L’établissement d’un modèle de guérison par voie d’extraction molaire mandibulaire murine

Résumé

Ce protocole montre étape par étape les détails de la façon d’extraire la première molaire mandibulaire chez la souris. Il fournit une méthode alternative pour les chercheurs qui se concentrent sur la guérison et la régénération des os de la mâchoire.

Résumé

Cette étude introduit le développement d’un modèle d’extraction molaire dans la mandibule murine afin de fournir un modèle pratique pour étudier la régénération osseuse alvéolaire et l’ossification intramembraneuse. Des souris C57/J6 ont été utilisées pour extraire la première molaire mandibulaire afin d’établir ce modèle. Ils ont été euthanasiés et les mandibules bilatérales récoltées, respectivement 1 semaine et 4 semaines après la chirurgie. Une récolte stéréoscopique en série, une évaluation histologique et une coloration par immunofluorescence ultérieures ont été effectuées pour démontrer la réussite de la chirurgie. Immédiatement après la chirurgie, les images stéréoscopiques affichaient une douille d’extraction vide. L’hématoxyline et l’éosine (H & E) à 1 semaine et la coloration de Masson à 4 semaines après la chirurgie ont montré que la zone de la racine d’origine était partiellement et entièrement remplie de trabécules osseuses, respectivement. La coloration par immunofluorescence a montré que, par rapport à l’homéostasie, l’expression de Sp7 augmentait 1 semaine après la chirurgie, suggérant une ostéogenèse vigoureuse de la fosse alvéolaire. Tous ces résultats ont démontré un modèle pratique de guérison par extraction dentaire murale. Des études à venir révélant les mécanismes de cicatrisation des défauts de la mâchoire ou de la cicatrisation des alvéoles pourraient adopter cette méthode.

Introduction

La cicatrisation des alvéoles après extraction dentaire est un scénario clinique courant, qui peut entraîner des complications inconvenantes telles qu’une hémorragie des alvéoles, une cavité sèche ou même une ostéomyélite de la mâchoire sous cicatrisation indésirable ^1,2,3. Ces comorbidités peuvent nuire à la qualité de vie des patients et, pire encore, remettre en question de manière vitale la rééducation prothétique en raison d’une perte osseuse massive⁴. Bien que les étapes de cicatrisation des alvéoles aient été élucidées, elles sont insuffisantes pour diriger les soins cliniques après la chirurgie d’extraction dentaire lorsqu’ils rencontrent divers défis de pronostic⁴.

De multiples études basées sur des modèles animaux ont été menées pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents du processus de guérison des alvéoles et éviter les situations ci-dessus. Sp7 est un régulateur principal dans la différenciation des ostéoblastes, jouant un rôle essentiel dans le développement du squelette, l’hémostase osseuse et la régénération osseuse ^5,6. Les modèles rationnels de guérison des alvéoles pourraient afficher la redondance de Sp7 post-traumatique dans la régénération osseuse. De plus, distinct de la cicatrisation des fractures osseuses longues, un seul processus ostéogénique, l’ossification intramembraneuse, implique le processus de cicatrisation de la cavité^{d’extraction 7}. Cela rend le modèle d’extraction dentaire animale optimal pour étudier les thérapies implantaires, car l’ostéointégration implantaire obéit à la même règle ostéogénique⁸.

Pendant des décennies, le modèle d’extraction dentaire a été pratiqué chez les rats, les lapins et^les chiens, car ces espèces ont de grandes dents qui sont pratiques à opérer sur 9,10,11. Cependant, compte tenu de la demande florissante de modification génétique et en tant que contexte génétique plus adaptatif aux humains, les souris sont de plus en plus utilisées pour établir un modèle d’extraction dentaire. Dès lors, les chercheurs pourraient démêler le rôle d’une population cellulaire spécifique dans le processus de guérison de l’alvéole en utilisant des souris modifiées par le génome au lieu d’observer les phénotypes seulement¹². Parmi les modèles d’alvéoles d’extraction dentaire murine, les études précédentes ont démontré l’établissement et le processus de guérison des douilles d’extraction des dents maxillaires murines et des incisives^13,14,15,16. Cependant, le schéma de guérison du pronostic et les points temporels détectives et observatifs peuvent différer d’un protocole à l’autre. Cela fait appel à un critère universel pour les chercheurs d’établir un modèle de guérison de l’alvéole murine.

Cette étude visait à constituer un modèle pratique de guérison des alvéoles murines pour les problèmes ci-dessus. Les molaires de la mandibule chez la souris ont des traits morphologiques distinctifs par rapport aux molaires maxillaires et aux incisives, apportant des avantages et des inconvénients uniques. Comme les modèles axés sur la mandibule murine sont actuellement basés sur le vide, ce protocole a tenté de fournir une méthode accomplie pour extraire la première molaire mandibulaire chez la souris. Nous espérons que ce protocole éclairera les chercheurs fondamentaux avec de nouvelles idées pour découvrir les mécanismes sous-jacents de la guérison des alvéoles et indiquer les soins cliniques.

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Des souris adultes C57BL/6, obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux), ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation préchirurgicale

1. Préparation des instruments
   1. Préparer diverses aiguilles de seringues jetables (26G, 25G, 23G; voir le tableau des matières) à utiliser comme ascenseurs. Infléchir la tête de l’aiguille d’environ 20°-40°, comme illustré à la figure 1.
   2. Préparez des pinces ophtalmiques dentées comme forceps. Assurez-vous qu’il correspond à la taille des molaires des souris et qu’il peut saisir les molaires fermement. La taille idéale de la pince à épiler est illustrée à la figure 1A, B3.
   3. Procurez-vous un élastique (qui peut être arraché d’un gant médical en latex) à utiliser comme ouvre-bouche, un panneau de mousse ou un tableau de liège comme plate-forme chirurgicale, une lampe frontale pour éclairer la zone chirurgicale et un coussin chauffant pour la reprise postopératoire. Déchirez une boule de coton sèche en petits morceaux et appliquez-la sur le site chirurgical si un saignement se produit pendant la procédure.
2. Préparation de l’anesthésie
   1. La souris peut être anesthésiée par n’importe quel protocole anesthésique approprié qui permet d’obtenir une anesthésie générale confirmée par la méthode du « pincement des orteils ». Après l’anesthésie, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris.
      REMARQUE : Le protocole anesthésique général préféré pourrait être : induction et entretien avec de la xylazine (10 mg/kg) et de la kétamine (100 mg/kg) par voie intrapéritonéale (IP);
      Pour cette étude, l’isoflurane et le pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg, IP) ont été utilisés pour l’induction et l’entretien de l’anesthésie avec des doses supplémentaires au besoin.
3. Préparation de désinfection et de stérilisation
   1. Désinfectez la plate-forme d’opération et les frais généraux à l’air libre avec un pulvérisateur d’éthanol à 75%. Avant chaque intervention chez la souris, l’utilisation d’un nouvel ensemble d’aiguilles jetables est recommandée.
      REMARQUE: Les pinces à épiler dentées sont réutilisables et peuvent être stérilisées en utilisant n’importe quelle méthode préférée telle que la stérilisation à la vapeur.

2. Processus chirurgical

1. Fixation de la souris et de sa mandibule
   1. Attachez la souris à une plate-forme chirurgicale en décubitus dorsal à l’aide de ruban adhésif. Épinglez deux aiguilles de 26 G alignées avec le plan orbital de l’oreille et deux autres aiguilles de 26 G à l’aise sous la mandibule.
   2. Appliquez l’élastique autour des aiguilles et croisez les incisives pour maintenir la bouche ouverte. Retirez légèrement la languette et fixez-la sous l’élastique opposé au côté chirurgical, pour éviter qu’elle n’obstrue le champ de vision (figure 1C).
2. Éliminer la résistance distale
   1. Tenez la molaire avec une pince à épiler mésialement, enfoncez une aiguille de 23 G dans l’os alvéolaire buccal de la racine distale et faites un intervalle.
      REMARQUE: Cette étape doit être prise avec une grande prudence, car une aiguille trop profonde enclenchera probablement la racine.
   2. Ensuite, passez à une aiguille de 25 G pour continuer à élargir l’intervalle et progressez délicatement vers la zone périapicale tout en tournant lentement l’aiguille vers l’avant et lingualement (avec la position anatomique de la souris) pour presser la racine hors de la fosse alvéolaire.
3. Élimination de la résistance mésiale
   1. Lorsqu’il y a suffisamment d’espace, utilisez une aiguille de 23 G à insérer dans la fourche radiculaire et soulevez la molaire occlusalement. Après avoir tenu fermement la molaire, prenez une autre aiguille de 23 G et forcez-la dans la membrane parodontale mésiale linguale pour créer un intervalle.
   2. Ensuite, remplacez par une aiguille de 25 G et tournez lentement vers l’avant et buccally. Si certains obstacles sous-jacents entravent la luxation de la molaire, utilisez une aiguille de 26 G pour pénétrer dans l’apex de la racine et répétez les opérations.
4. Extraction finale
   1. Extrayez la dent et, pendant l’extraction, assurez-vous que la couronne s’élève au-dessus du plan occlusal et que deux racines intactes sont clairement visibles.
      REMARQUE: La luxation (luxation) de la dent est considérée comme le moment le plus douloureux et le plus pénible de la procédure. Avant de disloquer la dent, la profondeur anesthésique doit être réévaluée à l’aide du test de pincement des orteils et, par conséquent, une dose modérée d’un agent anesthésique doit être administrée si nécessaire.
5. Soins postopératoires
   1. Après avoir extrait la dent, appliquez du coton sec pour arrêter le saignement, repositionnez la langue, administrez du carprofène (5 mg / kg) par voie sous-cutanée et placez la souris sur un coussin chauffant à température constante jusqu’à la récupération de l’anesthésie.

3. Imagerie de la mandibule de la souris et de la cavité d’extraction

1. Préparation des échantillons
   1. Euthanasier la souris par luxation cervicale. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper les muscles squelettiques attachés à la mandibule et à l’arc zygomatique. Couper de la gorge le long du bord inférieur de la mandibule jusqu’à la branche ascendante, puis à l’arrière du condyle, puis tirer la mandibule vers le bas et couper le long de la ligne médiane de l’incisive inférieure. De cette façon, les deux mandibules séparées sont récoltées.
   2. Effectuer la fixation, la déminéralisation et la déshydratation en suivant la procédure standard¹⁷. Lors de l’incorporation¹⁷, assurez-vous que le plan occlusal est parallèle au bord de la cassette (voir le tableau des matériaux). Fixez la mandibule sur le fond de la cassette, avec son bord inférieur armé (Figure 2).
      REMARQUE: Ce protocole offre le plan sagittal de la zone de la mandibule.
2. Fixation de l’échantillon sur le microtome
   1. Réguler la pince de l’échantillon dans le microtome pour faire saillie du condyle et du côté de la couronne de 5°-20° de plus, afin d’obtenir une image intégrée de la pulpe du collet concomitante à la pulpe racinaire (Figure 2).
3. Préparation des sections
   NOTE: Le condyle est toujours la première structure anatomique à être coupée. Lorsqu’elle disparaît, la zone molaire peut alors être coupée en plusieurs tranches.
   1. Déplacez la plage de microtomes à 5 μm, collectez toutes les huit tranches et recherchez la dentine dans la dernière tranche. Si la dentine couronne apparaît pour la première fois sans dentine apicale radiculaire, ajustez la pince de l’échantillon pour faire saillir la zone racinaire, et vice versa.
4. Collecte des sections
   NOTE: L’angle de coupe est approprié jusqu’à ce que la dentine soit également atteinte dans la couronne et la zone apicale.
   1. Coupez dans cette direction et observez les tranches au microscope jusqu’à ce que la pulpe dentaire apparaisse à la fois dans la couronne et les racines. Prélever les coupes lorsqu’un contour obscur de molaires apparaît à la surface de l’échantillon de paraffine¹⁷.

Résultats

Pour élucider l’utilisation pratique de cette méthode, la première molaire mandibulaire droite de deux souris C57BL/6 saines (âgées de 3 mois, toutes deux femelles) a été extraite et suivie pendant 1 semaine et 4 semaines, respectivement. Les mandibules gauches intactes ont été utilisées comme témoins sains. La figure 1A montre les caractéristiques spécifiques de l’appareil chirurgical, y compris des aiguilles de 26-23 G et une pince à épiler ophtalmique dentée. L’aiguille de 26 G est enlevé...

Discussion

Le modèle de guérison de l’alvéole murine est une méthode importante pour démêler les mécanismes sous-jacents de la guérison et de la régénération osseuses, résolvant finalement les défis cliniques. Les études existantes ont démontré la possibilité du modèle d’extraction incisive et du modèle d’extraction molaire maxillaire, alors que les études n’ont pas utilisé le modèle de première molaire mandibulaire^13,17,18. Cependant, les...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
23/25/26 G aiguille	Chengdu Xinjin Shifeng Appareil médical & Instruments Co. Ltd.	SB1-074(IV)
C57/B6J  ;	Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, Chine	DAPI C57/B6J
;	Beyotime  ;	Cat#C1005
Cassettes d’enrobage	CITOTEST Scientific	80106-1100-16
Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine	Biosharp	BL700B
Isoflurane	RWD Life Science Co.,Ltd	R510-22-10
Masson' s Kit de teinture trichrome	Solarbio	G1340
Microtome  ;	Leica	RM2235
Pentobarbital Sodium	Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd	2018042001
Lapin polyclonal  ;	anti-Sp7  ;	Abcam Cat# ab22552
Pince à épiler	Chengdu Xinjin Shifeng Appareil médical & Instruments Co. Ltd.	Réf. SB2-115