Ici, l’injection intrapéritonéale de cellules leucémiques est utilisée pour établir et propager la leucémie myéloïde aiguë (LAM) chez la souris. Cette nouvelle méthode est efficace dans la transplantation en série de cellules AML et peut servir d’alternative pour ceux qui peuvent éprouver des difficultés et des incohérences avec l’injection intraveineuse chez la souris.
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Article de méthode
Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il existe un besoin non satisfait de nouvelles thérapies pour traiter la leucémie myéloïde aiguë (LAM) et la rechute associée qui implique des cellules souches leucémiques persistantes (LSC). Un modèle expérimental de rongeurs AML pour tester des thérapies basées sur la transplantation réussie de ces cellules par injections rétro-orbitales chez des souris receveuses est semé d’embûches. L’objectif de cette étude était de développer une méthode simple, fiable et cohérente pour générer un modèle murin robuste de LAM en utilisant une voie intrapéritonéale. Dans le protocole actuel, les cellules de la moelle osseuse ont été transduites avec un rétrovirus exprimant l’oncoprotéine de fusion MLL-AF9 humaine. L’efficacité des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que CLL donneurs dans le développement de la LAM primaire a été testée, et l’injection intrapéritonéale a été adoptée comme nouvelle méthode pour générer la LAM. La comparaison entre les injections intra-péritonéales et rétro-orbitales a été faite dans des transplantations en série pour comparer et contraster les deux méthodes. Les cellules Lin- et LSK transduites avec le virus MLL-AF9 humain bien greffé dans la moelle osseuse et la rate des receveurs, conduisant à une LAM à part entière. L’injection intrapéritonéale de cellules de donneur a établi la LAM chez les receveurs lors de la transplantation en série, et l’infiltration de cellules de LAM a été détectée dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie des receveurs par cytométrie en flux, qPCR et analyses histologiques. Ainsi, l’injection intrapéritonéale est une méthode efficace d’induction de la LAM utilisant la transplantation en série de cellules leucémiques de donneur.
Introduction
La leucémie myéloïde aiguë (LAM) est un type d’hémopathie maligne d’étiologie diverse avec un mauvais pronostic1. La génération de modèles animaux de LAM jette les bases de la compréhension de ses variations complexes et de sa pathobiologie dans le but de découvrir de nouvelles thérapies2. La leucémogenèse chez la souris implique la transplantation de cellules de donneurs exprimant des oncoprotéines de fusion, y compris des fusions impliquant le gène de la leucémie de lignée mixte (MLL) pour induire puissamment la LAM, afin d’imiter la maladie chez l’homme3. Diverses origines cellulaires de cellul....
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Protocole
Toutes les expériences ont été préapprouvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie.
1. Préparation des tampons et des réactifs
- Préparer des plaques de gélose LB supplémentées en ampicilline (AP) (plaques stériles de 10 cm). Pour ce faire, dissoudre 10 g de bouillon LB avec de la gélose dans 400 mL d’eau distillée, remuer et porter le volume à 500 mL. Stériliser la solution par autoclavage, puis laisser refroidir la solution, ajouter 0,5 mL d’ampicilline (stock : 150 mg/mL) dans la solution et agiter pour mélanger. Ajouter immédiatement 18 mL de sol....
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Résultats
Comparaison de l’efficacité de transplantation de cellules de LAM murines par les voies de transplantation r.o. et i.p.
Auparavant, l’établissement de 1° AML a été rapporté chez des souris receveuses transplantées rétro-orbitalement avec des cellules LSK transduites MLL-AF9, et la transplantabilité de cellules AML 1° a été démontrée par transplantation en série30. La présente étude est la première à évaluer la possibilité d’utiliser des cellules Lin- de moelle osseus.......
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Discussion
Ces études décrites ci-dessus fournissent des preuves à l’appui que la transplantation de cellules Lin- est comparable à celle de cellules LSK dans la génération de LAM murine de 1°. En outre, les données actuelles montrent également que l’injection intraveineuse est une méthode efficace et pratique pour établir la LAM murine par rapport à l’injection intraveineuse (ou r.o.).
En plus des cellules LSK, d’autres populations telles que le progéniteur granulocytaire-monocytaire (GMP), l.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core Facility du Huck Institute et l’Histopathology Core Facility du Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, pour leur soutien technique en temps opportun. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Institute for Cancer Research (KSP), du Penn State College of Agricultural Sciences, du Penn State Cancer Institute, du projet USDA-NIFA 4771, numéro d’acquisition 00000005 à K.S.P. et R.F.P.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| a-Sélectionnez les cellules compétentes ; | Bioline | BIO-85027 | |
| Chlorure d’ammonium (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicilline | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Albumine sérique bovine (BSA), fraction V&mdash ; Bioproduits Gemini à faible teneur en endotoxines | Cat# 700-102P | ||
| Ciprofloxacine HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, glycémie élevée, sans glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, sel disodique (EDTA-2Na), dihydraté, biologie moléculaire Grade | Calbiochem | Cat# 324503 Sérum | |
| bovin fœtal - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrine, bovin | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Solution d’insuline humaine | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100× ;) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB Bouillon, Lennox | NEOGEN | Cat # : 7290A | |
| LB Bouillon avec gélose (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Souris anti-souris CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Interleukine-3 de souris (IL-3) | Bio-produits Gemini | Cat# 300-324P | |
| Interleukine-6 de souris (IL-6) | Bio-produits Gemini | Cat# 300-327P | |
| Facteur de cellules souches de souris (SCF) | Bio-produits Gemini | Cat# 300-348P | |
| Solution de pénicilline-streptomycine, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Cellules Phenix-Eco (pECO) | ATCC | CRL-3214 | |
| Bicarbonate de potassium (KHCO3), Granulaire | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-souris CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend ; | Cat # 105812 | |
| Rat anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murin Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Fragment de fibronectine humaine recombinante | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Réactif | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Réactif | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Solution de bleu de trypan, 0,4 % | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge | de phénolGibco | Cat# 25200-056 | |
| &beta ;-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays ; | |||
| EasySep Kit d’isolement de cellules progénitrices hématopoïétiques de souris ; | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité ; | Thermo Fisher ; | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat# :12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory Strain | # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice& nbsp ; | Jackson Laboratory | Souche # 002014 | |
| souris CD45.2 C57BL6/J. | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator ; | Version 25.2.3 | ||
| Cytomètre en flux BD accuri C6 | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys logiciel ; | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 ; | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS ; | Drew Scientific | ||
| 7300 Système de PCR en temps réel | Applied Biosystems | ||
| Syngene G :BOX Chemi XR5 Chimiluminescence Imagerie par fluorescence | G :Box Chemi |
Références
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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Réimpressions et autorisations
