Dissection de tissu pancréatique pour isoler des cellules uniques viables

Résumé

Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.

Résumé

Le pancréas comprend deux systèmes principaux : le système endocrinien, qui produit et sécrète des hormones, et le système exocrinien, qui représente environ 90 % du pancréas et comprend des cellules qui produisent et sécrètent des enzymes digestives. Les enzymes digestives sont produites dans les cellules acineuses pancréatiques, stockées dans des vésicules appelées zymogènes, et sont ensuite libérées dans le duodénum via le canal pancréatique pour initier des processus métaboliques. Les enzymes produites par les cellules acineuses peuvent tuer les cellules ou dégrader l’ARN acellulaire. De plus, les cellules acineuses sont fragiles et les protocoles de dissociation courants entraînent un grand nombre de cellules mortes et de protéases et de RNases acellulaires. Par conséquent, l’un des plus grands défis de la digestion des tissus pancréatiques est de récupérer des cellules intactes et viables, en particulier les cellules acineuses. Le protocole présenté dans cet article montre une méthode en deux étapes que nous avons développée pour répondre à ce besoin. Le protocole peut être utilisé pour digérer un pancréas normal, un pancréas qui comprend des lésions précancéreuses ou des tumeurs pancréatiques qui comprennent un grand nombre de cellules stromales et immunitaires.

Introduction

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des types de cancer les plus agressifs¹. Les preuves cliniques soutiennent l’idée que la PDAC se développe à partir de cellules du système exocrinien, y compris les cellules acineuses, sur de nombreuses années, sous l’effet de mutations dans le proto-oncogène² KRAS.

Les tumeurs pancréatiques comprennent de nombreux types de cellules différentes, et il a été démontré que les cellules malignes ne représentent que 20 à 50 % de la masse tumorale³. Différents types de cellules interagissent avec les cellules épithéliales, soutiennent leur transformation et améliorent la formation et la croissance des tumeurs. Les événements précoces provoquent une métaplasie acineuse, qui donne lieu à des lésions microscopiques appelées néoplasie intraépithéliale pancréatique (PanINs), qui peuvent dans certains cas évoluer en PDAC⁴.

Il est essentiel d’étudier ces interactions et de cibler les signaux pivots. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est une méthode puissante qui révèle l’expression des gènes à une résolution unicellulaire, permettant ainsi de suivre les changements subis par les cellules épithéliales, permettant ainsi d’explorer le développement du cancer du pancréas.

La dissection tissulaire et la digestion de cellules individuelles constituent la première étape d’une expérience de séquençage de l’ARNsc. Plusieurs facteurs rendent la digestion des tissus pancréatiques particulièrement difficile : i) les cellules acineuses représentent plus de 90 % du pancréas et les cellules acineuses contiennent de grandes quantités d’enzymes digestives, y compris des protéases et des RNases qui réduisent la qualité des banques à base d’ARN ; (ii) les cellules acineuses sont très sensibles et peuvent se lyser si des protocoles standard sont utilisés ; (iii) les cellules acineuses expriment un petit nombre de gènes à des niveaux très élevés. Par conséquent, si ces cellules sont lysées au cours de l’expérience, cela peut contaminer le profil d’expression génique observé d’autres cellules ; (iv) le tissu pancréatique récupéré des tumeurs est desmoplastique, ce qui le rend difficile à disséquer sans endommager les cellules. Ainsi, même s’il est nécessaire de maintenir une viabilité élevée de tous les types de cellules, le grand nombre et la sensibilité des cellules acineuses ajoutent une complexité supplémentaire. Ces facteurs imposent des difficultés à obtenir une suspension unicellulaire viable à plus de 80 % et sans amas, comme c’est le cas pour les expériences de scRNA-seq.

Ici, nous avons développé un protocole utilisant la trypsine C et la collagénase P, ainsi qu’une surveillance fréquente des tissus. Cela favorise la dissociation en cellules uniques tout en conservant une viabilité élevée pour soutenir le succès des expériences de scRNA-seq ^5,6.

Protocole

Le comité mixte d’éthique (Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux) de l’Université hébraïque (Jérusalem, Israël) et du Centre médical Hadassah (Jérusalem, Israël) a approuvé le protocole d’étude pour le bien-être animal (MD-18-15417-5 « Dynamique tissulaire dans le cancer du pancréas chez la souris »), et le protocole présenté ici était conforme à toutes les règles éthiques pertinentes pour l’expérimentation et la recherche sur les animaux. L’Université hébraïque est un institut accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire à l’échelle internationale.

NOTE : Les souches de souris #007908, #019378 et #008179 ont été obtenues du laboratoire de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D ; Ptf1a-Cre^ER ; Les souris Rosa26^LSL-tdTomato) ont été créées en croisant les souches ci-dessus. Des souris des deux sexes, âgées de 6 semaines à 15 mois, ont été utilisées pour l’étude. Le tamoxifène a été préparé en dissolvant la poudre dans de l’huile de maïs. Des souris adultes (âgées de 6 à 8 semaines, femelles et mâles) ont reçu une injection sous-cutanée de tamoxifène aux jours 0 et 2 à une dose de 400 mg/kg et ont été examinées deux fois par semaine après l’injection. Il n’a pas été possible de mesurer les tumeurs car elles étaient situées à l’intérieur ; Par conséquent, l’euthanasie était pratiquée si des signes cliniques anormaux étaient observés selon le protocole éthique. Les souris ont été euthanasiées à différents moments après l’induction du tamoxifène, en utilisant de l’isoflurane et une luxation cervicale.

1. Dissection pancréatique

REMARQUE : Pour un rendement optimal lors de l’extraction et pour assurer une bonne viabilité cellulaire, une dissection rapide est essentielle. Pour raccourcir le temps nécessaire à l’isolement du pancréas, tous les instruments et équipements doivent être prêts sur la glace avant d’euthanasier la souris.

1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO₂ et vérifier à l’aide d’une luxation cervicale. À partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées avec des instruments de dissection stériles.
2. Fixez la souris et vaporisez l’abdomen avec 70% d’éthanol. Faites une incision en forme de V de 2,5 cm dans la région génitale avec des ciseaux et une pince et remontez pour ouvrir complètement la cavité abdominale.
3. Localisez l’estomac sur le côté gauche de la souris. Localisez le pancréas, qui se trouve près de la rate. Séparez le pancréas de l’estomac et du duodénum à l’aide de deux pinces (sans déchirer). Continuez et séparez le pancréas de l’intestin grêle, du jéjunum et de l’iléon.
4. Déplacez le pancréas vers le côté droit de la souris. Séparez les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique avec des pinces pour détacher complètement le pancréas et la rate attachée.
5. Retirez le pancréas et étalez-le pour l’examiner dans une boîte de Pétri sur de la glace.
   REMARQUE : Au cours de cette étape, il faut veiller à retirer uniquement le pancréas et à ne pas enlever le tissu adipeux mésentérique ou d’autres tissus adjacents avec le pancréas, afin d’éviter toute contamination cellulaire.

2. Dissociation enzymatique et mécanique du pancréas

1. Préparez à l’avance les tampons suivants.
   1. Tampon de dissociation 1 : 4 mL de trypsine C + 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir tableau 1) pour chaque échantillon.
   2. Tampon de dissociation 2 : 9 mL de solution saline équilibrée Hanks (HBSS) 1x ; 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) ; 1 mL de collagénase P (10 mg/mL) ; 200 μL d’inhibiteur de la trypsine (10 mg/mL) ; et 200 μL de DNase I (10 mg/mL) (voir le tableau 1).
   3. Tampon de lavage : 50 mL de HBSS 1x ; 2 g de BSA ; 1 mL d’inhibiteur de la trypsine (10 mg/mL) ; et 1 mL de DNase 1 (10 mg/mL).
   4. Solution d’arrêt de l’activité enzymatique : HBSS 1x contenant 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 150 g de DNase I (0,2 mg/mL).
2. Placer le pancréas dans un tube de 50 ml sur de la glace. Rincez le pancréas dans 10% FBS dans HBSS 1x. Le tissu adipeux va flotter et le pancréas va couler. Il s’agit d’un moyen facile de visualiser et d’éliminer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas.
3. Transférez le tissu pancréatique de la souris dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 mL d’HBSS 1x sur glace. Coupez le pancréas en petits morceaux de 1 à 3 mm³ à l’aide de ciseaux Noyes et d’un scalpel (Figure 2A). Dans le cas de plus d’un échantillon, les échantillons doivent être conservés sur de la glace dans 10 % FBS/HBSS 1x.
4. Transférez les tissus dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments cellulaires et les cellules sanguines.
5. Remettre les morceaux en suspension dans le tampon de dissociation 1 contenant 0,02 % de trypsine C-0,05 % EDTA pendant 10 min à 37 °C avec agitation (180 tr/min). Laver immédiatement avec 10 % de milieu Eagle’s modifié (DMEM) de FBS/Dulbecco. Centrifuger pendant 5 min à 350 g à 4 °C.
6. Laver à nouveau en remettant le granulé en suspension dans 10 mL de tampon de lavage et en centrifugeant à 350 x g pendant 5 min à 4 °C avant l’étape de dissociation suivante.
7. Incuber le pancréas dans le tampon de dissociation 2 pendant 15 min à 37 °C avec agitation (180 tr/min).
8. Après 15 min, effectuer une dissociation mécanique en pipetant vigoureusement les fragments pancréatiques de haut en bas dans des pipettes stériles de taille décroissante (pipettes sérologiques de 25, 10 et 5 ml) 10 fois et ramener à 37 °C.
   1. Après 5 minutes supplémentaires, répétez la dissociation mécanique et utilisez la microscopie optique pour surveiller la dissociation en fonction de la quantité de suspension unicellulaire. Habituellement, si à ce stade, moins de 90% de la suspension est constituée de cellules isolées individuelles, un temps d’incubation plus long est nécessaire. Utilisez le bleu trypan pour surveiller la viabilité des cellules.
   2. Poursuivez l’incubation et prélevez des échantillons pour détecter la dissociation toutes les 5 min.
      REMARQUE : La durée totale d’incubation dépend du tissu et peut varier d’un échantillon à l’autre. L’incubation et la dissociation tissulaire doivent se terminer lorsque 90 % des cellules sont séparées en cellules individuelles ou lorsqu’une réduction de la viabilité est détectée.
9. Une fois que le tissu pancréatique est bien dissocié (correspondant à la disparition des fragments pancréatiques et à l’augmentation de la turbidité de la solution) (Figure 2), arrêter la réaction enzymatique en lavant deux fois avec une solution d’arrêt d’activité enzymatique pendant 5 min à 4 °C. À partir de cette étape, maintenez la suspension cellulaire sur la glace.
10. Passez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon de 70 μm et vérifiez la viabilité cellulaire au microscope. Des mailles en nylon de plus petite taille peuvent réduire la viabilité des cellules.
11. Remettre en suspension et laver le granulé avec 5 à 10 ml de solution de lavage tamponnée glacée. Comptez les cellules.
12. Si plusieurs globules rouges sont observés, traitez les cellules avec un tampon de lyse des globules rouges pendant 2 min à température ambiante. Dans les cas où des amas sont observés, l’échantillon doit être traité à nouveau avec de la trypsine, comme décrit à l’étape 2.5. La viabilité est détectée au microscope à l’aide du bleu de trypan et, si la viabilité est inférieure à 80 %, les cellules vivantes doivent être isolées à l’aide du kit d’élimination des cellules mortes à tri magnétique activé (MACS) avec des colonnes MACS MS ( voir le tableau 1).

Résultats

Dans un travail récemment publié⁵, nous avons appliqué le protocole décrit ci-dessus pour explorer les premières étapes du développement de la PDAC à l’aide d’un modèle murin. La souris a été génétiquement modifiée pour inclure les cassettes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷, qui permettent l’expression de KRAS constitutivement actif dans les cellules acineuses après injection de tamoxifène.

Ap...

Discussion

Dans cet article, nous vous présentons un protocole de dissociation du tissu pancréatique. Le protocole est simple, facile à utiliser et fournit un outil pour isoler des cellules uniques viables du tissu pancréatique à différents stades du processus de malignité, y compris les tumeurs solides. Dans des études antérieures, différents types de collagénases ont été utilisés pour digérer le pancréas ^8,9. L’utilisation d’une collagénase très puissante, telle que la co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif ou Ressource
70 µ ; maille en nylon m  ;	Corning	cat##431751
BSA	Sigma Aldrich	cat# A7906
Collagenase P	Roche	cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPI	Sigma Aldrich	cat#MBD0015
Dnase I	Roche	cat# 10104159001
Modèles expérimentaux : Organismes/ Souches
Sérum fœtal bovin Sud-américain	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt Solution	Biological industries	cat#02-018-1A  ;
KRASLSL-G12D souris	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS kit d’élimination des cellules mortes	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A  ;
Ptf1a-CreER mice	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER ; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsine C-EDTA 0.05	%Industries biologiques	cat# 03-053-1A
Trypsine inhibiteur	Roche	cat#T6522