La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.
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Article de méthode
Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) en cellules bêta sécrétrices d’insuline fournit du matériel pour étudier la fonction des cellules bêta et le traitement du diabète. Cependant, il reste des défis à relever pour obtenir des cellules bêta dérivées de cellules souches qui imitent adéquatement les cellules bêta humaines natives. S’appuyant sur des études antérieures, des cellules d’îlots pancréatiques dérivées de CSPh ont été générées pour créer un protocole avec des résultats de différenciation et une cohérence améliorés. Le protocole décrit ici utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pendant les stades 1 à 4, suivi d’un protocole modifié à partir d’un article précédemment publié en 2014 (appelé « protocole R » ci-après) au cours des stades 5 à 7. Des procédures détaillées pour l’utilisation du kit de progéniteurs pancréatiques et de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre pour générer des grappes de progéniteurs pancréatiques, le protocole R pour la différenciation endocrinienne dans un format de suspension statique à 96 puits, ainsi que la caractérisation in vitro et l’évaluation fonctionnelle des îlots dérivés des CSPh, sont inclus. Le protocole complet prend 1 semaine pour l’expansion initiale des CSPh, suivie de ~5 semaines pour obtenir des îlots de CSPh productrices d’insuline. Le personnel possédant des techniques de culture de cellules souches de base et une formation en essais biologiques peut reproduire ce protocole.
Introduction
Les cellules bêta pancréatiques sécrètent de l’insuline en réponse à l’augmentation de la glycémie. Les patients qui ne produisent pas suffisamment d’insuline en raison de la destruction auto-immune des cellules bêta dans le diabète de type 1 (DT1)1, ou en raison d’un dysfonctionnement des cellules bêta dans le diabète de type 2 (DT2)2, sont généralement traités par l’administration d’insuline exogène. Malgré cette thérapie qui sauve des vies, elle ne peut pas égaler avec précision le contrôle exquis de la glycémie obtenu par la sécrétion dynamique d’insuline à partir de cellules bêta authentiques. En tant que tels, les ....
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Protocole
Ce protocole est basé sur le travail avec des lignées hPSC, y compris H1, HUES4 PDXeG et Mel1 INSGFP/W, dans des conditions sans feeder. Une procédure étape par étape est détaillée dans cette section, avec des données à l’appui de la différenciation de Mel1 INSGFP/W dans la section des résultats représentatifs. Nous recommandons qu’une optimisation supplémentaire soit nécessaire lorsque vous travaillez avec d’autres lignes hPSC qui ne sont pas indiquées ici. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et solutions utilisés dans ce protocole.
1. Préparation de....
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Résultats
Nous avons développé une stratégie hybride pour différencier les cellules souches en îlots hPSC sécréteurs d’insuline en sept étapes, qui utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pour les quatre premières étapes de la culture planaire, suivi d’un protocole modifié basé sur une méthode6 précédemment rapportée dans une culture en suspension statique pour les trois dernières étapes (Figure 1). Avec ce protocole, il est essentiel d’assurer une culture proche de la con.......
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Discussion
Cet article décrit un protocole hybride en sept étapes qui permet de générer des îlots hPSC capables de sécréter de l’insuline lors d’une provocation au glucose dans les 40 jours suivant la culture in vitro. Parmi ces multiples étapes, l’induction efficace de l’endoderme définitif est considérée comme un point de départ important pour les résultats finaux de différenciation18,27,28. Selon le protocole du fabricant, une .......
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Déclarations de divulgation
Timothy J. Kieffer était un employé de ViaCyte lors de la préparation de ce manuscrit. Les autres auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Nous tenons à remercier STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, FRDJ et les Instituts de recherche en santé du Canada pour leur soutien. Jia Zhao et Shenghui Liang sont les récipiendaires de la bourse Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam est récipiendaire de la bourse Mitacs Accélération. Diepiriye G. Iworima est récipiendaire de la bourse d’études supérieures du Canada Alexander-Graham-Bell et du Prix commémoratif de l’École Polytechnique 1989 de la FCFDU. Nous remercions sincèrement le Dr Edouard G. Stanley de l’IRMC et de l’Université Monash d’avoir partagé la ligne Mel1 INS GFP/W et l’Al....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma | T6397 | Hormone thyroïdienne |
| 4 % PFA solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Doit être manipulé dans une hotte |
| 96-Well, Ultralow Accessoire, fond plat | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Fond plat ; pour la culture en suspension statique dans les trois dernières étapes |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Réactif de dissociation pour cellules de stade 4 |
| Aggrewell400 plaques | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µ ; plaques à micropuits de diamètre m |
| Plaques Aggrewell800 | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µ ; m de diamètre plaques de micropuits |
| Alexa Fluor 488 Chèvre anti-Humain FOXA2 (IgG de chèvre) | R& D Systems | IC2400G | 1:100 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de l’étape 1 |
| Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control | R& D Systems | IC108G | 1:100 en cytométrie en flux |
| Alexa Fluor 488 Souris anti-SST humaine (souris IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7 |
| Alexa Fluor 488 Souris IgG2B Contrôle des isotypes | R& D Systems | IC0041G | 1:500 en cytométrie en flux |
| Alexa Fluor 647 Souris anti-peptide C humain (souris IgG1&kappa ;) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2 000 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7 |
| Alexa Fluor 647 Souris anti-INS humain (souris IgG1&kappa ;) | BD Sciences | 565689 | 1:2 000 en cytométrie en flux |
| Alexa Fluor 647 Souris anti-Human NKX6.1 (souris IgG1&kappa ;) | BD Sciences | 563338 | 1:33 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 4 |
| Alexa Fluor 647 Souris anti-Human SOX17 (souris IgG1&kappa ;) | BD Sciences | 562594 | 1:50 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 1 |
| Alexa Fluor 647 Souris IgG1&kappa ; Contrôle des isotypes | BD Sciences | 557714 | 1:50 en cytométrie en flux |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | Inhibiteur de signalisation TGF-bêta |
| Solution de rinçage anti-adhérence ; | STEMCELL Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
| Chambre d’essai | Cellvis | D35-10-1-N | Pour le GSIS statique et l’imagerie confocale |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | Pour la procédure d’immunocoloration |
| Anticorps CK19 | DAKO | M0888 | 1:50 en montage entier immunofluorescence |
| D-glucose | Sigma | G8769 | Supplément moyen |
| DAPI | Sigma | D9542 | Pour contre-coloration nucléaire |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Solution de dilution |
| Âne anti-chèvre Alexa Fluor 555 | Life technologies | A21432 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| Âne anti-chèvre Alexa Fluor 647 | Technologies de vie | A21447 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| Donkey anti-souris Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31570 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| âne anti-souris Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31571 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| âne anti-lapin Alexa Fluor 555 | Life technologies | A31572 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| Âne anti-lapin Alexa Fluor 647 | Life technologies | A31573 | 1:500 en porte-mouton |
| Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 en monture entière immunofluorescence |
| DPBS | Sigma | D8537 | Sans Ca2+ et Mg2+ |
| ELISA, insuline, humain | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | Pour la mesure de l’insuline humaine |
| Sans acides gras BSA | Proliant | 68700 | Supplément moyen |
| Kit de solutions de fixation et de perméabilisation | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm et 10x Perm/Wash solutions incluses |
| Réactif de dissociation cellulaire douce | STEMCELL Technologies | 7174 | Pour le passage des hPSC en agglomération pendant la culture d’entretien |
| Anticorps anti-glucagon | Sigma | G2654 | 1:400 en monture entière |
| immunofluorescence GLUT1 | anticorps Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 en monture entière immunofluorescence |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | Supplément de L-glutamine |
| Glycérol | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | Pour l’éclaircissement et le montage des tissus |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Inhibiteur de l’encoche |
| Héparine | Sigma | H3149 | Supplément moyen |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insuline-Transferrine-Sélénium-Éthanolamine ; supplément moyen |
| LDN193189 ; | STEMCELL Technologies | 72147 | Antagoniste BMP |
| Anticorps MAFA | Abcam | ab26405 | 1:200 en montage entier immunofluorescence |
| Matrigel, qualifié hESC | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Matrice extracellulaire pour revêtement de surface du vaisseau |
| MCDB131 medium | Life technologies | 10372019 | Base |
| medium mTeSR1 Kit complet | STEMCELL Technologies | 85850 | milieu de cellules souches et supplément 5x inclus |
| N-Cys (N-acétyl cystéine) | Sigma | A9165 | Antioxydant |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Supplément moyen |
| NEUROD1 anticorps | R& D Systems | AF2746 | 1:20 en immunofluorescence à monture entière |
| Anticorps NKX6.1 | DSHB | F55A12-c | 1:50 en immunofluorescence à monture entière |
| Anticorps polypeptide pancréatique | R& D Systems | AF6297 | 1:200 en immunofluorescence |
| totale PBS | Sigma | D8662 | avec Ca2+ et Mg2+ |
| PDX1 | anticorps Abcam | ab47267 | 1:200 en immunofluorescence |
| totale PE Souris anti-Human GCG (souris IgG1&kappa ;) | BD Sciences | 565860 | 1:2 000 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 7 |
| PE Souris anti-humaine NKX6.1 (souris IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 en cytométrie en flux |
| PE Souris anti-Human PDX1 (souris IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 en cytométrie en flux ; utilisé pour le dosage des cellules de stade 4 |
| PE Souris IgG1&kappa ; Contrôle des isotypes | BD Sciences | 554680 | 1:2 000 en cytométrie |
| en flux PE Souris-Chromogranine humaine A (CHGA, souris IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 en cytométrie en flux |
| R428 ; | Cayman Chemicals | 21523 | AXL Inhibiteur de la tyrosine kinase |
| Acide rétinoïde, all-trans | Sigma | R2625 | sensible à la lumière |
| , 10x | Sigma | 20-188 | Pour l’extraction hormonale |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | Inhibiteur de SHH |
| SLC18A1 anticorps | Sigma | HPA063797 | 1:200 en immunofluorescence à monture entière |
| Anticorps Somatostatine | Sigma | HPA019472 | 1:100 en immunofluorescence |
| totale STEMdiff Kit de progéniteur pancréatique | STEMCELL Technologies | 05120 | Milieux basaux et suppléments inclus |
| Anticorps anti-synaptophysine | Novus | NB120-16659 | 1:25 en immunofluorescence totale |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Pour la perméabilisation |
| Trolox ; | Sigma Millipore | 648471 | Analogue de la vitamine E |
| TrypLE Enzyme Express | Life technologies | 12604-021 | réactif d’enzyme de dissociation cellulaire pour hPSCs de passage de cellule unique |
| Trypsine1/2/3 anticorps | R& D Systems | AF3586 | 1:25 en monture entière immunofluorescence |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | Inhibiteur de ROCK |
| Sulfate de zinc | Sigma | Z0251 | Supplément de milieu |
Références
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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Réimpressions et autorisations
