AMEBaS : Extraction automatique de la ligne médiane et soustraction de l’arrière-plan des time-lapses de fluorescence ratiométrique de cellules uniques polarisées

Summary

Les méthodes actuelles d’analyse de la dynamique intracellulaire des cellules uniques polarisées sont souvent manuelles et manquent de standardisation. Ce manuscrit présente un nouveau pipeline d’analyse d’images pour automatiser l’extraction médiane de cellules polarisées uniques et quantifier le comportement spatio-temporel à partir de timelapses dans une interface en ligne conviviale.

Abstract

La polarité cellulaire est un phénomène macroscopique établi par un ensemble de molécules et de structures concentrées dans l’espace qui aboutissent à l’émergence de domaines spécialisés au niveau subcellulaire. Il est associé au développement de structures morphologiques asymétriques qui sous-tendent des fonctions biologiques clés telles que la division, la croissance et la migration cellulaires. De plus, la perturbation de la polarité cellulaire a été liée à des troubles tissulaires tels que le cancer et la dysplasie gastrique.

Les méthodes actuelles d’évaluation de la dynamique spatio-temporelle des rapporteurs fluorescents dans les cellules polarisées individuelles impliquent souvent des étapes manuelles pour tracer une ligne médiane le long de l’axe principal des cellules, ce qui prend du temps et est sujet à de forts biais. De plus, bien que l’analyse ratiométrique puisse corriger la distribution inégale des molécules rapporteures à l’aide de deux canaux de fluorescence, les techniques de soustraction de fond sont souvent arbitraires et manquent de support statistique.

Ce manuscrit présente un nouveau pipeline de calcul pour automatiser et quantifier le comportement spatio-temporel de cellules individuelles à l’aide d’un modèle de polarité cellulaire : la croissance du tube pollinique et des poils racinaires et la dynamique des ions cytosoliques. Un algorithme en trois étapes a été développé pour traiter des images ratiométriques et extraire une représentation quantitative de la dynamique et de la croissance intracellulaires. La première étape segmente la cellule à partir de l’arrière-plan, produisant un masque binaire grâce à une technique de seuillage dans l’espace d’intensité des pixels. La deuxième étape trace un chemin à travers la ligne médiane de la cellule grâce à une opération de squelettisation. Enfin, la troisième étape fournit les données traitées sous forme de timelapse ratiométrique et produit un kymographe ratiométrique (c’est-à-dire un profil spatial 1D dans le temps). Des données provenant d’images ratiométriques acquises avec des rapporteurs fluorescents génétiquement codés à partir de tubes polliniques en croissance ont été utilisées pour comparer la méthode. Ce pipeline permet une représentation plus rapide, moins biaisée et plus précise de la dynamique spatio-temporelle le long de la ligne médiane des cellules polarisées, faisant ainsi progresser la boîte à outils quantitative disponible pour étudier la polarité cellulaire. Le code source Python d’AMEBaS est disponible à l’adresse suivante : https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

La polarité cellulaire est un processus biologique fondamental dans lequel l’action concertée d’un ensemble de molécules et de structures concentrées dans l’espace aboutit à l’établissement de domaines morphologiques subcellulaires spécialisés¹. La division, la croissance et la migration cellulaires dépendent de ces sites de polarité, tandis que sa perte a été associée au cancer dans les troubles liés aux tissus épithéliaux².

Les cellules à croissance apicale sont un exemple dramatique de polarité, où le site de polarité à l’extrémité se réoriente généralement vers des signaux extracellulaires....

Protocol

1. Protocole de bloc-notes interactif

Le bloc-notes Jupyter peut être utilisé directement sur le Web à l’aide de Google Colab à https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, où les instructions ci-dessous ont été basées. Le notebook Jupyter est également disponible à l’adresse https://github.com/badain/amebas, où il peut être téléchargé et configuré pour s’exécuter localement dans Jupyter (Anaconda peut fournir un processus d’installation simple et multiplateforme). Des données d’essai complètes peuvent être trouvées sur Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), contenant des donn....

Results

Le pipeline AMEBaS automatise l’extraction de la dynamique médiane des cellules uniques polarisées à partir d’empilements d’images de microscopie à fluorescence, ce qui le rend moins chronophage et moins sujet aux erreurs humaines. La méthode quantifie ces laps de temps en générant des kymographes et des empilements d’images ratiométriques (Figure 1) dans des cellules individuelles en croissance. Il peut être ajusté pour travailler sur la migration de cellules individuelles, mais d’autres ex.......

Discussion

La nouvelle méthode présentée ici est un outil puissant pour rationaliser et automatiser l’analyse des piles d’images de microscopie à fluorescence de cellules polarisées. Les méthodes actuelles décrites dans la littérature, telles que les plugins ImageJ Kymograph, nécessitent un traçage manuel de la ligne médiane de la cellule polarisée d’intérêt, une tâche qui prend non seulement du temps, mais qui est également sujette à des erreurs humaines. Étant donné que la définition de la ligne médiane dans ce pipeline est étayé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb