparez la protéine Cas12a (LbCas12a) de la bactérie Lachnospiraceae avec 10 tampons de réaction CRISPR/Cas12a.
  3. Dissoudre 1 μL de produit de réaction RPA de la section 2 dans 1 tampon de réaction CRISPR/Cas12a avec des complexes LbCas12a-crRNA et une sonde rapporteure d’ADNsb de 500 nM dans un volume de réaction de 100 μL.
  4. Après avoir mélangé LbCas12a et l’ARNcr, laissez reposer le mélange pendant au moins 5 minutes pour former un complexe fonctionnel. Après l’incubation, ajoutez d’autres composants au mélange réactionnel et effectuez l’ensemble de la réaction à 37 °C. Le volume final de chaque réaction CRISPR/Cas12a est de 100 μL. Les concentrations détaillées de chaque composant dans chaque réaction CRISPR/Cas12a sont décrites dans le tableau 6.
  5. Effectuez la réaction de détection CRISPR/Cas12a de 100 μL à 37 °C pendant 30 min.
  6. Examiner en permanence les signaux de fluorescence par un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 535 nm et une longueur d’onde d’émission de 595 nm avec un gain de 60.
    REMARQUE : La détection de différentes longueurs d’onde d’excitation et d’émission de lumière dépend du choix du fluorophore et de l’extincteur dans les sondes rapporteures d’ADNsb précédemment conçues.
  7. Pour ces données collectées, divisez la valeur de contrôle par la mesure des échantillons positifs pour normaliser toutes les données, puis intégrez-les pour une analyse de test t à deux échantillons.
NomSéquence
ARNc LbCas12a pour FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTTTCGGTCGGCGT
Rapporteur d’ADNss/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tableau 5 : Séquences de l’ARNcr CRISPR/Cas12a et du rapporteur d’ADNsb utilisés dans cette méthode.

ComposantConcentration d’origineAddition
NEBuffer r2.1-10 μL
LBA Cas12a (Cpf1)10 μM0,5 μL
ARNcr10 μM0,625 μL
Attendez au moins 5 min pour laisser le complexe LbCas12a/ARNcr se combiner.
Rapporteure ADN100 μM0,5 μL
jjH2O-87,375 μL
Cible-1 μL
Total Volume-100 μL

Tableau 6 : La composition de la réaction CRISPR/Cas12a.

4. Configuration SPM

  1. Pour le chemin d’excitation, réglez un faisceau laser pour qu’il passe à travers les filtres de densité neutre (ND) afin d’atténuer l’intensité du laser.
  2. Générer un faisceau collimaté à partir d’une lentille asphérique (ci-après dénommée L1) et le réfléchir par le miroir dichroïque (DM).
  3. Dirigez la lumière sur la lame de verre où l’échantillon est placé à travers l’objectif (20x) pour éclairer et exciter la fluorescence de l’échantillon. La platine d’échantillonnage permet un réglage précis du plan focal, en dirigeant le faisceau vers le plan focal arrière de l’objectif. Les étapes mentionnées ci-dessus forment le chemin d’excitation de l’instrument SPM.
  4. Pour le trajet d’émission, positionnez une lentille externe (ci-après dénommée L2) de manière à former une image intermédiaire de l’autre côté de l’objectif. L’objectif éclaire simultanément l’échantillon et recueille le signal d’émission.
  5. Enregistrez le signal de fluorescence de l’échantillon à l’aide du smartphone placé à la fin du trajet d’émission. Utilisez un support stable pour éviter les secousses.
  6. Réglez un filtre passe-bande entre L1 et l’appareil photo du smartphone pour filtrer la lumière excitée tout en ne laissant que la lumière émise de l’échantillon atteindre l’appareil photo, ce qui peut optimiser la détection.
  7. Immobilisez la configuration SPM sur une carte d’essai pour un déploiement portable.
    REMARQUE : Le schéma et l’aspect physique du dispositif SPM pour la détection de fluorescence basé sur la réaction RPA-CRISPR/Cas12a sont illustrés à la figure 2. La détection CRISPR/Cas12a a lieu sur la lame de verre prétraitée décrite à l’étape suivante.

figure-protocol-1
Figure 2 : Schéma et aspect physique du dispositif SPM utilisé pour la détection de fluorescence. (A) Aspect physique du dispositif SPM pour la collecte d’images de fluorescence après la réaction RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Schéma du dispositif SPM pour la détection de fluorescence basé sur la réaction RPA-CRISPR/Cas12a. Cette figure est modifiée (position et couleur de l’image ajustées) avec la permission de Lei et al.35. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Traitement de la lame de verre pour la détection avec SPM

  1. Préparez le polydiméthylsiloxane (PDMS) en mélangeant la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1, puis faites cuire sur une plaque chauffante à 80 °C pendant 2 h.
  2. Traitez à la fois le PDMS et la lame de verre (Longueur : 75 mm ; Hauteur : 50 mm) avec un traitement au plasma d’oxygène pendant 120 s, puis pressez-les ensemble.
  3. Cuire le verre/PDMS à 95 °C pendant 2 h ; il est scellé de manière permanente par la liaison Si-O-Si. Le PDMS a une transparence élevée et aucune auto-fluorescence, ce qui est propice à la détection SPM. Le traitement de la lame de verre et du PMDS est effectué conformément à He et al.32

6. Détection CRISPR/Cas12a avec SPM

  1. Utilisez les ARNc (Table des Matériaux) de la séquence cible et la sonde rapporteure d’ADNsb reliant un fluorophore et un quencher pour CRISPR/Cas12a. Dans cette méthode, la carboxy tétraméthylrhodamine (TAMRA) est liée en tant que fluorophore aux extrémités 5' des sondes rapporteures d’ADNss et le trou noir Quencher-2 (BHQ2) en tant que quencher aux extrémités 3'. La séquence détaillée de l’ARNcr et du rapporteur d’ADNsb est décrite dans le tableau 5.
  2. Préparez la protéine Cas12a (LbCas12a) de la bactérie Lachnospiraceae avec 10 tampons de réaction CRISPR/Cas12a.
  3. Dissoudre 1 μL de produit de réaction RPA de la section 2 dans 1 tampon de réaction CRISPR/Cas12a avec des complexes LbCas12a-crRNA et une sonde rapporteure d’ADNsb de 500 nM dans un volume de réaction de 100 μL.
  4. Après avoir mélangé LbCas12a et l’ARNcr, laissez reposer le mélange pendant au moins 5 minutes pour former un complexe fonctionnel. Après l’incubation, ajoutez d’autres composants au mélange réactionnel et terminez la réaction à 37 °C. Le volume final de chaque réaction CRISPR/Cas12a est de 100 μL. Les concentrations détaillées de chaque composant dans chaque réaction CRISPR/Cas12a sont décrites dans le tableau 6.
  5. Effectuez la réaction de détection CRISPR/Cas12a de 100 μL sur la lame de verre prétraitée et couvrez-la d’une lamelle. Incuber la lame de verre avec réaction à RT pendant 10 min.
  6. Mesurez les signaux de fluorescence à l’aide du SPM. Placez la lame de verre avec la réaction de détection sur la platine du SPM, maintenez une distance appropriée, ajustez la distance focale et la clarté, puis recherchez le champ de vision de la réaction et faites-le correspondre pour capturer une image.
    REMARQUE : Il faut d’abord obtenir une courbe standard afin que les données des échantillons puissent être mises à l’échelle à la plage de concentration approximative. Diverses concentrations de cibles purifiées sont utilisées, notamment 10 nM, 1 nM, 100 pM et 10 pM, un autre virus comme contrôle négatif (avant RPA).

7. Ensemble de données et augmentation des données

  1. Recueillir les images de fluorescence du test de détection de la section 6 en tant qu’ensembles de données. Répétez au moins trois détections parallèles pour chaque échantillon afin de garantir le parallélisme des données.
    1. Certaines méthodes appropriées pour obtenir un parallélisme plus élevé peuvent être approuvées. Par exemple, lorsque vous collectez les images de fluorescence de chaque échantillon, faites la mise au point manuellement et recherchez un champ relativement plus clair pour prendre des images. En même temps, photographiez chaque échantillon pour obtenir le signal de fluorescence dans plus de cinq endroits différents.
  2. Mesurez la valeur moyenne de gris de chaque image et l’écart-type de la valeur moyenne de gris dans un groupe de concentration à l’aide d’ImageJ.
  3. Définissez une plage d’intensités [médiane - écart-type, médiane + écart-type] pour le nettoyage des données.
    REMARQUE : Dans les images obtenues dans les premières étapes, il peut y avoir des images avec de grandes différences, il est donc nécessaire de filtrer les images. Si l’intensité des images est en dehors du seuil défini, elles doivent être considérées comme des valeurs aberrantes et exclues.
  4. Étiquetez les images de la cible purifiée à des concentrations croissantes de 0 à 6 dans l’ordre croissant, respectivement.
  5. Pour améliorer la robustesse du système et éviter le sur-ajustement, implémentez des techniques d’augmentation d’image telles que le retournement horizontal, le retournement vertical et le bruit aléatoire via des fonctions de transformation en Python. Cela permet d’introduire des variations dans l’ensemble de données.

8. Apprentissage par transfert

  1. En tant que réseau de base, adoptez le modèle d’apprentissage profond AlexNet33 pour la classification.
  2. Pour satisfaire la contrainte du modèle pré-entraîné de la section 7, remodelez les images d’entrée à 224 pixels x 224 pixels x 3 canaux (hauteur et largeur de 224 pixels et profondeur de 3 canaux pour les canaux de couleur rouge, vert et bleu) à l’aide de fonctions de transformation dans Python.
    REMARQUE : Cette étape est un prétraitement courant pour les données hétérogènes dans l’apprentissage par transfert, y compris la transformation.
  3. Utilisez un réseau dorsal pré-entraîné avec l’ensemble de données ImageNet pour extraire des entités tout en exploitant les poids des couches cachées intermédiaires qui ont été apprises.
  4. Dans le contexte de la classification de fluorescence, remplacez la couche finale entièrement connectée du réseau neuronal, qui comprenait à l’origine 1000 neurones pour la tâche ImageNet, par une couche entièrement connectée avec 2 ou 7 neurones.
  5. Évaluez les performances du modèle d’entraînement de configuration à l’aide d’une série de mesures, notamment la matrice de confusion, l’exactitude, la précision, le rappel et le score F1 basé sur Lawton et Viriri34.

Résultats

Cette méthode se concentre sur un système de détection rapide, facile à mettre en œuvre, très sensible et au point de service (POC) pour les virus à ADN. La conception des paires d’amorces pour la réaction RPA et la conception de l’ARNcr pour la réaction CRISPR/Cas12a sont deux des éléments essentiels car elles affecteront l’efficacité de la réaction RPA-CRISPR/Cas12a et influenceront la détection et la classification ultérieures.

Dans cette méthode, le FV3 est considéré comme un exemple de détection de virus à ADN. Certaines paires d’amorces RPA pour FV3 sont conçues, et la plus efficace est choisie et s’assure qu’elle présente une bonne efficacité d’amplification, ce qui peut être confirmé en assurant la luminosité et la taille des bandes par électrophorèse sur gel des produits RPA comme mentionné à l’étape 2.8. Dans le même temps, nous avons conçu des ARNc CRISPR/Cas12a et choisi le plus efficace en fonction du signal de fluorescence plus fort déclenché dans la réaction CRISPR/Cas12a sans RPA. La séquence des trois amorces avant et des trois amorces arrière pour la RPA et des trois ARNcr pour Cas12a est illustrée dans le tableau 7. D’après les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose présentés à la figure 3, la 6ème paire d’amorces donne une meilleure efficacité d’amplification (F2 et R1), qui est sélectionnée pour la méthode. Comme le montre la figure 4, l’ARNcr-3 est le plus efficace pour le clivage collatéral, qui est sélectionné dans la méthode.

Apprêt RPA F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAG
Apprêt RPA F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Apprêt RPA F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAGTGGT
Apprêt RPA R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
Apprêt RPA R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
Apprêt RPA R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a ARNcr-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a ARNcr-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a ARNcr-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTTTCGGTCGGCGT

Tableau 7 : Les amorces RPA et les séquences d’ARNcr pour l’optimisation de la réaction.

figure-results-1
Figure 3 : Résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose pour l’évaluation de l’efficacité de la RPA. Les réactions RPA ont été réalisées à l’aide de différentes combinaisons d’amorces dans les mêmes conditions avec une cible purifiée de 1 nM. La question numéro 1 était la combinaison de RPA-F3 et RPA-R3, 2 RPA-F3 et RPA-R2, 3 RPA-F3 et RPA-R1, 4 RPA-F2 et RPA-R3, 5 RPA-F2 et RPA-R2, 6 représentaient RPA-F2 et RPA-R1, 7 RPA-F1 et RPA-R3, 8 RPA-F1 et RPA-R2, 9 RPA-F1 et RPA-R2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 4 : Détection des fragments cibles du FV3 avec trois ARNcr différents par le CRISPR/Cas12a. Les concentrations de fragments purifiés appliqués dans la détection étaient de 10 nM à 100 pM d’ADN cible contre 10 nM d’ADN témoin avec 30 min d’incubation. Cette figure est réutilisée avec la permission de Lei et al.35. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour générer les données de la figure 5, nous avons appliqué des amorces RPA optimisées, de l’ARNcr et la configuration SPM. Pour avoir une meilleure idée de la concentration dans les échantillons, nous avons amplifié 240 fragments d’ADN pb du gène de la capside majeure (MCP) hautement conservé du FV3 et du virus de la nécrose infectieuse de la rate et du rein (ISKNV, Iridoviridae) comme cible et témoin à l’aide d’un kit d’amplification PCR, qui est exécuté avec les procédures indiquées dans le tableau 8. La taille de l’ADN amplifié est confirmée par électrophorèse sur gel d’agarose, et nous avons extrait la cible et le contrôle de l’ADNdb purifiés du gel. Les fragments d’ADN purifiés sont quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop 2000.

figure-results-3
Figure 5 : Les images de fluorescence de l’ADN cible purifié et de l’ADN témoin. (A) Le contrôle négatif. (B) ADN cible purifié (100 pM). Cette figure est réutilisée avec la permission de Lei et al.35. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ÉtapeTempérature (°C)HeureCycle(s)
Démarrage à chaud95Durée : 5 minutes1
Dénaturation9530 s35
Recuit6045 secondes
Extension7230 s
Extension72Durée : 5 minutes1
Stockage4--

Tableau 8 : Procédure d’amplification par PCR.

À titre de référence uniquement, un ensemble de données comprenant 162 images de fluorescence est obtenu après le nettoyage des données. Le nombre d’images de fluorescence pour une analyse plus approfondie doit être augmenté, et nous avons entraîné l’ensemble de données en utilisant 337 images de fluorescence pour la classification binaire et 398 pour la classification multiclasse.

Nous avons réalisé une détection en 40 minutes environ, dont 30 minutes pour l’amplification RPA et 10 minutes pour la détection LbCas12a après RPA. Lors de l’utilisation du système de détection développé avec des amorces RPA et de l’ARNcr sélectionnés, l’intensité du signal de 10 aM FV3 et du contrôle montre des différences significatives, comme le montre la figure supplémentaire 1.

Figure supplémentaire 1 : Les statistiques de l’intensité du signal pour les images de fluorescence collectées dans les réactions RPA-LbCas12a avec diverses concentrations de fragments purifiés. * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; : p < 0,001 ; : p < 0,0001 ; F : FV3, I : ISKNV ; U.A. : Unité d’absorbance. Cette figure est réutilisée avec la permission de Lei et al.35. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette méthode, nous développons un système de détection de virus à ADN rapide, facile à mettre en œuvre, très sensible, spécifique à une séquence et POC avec l’aide de l’IA. Après avoir obtenu des échantillons, la RPA est appliquée pour amplifier la séquence cible, puis CRISPR/Cas12a peut reconnaître l’ADN cible et libérer de la fluorescence, ce qui élargit le signal de détection. La microscopie portable pour smartphone est conçue pour prendre des images de fluorescence, et les modèles d’apprentissage profond avec apprentissage par transfert sont utilisés pour la classification binaire des images des échantillons positifs et négatifs. Le FV3 est prélevé comme échantillon positif dans cette méthode, puis étudié sous plusieurs angles afin d’améliorer la spécificité et la sensibilité du système proposé.

La première stratégie consiste à concevoir des amorces RPA spécifiques et à sélectionner les amorces les plus efficaces. L’efficacité d’amplification de la réaction RPA est influencée par différentes amorces36. La spécificité des amorces utilisées pour amplifier le gène cible des souches virales d’ADN peut être confirmée par dynamitage par rapport à la base de données standard de séquençage nucléotidique. Comme il n’existe pas de guide pour concevoir des paires d’amorces RPA efficaces, une validation expérimentale est nécessaire37.

Une autre approche consiste à concevoir l’ARNcr du virus cible pour la réaction CRISPR/Cas12a, car l’efficacité du clivage collatéral contribue de manière significative à la sensibilité de la détection38,39. L’intensité du signal de fluorescence déclenché dans la réaction CRISPR/Cas12a sans RPA doit être prise en compte dans la sélection du meilleur ARNcr. De plus, l’activité collatérale de la protéine LbCas12a est constamment activée pendant 24 h32, ce qui peut être bénéfique pour la détection.

Dans le but d’identifier les virus et de visualiser les particules virales, la microscopie à fluorescence a été appliquée40,41. Cependant, la microscopie conventionnelle est lourde et coûteuse pour un diagnostic rapide du POC. Ainsi, dans le système proposé, un SPM portable à moindre coût est construit pour atteindre le signal de fluorescence en capturant les images pour la détection POC. Un tel SPM portable coûte beaucoup moins cher qu’un lecteur de plaques commercialisé ou une machine PCR en temps réel, ce qui est rentable pour la configuration du système de détection.

La plate-forme proposée doit également être améliorée à certains égards. Lors de l’application de cette plate-forme de détection à d’autres virus à ADN, l’amorce RPA et la séquence Cas12a-crRNA doivent être repensées. Comme il n’existe pas de guide pour leur conception, des expériences doivent être menées pour évaluer leur efficacité. Bien que le système proposé puisse bénéficier des avantages de la portabilité, la taille de l’ensemble du système doit encore être réduite pour obtenir un système plus léger. Étant donné que l’appareil photo du téléphone portable lui-même n’est pas facile à mettre au point pour la prise de vue à courte distance, il faut du temps pour s’ajuster pendant le processus d’obtention d’images fluorescentes, y compris le champ de vision, pour des images de meilleure qualité.

Grâce aux progrès de la technologie connexe et à ses nouvelles applications, l’efficacité de la détection des COP continuera de s’améliorer. La méthode présentée ici est un exemple d’une amélioration qui pourrait aider à la détection des POC basée sur le système CRISPR/Cas12a et la plate-forme SPM, avec une nouvelle assistance de l’IA. De plus, le système intégré peut être utilisé pour identifier n’importe quelle cible d’ADN en raison de la reprogrammabilité de l’ARNcr. Le système RPA-CRISPR/Cas12a-AI aura une position importante dans l’identification des agents pathogènes de l’ADN en termes de sensibilité de détection, de spécificité, de temps et de fiabilité.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 31970752, la Commission de la science, de la technologie et de l’innovation de la municipalité de Shenzhen JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708 WDZC20200820173710001 ; Laboratoire de la baie de Shenzhen, SZBL2020090501004 ; Fondation chinoise des sciences postdoctorales 2020M680023 ; et Administration générale des douanes de la République populaire de Chine 2021HK007.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amplification 20xOLYMPUSOPLN20X
532 nm laser vertThorlabsPL201avec puissance de sortie de 0,9 mW Longueur
d’onde de coupure de 535 nmchromeAT535
6x tampon de chargement d’ADNThermo scientificR0611
Microplaque noire à 96 puitsCorning Incorporated3603Noir avec fond plat clair
Lentille asphériqueLubangN/A
Filtre passe-bandeSEMROCKFF01-542/27-25
Bsu ADN polyméraseATG BiotechnologyM103Large Fragment
crRNASangon BiotechN/A
Fragments d’ADNSangon BiotechN/A
Supports dichroïquesRuicageN/A
Miroir dichroïqueSEMROCKFF555-Di03-25x36avec une longueur d’onde de coupure de 535 nm
E.Z.N.A Kit d’extraction de gel OmegaBiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Porte-filtresRuicageN/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher sondes rapporteuresSangon BiotechN/ATAMRA (carboxy tétraméthylrhodamine) comme fluorophore aux 5 extrémités ; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) en tant que quencher aux 3 extrémités
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJ Open-sourceVersion 1.53t 24Téléchargé de https://imagej.nih.gov/ij/  ;
Lecteur de microplaquesSPARK, TECANN/A
Multi-Block Thermal Cycler Instrument PCRLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotomètresThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Tampon de réaction
Traitement au plasma d’oxygène  ;Electro-Technique  ; ProduitsN/A
Inactivé par agent pathogène, sans extraction d’acide nucléique, tampon Direct-to-PCR avec protéinase K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
Paires d’amorces PCRSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
Paires d’amorces RPASangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Étages de traductionRuicageN/A
Filtres à densité neutre transmisThorlabsND40A
Lentilles achromatiques tripletsThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106

Références

  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

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