Article de méthode

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

DOI :

10.3791/64874

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19 mai 2023

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1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Dans cet article

Résumé

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La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Résumé

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Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes du système immunitaire. Ils patrouillent l’organisme à la recherche d’agents pathogènes et jouent un rôle unique au sein du système immunitaire en reliant les réponses immunitaires innées et adaptatives. Ces cellules peuvent phagocyter puis présenter des antigènes capturés aux cellules immunitaires effectrices, déclenchant une gamme variée de réponses immunitaires. Cet article démontre une méthode normalisée pour la génération in vitro de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) isolées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de bovins et leur application dans l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin.

Le tri cellulaire magnétique a été utilisé pour isoler les monocytes CD14+ des PBMC, et la supplémentation d’un milieu de culture complet avec de l’interleukine (IL)-4 et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) a été utilisée pour induire la différenciation des monocytes CD14+ en MoDC naïfs. La génération de MoDC immatures a été confirmée par la détection de l’expression des marqueurs de surface cellulaire du complexe majeur d’histocompatibilité II (MHC II), CD86 et CD40. Un vaccin antirabique disponible dans le commerce a été utilisé pour pulser les MoDC immatures, qui ont ensuite été co-cultivés avec des lymphocytes naïfs.

L’analyse par cytométrie en flux des MoDC pulsés d’antigènes et de la co-culture lymphocytaire a révélé la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par l’expression de marqueurs Ki-67, CD25, CD4 et CD8. L’analyse de l’expression de l’ARNm de l’IFN-γ et du Ki-67, en utilisant la PCR quantitative, a montré que les MoDC pouvaient induire l’amorçage spécifique de l’antigène des lymphocytes dans ce système de co-culture in vitro . De plus, la sécrétion d’IFN-γ évaluée à l’aide d’ELISA a montré un titre significativement plus élevé (**p < 0,01) dans la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée par le vaccin antirabique que dans la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsée antigénique. Ces résultats montrent la validité de ce test MoDC in vitro pour mesurer l’immunogénicité du vaccin, ce qui signifie que ce test peut être utilisé pour identifier les candidats vaccins potentiels pour les bovins avant de procéder aux essais in vivo , ainsi que dans les évaluations de l’immunogénicité des vaccins commerciaux.

Introduction

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La vaccination vétérinaire représente un aspect crucial de l’élevage et de la santé animale, car elle contribue à améliorer la sécurité alimentaire et le bien-être animal en conférant une protection contre les maladies qui affectent le secteur de l’élevage à l’échelle mondiale1. Une méthode in vitro efficace pour évaluer l’immunogénicité d’éventuels candidats vaccins contribuerait à accélérer le processus de développement et de production de vaccins. Il est donc nécessaire d’élargir le champ des tests immunitaires avec des méthodologies innovantes basées sur des études in vitro , car cela contribuerait à dévoiler la complexité des processus immunitaires liés à l’immunisation et à l’infection pathogène. À l’heure actuelle, on utilise l’immunisation in vivo des animaux et les études de provocation, qui nécessitent un échantillonnage périodique (p. ex. sang et rate), pour mesurer l’immunogénicité des vaccins et adjuvants candidats. Ces tests sont coûteux, prennent beaucoup de temps et ont des implications éthiques, car dans la plupart des cas, l’euthanasie animale est effectuée à la fin des essais.

Comme alternative aux essais in vivo, les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été utilisées pour évaluer les réponses immunitaires induites par le vaccin in vitro2. Les PBMC sont une population hétérogène de cellules composée de 70 % à 90 % de lymphocytes, de 10 à 20 % de monocytes et d’un nombre limité de cellules dendritiques (DC, 1 % à 2 %)3. Les PBMC hébergent des cellules présentatrices d’antigènes (APC) telles que les cellules B, les monocytes et les DC, qui patrouillent constamment l’organisme à la recherche de signes d’infection ou de lésions tissulaires. Les chimiokines sécrétées localement facilitent le recrutement et l’activation des APC sur ces sites en se liant aux récepteurs de surface cellulaire. Dans le cas des monocytes, les chimiokines dirigent leur destin pour se différencier en DC ou en macrophages4. Dès que les DC rencontrent et capturent un agent pathogène, ils migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, où ils peuvent présenter les antigènes peptidiques pathogènes traités à l’aide de protéines de surface de classe I ou de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T CD8+ ou aux lymphocytes T CD4+, respectivement, déclenchant ainsi une réponse immunitaire 5,6.

Le rôle clé joué par les CD dans l’orchestration d’une réponse immunitaire protectrice contre divers agents pathogènes en fait une cible de recherche intéressante pour comprendre les mécanismes immunitaires intracellulaires, en particulier lors de la conception de vaccins et d’adjuvants contre les agents infectieux7. Étant donné que la fraction de DC pouvant être obtenue à partir des PBMC est plutôt faible (1% -2%), les monocytes ont plutôt été utilisés pour générer des DC in vitro8. Ces DC dérivés de monocytes (MoDC) ont été initialement développés comme stratégie de traitement possible en immunothérapie du cancer9. Plus récemment, les MoDC ont été utilisés pour la recherche sur les vaccins 10,11,12, et les monocytes classiques sont le sous-type prédominant (89%) pour la production de MoDC 13. La production de MoDCs in vitro a déjà été réalisée par l’ajout de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) administré en association avec d’autres cytokines telles que l’interleukine-4 (IL-4), le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) ou l’IL-1314,15,16.

Le succès d’un essai de DC in vitro repose sur la capacité des MoDC matures stimulés par l’antigène à moduler l’étendue et le type de réponse immunitaire spécifique au type d’antigène détecté17. Le type d’agent pathogène reconnu et présenté par les DC détermine la différenciation des lymphocytes T auxiliaires (Th) CD4+ en cellules effectrices Th1, Th2 ou Th17 et est caractérisé par un profil de cytokines sécrétoires spécifique à l’agent pathogène. Une réponse Th1 est provoquée contre les agents pathogènes intracellulaires et entraîne la sécrétion d’interféron gamma (IFN-γ) et de facteur de nécrose tumorale bêta (TNF-β), qui module la protection phagocytaire-dépendante. Une réponse Th2 est déclenchée contre les organismes parasites et est caractérisée par la sécrétion d’IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13, qui initie une protection humorale indépendante des phagocytes . Th17 offre une protection dépendante des neutrophiles contre les infections bactériennes et fongiques extracellulaires médiées par la sécrétion d’IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 et TNF-α 18,19,20,21. Sur la base d’études antérieures, il a été noté que tous les agents pathogènes ne correspondent pas au profil cytokinique attendu. Par exemple, les MoDC dermiques, en réponse à une infection parasitaire à Leishmania, stimulent la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+, induisant ainsi une réponse pro-inflammatoire protectrice en Th122.

Il a également été démontré que, chez les poulets, les MoDCs amorcés avec Salmonella lipopolysaccharide (LPS), peuvent induire une réponse variable contre Salmonella typhimurium en activant à la fois les réponses Th1 et Th2, tandis que Salmonella gallinarum induit une réponse Th2 seule, ce qui pourrait expliquer la résistance plus élevée de cette dernière à la clairance MoDC23. L’activation des DC contre Brucella canis (B. canis) a également été rapportée dans les MoDC canins et humains, ce qui signifie que cela pourrait représenter un mécanisme d’infection zoonotique24. Les MoDC humains amorcés avec B. canis induisent une forte réponse Th1 qui confère une résistance à une infection grave, tandis que les MoDC canins induisent une réponse Th17 dominante avec une réponse Th1 réduite, conduisant par la suite à l’établissement d’une infection chronique25. Les DCD bovins présentent une affinité accrue pour le virus aphteux (FMDV) conjugué à l’immunoglobuline G (IgG) par rapport au virus de la fièvre aphteuse non conjugué seul, car les MoDC forment un complexe viral-anticorps en réponse aux10 premiers. Prises ensemble, ces études montrent comment les DC ont été utilisés pour analyser la complexité des réponses immunitaires au cours d’une infection pathogène. Les réponses immunitaires adaptatives peuvent être évaluées par la quantification de marqueurs spécifiques associés à la prolifération des lymphocytes. La Ki-67, une protéine intracellulaire détectée uniquement dans les cellules en division, est considérée comme un marqueur fiable pour les études de prolifération26, et de même, CD25 exprimé à la surface des lymphocytes T au cours de la phase tardive d’activation correspond à la prolifération lymphocytaire27,28.

Cette étude démontre une méthode standardisée pour la génération in vitro de MD bovins suivie de leur application dans un essai immunitaire in vitro utilisé pour tester l’immunogénicité des vaccins. Un vaccin antirabique (RV) disponible dans le commerce a été utilisé pour valider l’efficacité de ce test. L’activation et la prolifération des lymphocytes T ont été mesurées par cytométrie en flux, réaction en chaîne quantitative par polymérase en temps réel (qPCR) et dosage immuno-enzymatique (ELISA) grâce à l’analyse de marqueurs d’activation cellulaire bien établis tels que Ki-67 et CD25 et la sécrétion d’IFN-γ 28,29,30,31. Aucun essai expérimental animal ou humain n’est effectué au cours du test MoDC.

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Protocole

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La collecte de sang est effectuée par un service vétérinaire certifié conformément aux directives éthiques de l’Agence autrichienne pour la santé et la sécurité alimentaire (AGES) et conformément aux normes acceptées en matière de bien-être animal32. L’étude a reçu l’approbation éthique du ministère autrichien de l’Agriculture. La conception expérimentale de la génération de DCMO et son application ultérieure sont illustrées à la figure 1.

1. Production de DC naïfs

REMARQUE : Des échantillons de sang total ont été prélevés à partir d’un seul veau exempt d’agents pathogènes par ponction de la veine jugulaire avec des vacutainers héparinisés (huit tubes de sang de 9 mL ont été utilisés pour cette étude). Transportez le sang dans une glacière. Conservez les échantillons à 2-4 °C pour une utilisation ultérieure ou traitez-les immédiatement. Gardez le sang en rotation pour éviter la coagulation du sang. Stériliser les vacutainers avec de l’éthanol à 70%. Toutes les expériences suivantes ont été réalisées avec un échantillon biologique et six réplications techniques.

  1. Centrifugation à gradient de densité pour isoler les PBMC du sang hépariné
    1. Mélangez bien le sang en l’inversant 10x.
    2. À l’aide d’une pipette de 10 mL, transférer 20 mL de sang hépariné dans un tube stérile de 50 mL et le diluer avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Pipeter 15 mL de milieu d’isolement lymphocytaire dans un tube stérile de 50 mL.
      REMARQUE : Laisser le milieu isolant les lymphocytes atteindre la température ambiante avant le pipetage.
    4. Incliner le tube de 50 mL contenant le milieu d’isolement lymphocytaire à une position de 45°. Pointez l’extrémité d’une pipette de 25 mL perpendiculairement et déposez soigneusement les 30 mL de PBS sanguin sur le milieu d’isolement des lymphocytes, sans mélanger les deux. Très lentement, ramenez le tube de 50 ml en position verticale.
    5. Centrifuger à 800 × g pendant 35 min à 20 °C avec accélération maximale et sans freinage (fonction de décélération désactivée).
    6. Utilisez une pipette Pasteur pour recueillir la couche PBMC (la fine couche blanche juste après la première couche de plasma) et transférez-la dans un nouveau tube de 50 mL.
      REMARQUE: La centrifugation par gradient de densité sépare le sang total en différentes couches. En conséquence, les érythrocytes se déposent au fond sous forme de pastille, les cellules mononucléaires (PBMC) se déposent dans la couche d’interface et le plasma forme la couche supérieure. Les granulocytes se trouvent entre la pastille et la couche PBMC.
    7. Lavez les PBMC récoltés 2x en ajoutant du PBS jusqu’à un volume de 40 ml et en mélangeant soigneusement en pipetant de haut en bas. Ensuite, centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 7 min avec une accélération maximale et une décélération maximale.
    8. Jeter le surnageant par décantation, remettre en suspension la pastille dans 15 mL de 1x tampon de chlorure d’ammonium-potassium (ACK) et incuber à température ambiante pendant 10-15 min.
      NOTE: Ne pas incuber pendant plus de 15 min. Le tampon ACK disponible dans le commerce est utilisé pour assurer la lyse des globules rouges résiduels (GR) présents dans la fraction PBMC.
    9. Ajouter du PBS jusqu’à un volume de 40 mL, puis centrifuger à 500 × g et 4 °C pendant 7 min avec une accélération et une décélération maximales.
    10. Jeter le surnageant par décantation et répéter l’étape 1.1.9.
    11. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieu de culture complet (à température ambiante).
      NOTE: Le milieu de culture complet est composé du milieu de culture cellulaire RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
  2. Séparation magnétique des cellules CD14+/− de la population PBMC à l’aide de billes magnétiques conjuguées CD14
    1. Compter les cellules avec un compteur de cellules d’hémocytomètre propre en utilisant 10 μL de suspension cellulaire mélangée à 10 μL de solution de bleu de trypan (0,4%).
      REMARQUE: Le colorant bleu trypan est un produit chimique toxique et potentiellement cancérigène. Il doit être manipulé en portant un équipement de protection individuelle (EPI) pour éviter tout contact, et les déchets doivent être jetés dans un contenant de déchets toxiques spécialisé hermétique. Les cellules mortes apparaîtront en bleu, tandis que les cellules vivantes apparaîtront claires au microscope.
    2. Centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
    3. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant un volume de 40 μL pour 1 × 107 cellules. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Le tampon FACS est composé de 2 % de FBS et de 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dissous dans du PBS.
    4. Ajouter 5 μL de tampon de microbilles CD14 par 1 × 10 à 7 cellules, et bien mélangerà l’aide d’une pipette.
    5. Incuber pendant 30 min à 4-8 °C pour la sélection positive des monocytes CD14+ bovins33. Vortex toutes les 15 minutes pendant la période d’incubation.
    6. Étape facultative (pour l’analyse par cytométrie en flux) : Ajouter 10 μL d’anticorps colorant CD14-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) avec incubation ultérieure pendant 15 min à 4-8 °C. Reportez-vous à l’analyse de cytométrie en flux à l’étape 5 pour plus de détails.
    7. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifuger pendant 7 min à 500 × g.
    8. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS par 1 × 108 cellules.
    9. Insérez la colonne de séparation des cellules immunomagnétiques dans le séparateur (porte-colonne magnétique) et placez un tube de collecte de 15 mL sous la sortie de la colonne pour recueillir le flux.
    10. Laver la colonne avec 1 mL de tampon FACS dégazé. Après le rinçage, remplacez le tube usagé de 15 ml par un nouveau.
    11. Laisser passer la suspension cellulaire (à partir de l’étape 1.2.8) à travers la colonne en pipetant 1 × 108 cellules dans 500 μL de tampon à la fois.
      REMARQUE: Faites attention à ne pas générer de bulles d’air lors du mélange des cellules avant de les laisser traverser la colonne.
    12. Rincer la colonne 3x avec 3 mL de tampon FACS dégazé à chaque fois.
    13. Recueillir l’écoulement continu et étiqueter cette première fraction éluée comme fraction cellulaire CD14− (PBMC moins monocytes CD14+ ); C’est ce qu’on appelle aussi la fraction lymphocytaire naïve.
      REMARQUE : Les cellules CD14− sont maintenues dans un milieu de culture complet jusqu’à ce que des MoDC pulsés d’antigène soient produits.
    14. Retirez la colonne du séparateur.
    15. Placer un nouveau tube stérile de 15 mL sous la colonne pour la collecte de l’effluent.
    16. Pipeter 5 mL de tampon FACS dans la colonne et la pousser immédiatement à l’aide d’un piston.
    17. Recueillir l’écoulement continu et étiqueter cette deuxième fraction éluée comme fraction de cellule CD14+ ; C’est ce qu’on appelle aussi la fraction monocytaire naïve.
    18. Ajouter un milieu de culture complet aux monocytes CD14+ récoltés pour obtenir 1 × 106 cellules/mL.
      REMARQUE : Compter les cellules vivantes dans la fraction cellulaire CD14+ éluée pour estimer le volume de milieu de culture complet nécessaire pour atteindre le nombre de cellules désiré.
    19. Prenez une plaque stérile de 24 puits et ajoutez 1 mL de la suspension cellulaire (1 × 106 cellules/mL) à chaque puits.
  3. Différenciation des monocytes naïfs CD14+ en MoDC naïfs par addition d’un cocktail de cytokines à 3% p/v (GM-CSF + IL-4) avec un total de 5 jours d’incubation
    1. Complétez chaque puits contenant des monocytes CD14+ avec 40 μL (3% p/v) du cocktail de cytokines fourni dans la trousse.
    2. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 et à 37 °C pendant 48 h.
    3. Le jour 2, transférer la moitié du contenu de chaque puits (500 μL) à l’aide d’une pipette dans des tubes individuels de 1,5 mL et centrifuger à 500 × g à 4 °C pendant 7 min.
    4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de culture complet frais.
    5. Transfère 500 μL de cette suspension cellulaire de l’étape 1.3.4 à chaque puits désigné de sorte que le volume final soit de 1 mL.
    6. Enrichir chaque puits avec 20 μL de cocktail de cytokines.
    7. Incuber la culture pendant 72 h dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 et à 37 °C.
    8. Après l’incubation du jour 5, retirez la plaque de l’incubateur.
      REMARQUE : Chaque puits contiendra 1 mL d’une suspension cellulaire de MoDC naïfs. Le nombre de MoDC sera un pourcentage (~20%) des monocytes originaux plaqués (1 × 106/mL).

2. Essai de l’activité endocytaire MoDC

REMARQUE : Le test d’absorption d’antigène ou le test d’activité endocytaire mesure la capacité des DC naïfs à internaliser des matières étrangères. Effectuer le dosage en utilisant des MoDC naïfs cultivés avec un cocktail de cytokines à 3% p/v et avec 5 jours d’incubation, comme décrit précédemment34.

  1. Prélever la suspension cellulaire MoDC naïve de la plaque de 24 puits et la transférer dans un tube de 15 mL; recueillir également les cellules résiduelles en rinçant les puits avec du PBS.
  2. Centrifuger pendant 500 × g pendant 7 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de culture additionné de FBS à 1 %.
  3. Compter les cellules MoDC vivantes pour estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité (2 × 105 cellules/mL).
  4. Culture des MoDC naïfs dans 100 μL de milieu de culture complet dans une plaque de 24 puits avec une concentration cellulaire finale de 2 × 105 cellules/mL.
  5. Compléter chaque puits avec 1 mg/mL de dextrane conjugué FITC (sonde fluorescente utilisée comme traceur d’endocytose).
    REMARQUE: Le FITC-dextran agit comme une sonde fluorescente et est utilisé comme traceur d’endocytose.
  6. Couvrir la plaque, et incuber à l’obscurité à 5% de CO2 et 37 °C pendant 60 min.
    NOTE: Pour le contrôle de fond, incuber les cellules MoDC supplémentaires (2 × 105 cellules / mL) avec 1 mg / mL FITC-dextran sur de la glace, car ce type d’incubation empêche l’entrée de la molécule traceuse (FITC-dextran) dans les cellules.
  7. Après l’incubation, transférer immédiatement la plaque de 24 puits sur de la glace pour arrêter l’endocytose de FITC-dextran.
  8. Lavez les cellules avec un tampon FACS glacé.
  9. Récolter, centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon FACS.
  10. Analyser l’intensité de fluorescence du FITC-dextran dans les cellules à l’aide de la cytométrie en flux. Reportez-vous à l’analyse de cytométrie en flux à l’étape 5.2 pour plus de détails.

3. Génération de MoDC pulsés d’antigènes

REMARQUE : Un vaccin disponible dans le commerce et cliniquement approuvé contre le virus de la rage (RV) peut induire la différenciation des DC naïfs en MD présentant un antigène mature. Utiliser 0,1 % (~1 μL) d’une seule dose de vaccin antirotavirus pour générer des MoDC pulsés d’antigène. En outre, il est préférable de produire des MoDC pulsés RV dans la même plaque de culture utilisée (à l’étape 1.3.8) pour générer des MoDC naïfs, car le transfert des MoDC naïfs dans une nouvelle plaque de 24 puits les affectera négativement.

  1. À partir de l’étape 1.3.8), Ajouter 1 μL/mL de suspension de RV à 1 mL de culture de DC naïf dans la plaque de 24 puits, et incuber pendant 48 h à 5 % de CO2 et 37 °C.
    REMARQUE: Les MoDC naïfs cultivés sans stimulation RV sont utilisés comme contrôle de fond (et comme stimulation non spécifique pour la co-culture avec des lymphocytes dans les étapes suivantes).
  2. Après l’incubation, le jour 7, conserver la plaque de 24 puits contenant les MoDC pulsés d’antigène sur la glace pendant 10 minutes.
  3. Ajouter 1 mL de PBS glacé par puits. Bien mélanger chaque puits par pipetage et transférer la suspension dans un tube de 15 mL.
  4. Lavez les puits avec 2 ml de PBS glacé pour recueillir les cellules résiduelles laissées dans chaque puits.
  5. Transférer le contenu dans leurs tubes respectifs et centrifuger la suspension cellulaire à 500 × g pendant 7 min.
  6. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire (MoDC pulsés d’antigène) dans un milieu de culture complet et ajuster le volume à une concentration cellulaire finale de 1 × 105 cellules/mL.
    REMARQUE: Comptez les cellules vivantes pour estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité. Utilisez des MoDC pulsés RV à partir du jour 7 pour le système de co-culture MoDC-lymphocyte.

4. Co-culture MoDC-lymphocytes

REMARQUE: Le système de co-culture MoDC-lymphocytes in vitro détermine la capacité des MoDCs à amorcer les lymphocytes spécifiques de l’antigène. Les différents groupes de traitement de cellules après 16 jours de co-culture comprennent des cellules spécifiques, non spécifiques et témoins. Le groupe spécifique est défini comme des lymphocytes co-cultivés avec des MoDC pulsés RV; le groupe non spécifique est défini comme des lymphocytes co-cultivés avec des MoDC non pulsés par antigène; et le groupe témoin est défini comme des lymphocytes cultivés sans MoDC.

  1. Ajouter un milieu de culture complet à la fraction lymphocytaire naïve éluée (cellules CD14− ) pour atteindre une concentration cellulaire de 2 × 106 cellules/mL.
    REMARQUE : Compter les cellules vivantes de la culture cellulaire CD14− qui ont été maintenues dans un milieu de culture complet dans une plaque de 24 puits depuis leur collecte afin d’estimer le volume de milieu nécessaire pour atteindre le nombre de cellules souhaité.
  2. Le jour 7, prendre une plaque stérile de 24 puits et ensemencer les puits avec 1 mL de suspension de cellules lymphocytaires naïves (2 × 106 cellules/mL) plus 1 mL de suspension de MoDC pulsée ou non pulsée d’antigène (1 × 105 cellules/mL).
    NOTE: Le volume total dans chaque puits sera de 2 mL avec un rapport de 1:20 MoDCs par lymphocytes par puits.
  3. Incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C et 5% de CO2.
  4. Enrichissement et restimulation de la culture avec des MoDC pulsés d’antigènes
    1. Après l’incubation de la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée antigène, le jour 9, compléter chaque puits avec 20 ng/mL d’IL-2 recombinante et continuer à incuber pendant encore 120 h (5 jours d’incubation).
    2. Le jour 14, transférer 1 mL de la coculture dans un tube stérile de 1,5 mL et centrifuger à 500 × g pendant 7 min.
    3. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de MoDC pulsés ou non pulsés par antigène (1 × 105 cellules/mL). Mélanger doucement par pipetage et transférer les suspensions cellulaires vers leurs puits désignés.
      REMARQUE : À cette étape, le volume total dans chaque puits est de 2 mL.
    4. Poursuivre l’incubation à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 48 h. Après l’incubation du jour 16, la co-culture est prête pour l’analyse par cytométrie de flux, qPCR et ELISA.
      REMARQUE: Pour chaque 2 mL dans chaque puits de la co-culture lymphocytaire MoDC, 1 mL de cellules remises en suspension est coloré pour la cytométrie en flux, 1 mL est utilisé pour l’extraction de l’ARN et les surnageants des deux sont utilisés pour ELISA.

5. Analyse cytométrique en flux

REMARQUE : Colorer les cellules avec les marqueurs appropriés/mAb avant d’exécuter les échantillons sur un cytomètre en flux. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs (témoins de coloration de l’AcM et des isotypes), la trousse, l’instrument et le logiciel utilisés pour l’analyse de cytométrie en flux.

  1. Protocole de coloration du cytomètre en flux
    REMARQUE : Effectuer une coloration de la surface cellulaire pour les PBMC et les lymphocytes et monocytes naïfs à l’aide d’anticorps monoclonaux anti-CD14 (étape 1.2.6). Pour la coloration de la surface cellulaire des MoDC naïfs, utilisez un AcM anti-CD86-spécifique, anti-CD40-spécifique et anti-MHC II-spécifique. Pour la coloration de la surface cellulaire des cellules à partir des co-cultures du jour 16, utilisez des mAbs anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25; pour la coloration intracellulaire, utilisez un anticorps monoclonal anti-Ki-67. De plus, colorer les cellules soit avec un isotype négatif contrôle mAb, soit sans mAb (FMO: fluorescent moins un). La principale différence lors de la coloration pour les marqueurs de surface et intracellulaires est que pour les marqueurs de surface cellulaire, les cellules doivent être colorées avec un AcM de surface spécifique avant la coloration vivante / morte (L / D) ou tout autre processus. Cependant, la coloration intracellulaire est effectuée après la coloration L / D et nécessite une étape de fixation plus perméabilisation pour permettre la pénétration intracellulaire.
    1. Transvaser 1 mL de suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
      REMARQUE: Après la centrifugation, lors du traitement des cellules de la co-culture MoDC-lymphocyte, conservez le surnageant pour l’analyse ELISA.
    2. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de PBS et transférez-la dans un tube de 15 mL. Recueillir les cellules résiduelles à l’aide de 1 mL de PBS et les combiner avec la pastille remise en suspension.
    3. Ajouter 10 mL de PBS dans le tube de 15 mL contenant les cellules, mélanger par pipetage et centrifuger pendant 7 min à 850 x g.
    4. Jetez le surnageant et répétez l’étape 5.1.3.
    5. Jeter le surnageant et remettre délicatement en suspension la pastille de la cellule avec la suspension résiduelle (environ 180 μL) laissée après la décantation du surnageant.
    6. Transférer la suspension cellulaire sur une plaque à fond en V de 96 puits et sceller les puits pour éviter les déversements.
    7. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min. Après la centrifugation, passez la plaque sur un récipient à déchets pour vider les puits de liquide et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour assurer l’élimination de l’excès de liquide.
    8. Ajouter 25 μL de mélange principal de coloration de surface par puits et mélanger doucement à l’aide d’une pipette, puis incuber à 4 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : Pour préparer le mélange principal de coloration de surface pour un seul puits, ajouter 2,5 μL d’AcM de surface à 20 μL de tampon FACS.
    9. Ajouter 200 μL de tampon FACS par puits, et centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min. Après la centrifugation, videz les puits de liquide par décantation et tapotez la plaque sur du papier absorbant pour éliminer l’excès de liquide.
    10. Ajouter 100 μL de solution de coloration L/D par puits. Bien mélanger à l’aide d’une pipette, puis procéder à une incubation à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité.
      REMARQUE : Pour un seul puits, dissoudre 0,25 μL de colorant L/D dans 100 μL de tampon FACS. Le colorant L/D aide à distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
    11. Ajouter 100 μL de tampon FACS. Couvrir les puits avec le couvercle et centrifuger la plaque pendant 1 400 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
    12. Répétez l’étape 5.1.11.
    13. Ajouter 50 μL de solution de fixation par puits (fournie avec le kit), et mélanger à la pipette avant d’incuber la plaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 min.
    14. Ajouter 150 μL du tampon de perméabilisation-lavage (PW) 1x fourni avec le kit et couvrir les puits avec le couvercle.
      REMARQUE : Pour préparer 10 mL de 1x tampon PW, diluer 1 mL de tampon permanent 10x dans 10 mL dedH2O.
    15. Centrifuger la plaque à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
    16. Ajouter 200 μL de 1x PW, puis centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
    17. Pour la coloration intracellulaire, ajouter 25 μL de mélange maître de coloration intracellulaire (anticorps monoclonaux Ki-67 anti-humain) par puits. Bien mélanger et incuber l’assiette pendant 30 min à 4 °C ou sur de la glace dans l’obscurité.
      REMARQUE : Pour préparer le mélange principal de coloration intracellulaire pour un seul puits, ajouter 1 μL de Ki-67 mAb à 24 μL de 1x PW. Le marqueur de coloration intracellulaire n’est utilisé que lors du traitement des cellules à partir de la co-culture du jour 16. La coloration intracellulaire n’est pas effectuée lors du traitement des PBMC, des lymphocytes naïfs, des monocytes et des MoDC naïfs.
    18. Après l’incubation, ajouter 200 μL de 1x PW à chaque puits. Mélanger à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 1 400 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation et tapoter la plaque sur du papier absorbant.
    19. Ajouter 200 μL de tampon FACS, puis centrifuger à 1 400 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant par décantation et tapotez-le sur du papier absorbant.
    20. Resuspendre la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon FACS et transférer le contenu de chaque puits dans des tubes de cytomètre à flux stériles séparés. Utilisez 300 μL de tampon FACS par puits pour recueillir les cellules résiduelles. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse par cytométrie en flux.
  2. Exécution de l’échantillon sur un cytomètre en flux
    REMARQUE: Les échantillons ont été exécutés sur un cytomètre en flux (à l’aide de lasers de 488 nm, 638 nm et 405 nm) conformément au manuel du fabricant.35. Reportez-vous au manuel pour plus de détails, le dépannage et la personnalisation du protocole.
    1. Effectuer des procédures de nettoyage de routine avant et après la lecture des échantillons.
      REMARQUE: Ne sautez pas une position pendant le chargement des tubes dans l’instrument.
      1. Pour le cycle de nettoyage, utiliser un total de quatre tubes, le premier contenant un réactif de nettoyage en flux et les trois autres contenant du dH2O; chaque tube aura 3 mL. Pendant le cycle de nettoyage, acquérir des données avec un débit moyen pendant environ 1 min en capturant 100 000 événements par tube sous 330 V pour la diffusion vers l’avant (FSC) contre 265 V pour la diffusion latérale (SSC).
        REMARQUE : Aucun débris ou événement cellulaire ne doit être signalé pendant le nettoyage; Si cela se produit, effectuez à nouveau l’étape de nettoyage. Pour exécuter les échantillons, assurez-vous que tous les échantillons sont dans une suspension homogène avant d’acquérir les données, car cela garantit une lecture précise.
    2. Pour connecter et allumer le cytomètre, cliquez sur le bouton Application situé dans le coin gauche de la barre de titre. Dans le menu déroulant de l’application, sélectionnez l’option Cytométrie et cliquez sur l’option Allumer.
      REMARQUE: Dans le menu déroulant de l’application, l’option Ouvrir permet aux utilisateurs de parcourir les tests préprogrammés, tandis que l’option Nouveau protocole permet aux utilisateurs de créer de nouveaux protocoles.
    3. Chargez d’abord l’échantillon témoin négatif dans le support multitube. Sélectionnez Nouveau protocole et observez la liste de travail sur le côté gauche de l’espace de travail/écran.
    4. Sur la liste de travail, définissez la position de l’échantillon dans le support multitube et donnez un nom à l’échantillon et au protocole d’identification.
    5. À partir du panneau Matériel situé sur le côté gauche de l’espace de travail, réglez et sélectionnez plusieurs paramètres tels que les détecteurs (FSC, SSC et 10 plages de fluorescence), les tensions (V ) et les gains des photomultiplicateurs, ainsi que la surface-hauteur-largeur (AHW) du signal.
      NOTE: Les réglages suivants pour les détecteurs ont été sélectionnés en fonction de l’expérience et de l’instrument utilisé: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. À partir du panneau de commande d’acquisition d’instruments situé sous la barre de titre, réglez les options de débit (moyen), de temps (5 min) et d’événements (voir étape 5.2.8) que vous souhaitez détecter. Cliquez sur l’option Acquérir un single pour permettre à l’instrument de dessiner / exécuter l’échantillon et afficher l’aperçu en temps réel des événements détectés.
    7. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence (tension et gain) et la taille de la cellule pour éventuellement tracer des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire.
      REMARQUE: FSC aide à distinguer les cellules sur la base de la taille, permettant ainsi aux utilisateurs de différencier les cellules du système immunitaire, telles que les monocytes et les lymphocytes; Les monocytes sont plus gros et montrent une intensité FSC plus élevée par rapport aux lymphocytes.
    8. Acquérir un total de 5 000 MoDC vivants, 50 000 lymphocytes vivants et 50 000 événements monocytaires vivants.
    9. Une fois que tous les paramètres sont ajustés en référence à l’échantillon de contrôle négatif, cliquez sur Arrêter et enregistrez le protocole.
    10. Maintenant, chargez tous les échantillons sur la chargeuse multitube. Définissez chaque échantillon de la liste de travail et appliquez les paramètres ajustés en référence au contrôle négatif à tous les échantillons de l’expérience. Cliquez sur l’option Acquérir pour permettre à tous les échantillons de l’expérience d’être exécutés consécutivement.
    11. Une fois les données de tous les échantillons acquises, sauvegardez et transformez-les en données lisibles à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié qui permet la génération d’histogrammes biparamétriques et monoparamétriques séquentiels.

6. Analyse de l’expression de l’ARN messager (ARNm)

  1. Extraction d’ARN
    REMARQUE : Extraire l’ARN total de la co-culture MoDC-lymphocytes pulsée d’antigène (spécifique), de la co-culture MoDC-lymphocytes non pulsée d’antigène (non spécifique), de la culture lymphocytaire sans MoDC (témoin) et de lymphocytes naïfs (cellules CD14− isolées avant la co-culture). Pour l’extraction de l’ARN, préparez de l’éthanol en utilisant de l’eau sans RNase. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur la trousse d’extraction et les réactifs.
    1. Transférer 1 mL de suspension cellulaire de la plaque de coculture MoDC-lymphocytes (~1 × 106 cellules/mL) dans un tube stérile stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
    2. Gardez le surnageant pour ELISA. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de PBS et transférez-la dans un tube de 15 mL. Recueillir toutes les cellules résiduelles en utilisant 1 mL de PBS.
    3. Centrifuger pendant 10 min à 500 × g.
      REMARQUE: Tous les échantillons doivent être manipulés délicatement comme des cellules vivantes jusqu’à ce que la lyse cellulaire soit effectuée à l’aide du tampon de lyse fourni dans la trousse. La mort cellulaire libère des RNases qui hydrolysent rapidement les matrices d’ARN nécessaires à la quantification en aval. Le tampon RLT lyse les cellules dans une solution qui inhibe les RNases.
    4. Ajouter 350 μL de tampon de lyse à chaque puits vide et incuber pendant 2-3 minutes pour lyser les cellules adhérentes qui n’ont pas été récoltées dans les étapes précédentes.
    5. Une fois la centrifugation de l’étape 6.1.3 terminée, jeter le surnageant et combiner la pastille de cellule avec le tampon de lyse de 350 μL ajouté à l’étape 6.1.4.
      REMARQUE: À ce stade, il est possible de stocker les tubes à -80 ° C ou de procéder à l’extraction de l’ARN (étapes suivantes).
    6. Pipeter 350 μL d’éthanol à 70% au lysat à l’étape 6.1.5. Le volume final par échantillon est de 700 μL.
    7. Insérez la colonne d’extraction dans un tube de collecte de 2 mL (fourni avec la trousse).
    8. Transférer les 700 μL d’échantillon par colonne d’extraction et centrifuger à 10 000 × g pendant 15 s. Jetez le flux dans le tube de collecte et replacez-le dans la colonne de rotation.
    9. Dans la colonne d’extraction, ajouter 350 μL de tampon de lavage strict (fourni dans le kit) et centrifuger à plus de 10 000 × g pendant 15 s. Ignorez le flux.
    10. Ajouter 80 μL de mélange d’incubation DNase I par échantillon sur la membrane de la colonne d’extraction et laisser reposer pendant 15 min à 20-30 °C.
      NOTE: Pour préparer le mélange d’incubation DNase I par échantillon, ajouter 10 μL de solution mère DNase I à 70 μL de tampon DNase pour un volume final de 80 μL. Bien mélanger en retournant le tube plusieurs fois, suivi d’un court spin dans la centrifugeuse.
    11. Laver la colonne d’extraction avec 350 μL de tampon de lavage rigoureux, suivi d’une centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min. Jeter l’écoulement dans le tube de collecte après la centrifugation.
    12. Laver la colonne d’extraction 2x avec 500 μL de tampon de lavage doux à chaque fois et par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 s et une seconde fois pendant 2 min. Jetez le flux après chaque centrifugation.
    13. Centrifuger la colonne à vitesse maximale pendant 1 min pour sécher la membrane et jeter le tube de collecte.
    14. Placer la colonne d’extraction dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 mL.
    15. Pipeter 50 μL d’eau exempte de RNase sur la membrane de la colonne et incuber pendant 3 à 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Pour les concentrations d’ARN inférieures à 100 ng, réduire le volume d’élution à 30 μL et éluer de nouveau la membrane de la colonne d’extraction à l’aide du produit de la première élution pour concentrer le produit final.
    16. Centrifuger à 10 000 × g pendant 1 min pour éluer l’ARN.
    17. Mesurer la concentration d’ARN en détectant l’absorbance à 260 nm en utilisant 0,5-2 μL d’échantillon. Ajuster la concentration finale d’ARN à 0,1-1 μg/μL en utilisant de l’eau sans RNase.
    18. Conserver les aliquotes d’ARN à −80 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Synthèse d’ADN complémentaire
    1. Synthétiser l’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN modèle extrait selon le protocole du fabricant fourni avec la trousse (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
      NOTE : Un résumé des réactifs et des volumes utilisés est présenté dans les tableaux 1 et 2. Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.
  3. Réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel
    1. Pour la qPCR, exécutez les échantillons d’ADNc en trois exemplaires. Quantifier les niveaux de transcrits d’ARNm bovins pour Ki-67 et IFN-γ à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques en référence au gène GAPDH , comme le montre le tableau 3.
      REMARQUE : Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.

7. Dosage immunoenzymatique

  1. Traiter les surnageants de culture collectés riches en protéines sécrétoires pour la quantification de l’IFN-γ par ELISA.
    REMARQUE : Consultez le tableau des matières pour plus de détails sur l’utilisation de la trousse. Un protocole complet est détaillé dans le dossier supplémentaire 1.

8. Analyse statistique

  1. Analyser les données et faire des illustrations graphiques de la conception expérimentale à l’aide de logiciels commerciaux. Utilisez un test non paramétrique non apparié pour l’analyse comparative. Considérez que les valeurs P < 0,05 sont statistiquement significatives.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthodologie décrit la génération in vitro de MD bovins pour l’évaluation des antigènes vaccinaux candidats avant la réalisation d’études in vivo. La figure 1 illustre le schéma expérimental de la production de DC bovins et l’application des DC pour le test in vitro. En utilisant la technique de tri cellulaire magnétique, il a été possible de prélever environ 26 millions de myocytes CD14+ des PBMC récoltés, qui étaient auparavant isolés de 50 ml de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude démontre une méthode in vitro normalisée pour la production et le phénotypage des DC bovins et leur utilisation subséquente pour mesurer l’immunogénicité vaccinale d’un vaccin commercial (p. ex. RV). Les DC bovines peuvent être utilisées comme outil pour dépister les antigènes vaccinaux potentiels contre les maladies des bovins et prédire leur impact clinique potentiel en fonction des réponses immunitaires avant de procéder à des essais in vivo sur des animaux. Les DC générés ont été identif...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions la Dre Eveline Wodak et la Dre Angelika Loistch (AGES) pour leur soutien dans la détermination de l’état de santé des animaux et pour la fourniture du virus de la fièvre catarrhale ovine, le Dr Bernhard Reinelt pour la fourniture de sang bovin, et le Dr Bharani Settypalli et le Dr William Dundon de l’AIEA pour leurs conseils utiles sur les expériences de PCR en temps réel et l’édition du langage, respectivement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon de lyse ACKGibco, Thermo FisherA1049201Tampon d’ammonium-chlorure-potassium pour la lyse des globules rouges résiduels dans la fraction PBMC récoltée Fraction
BD Vacutainer Tubes d’héparineBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, héparine sodique additive 158 unités USP, tube en verre, 16 x 100 mm kit
croissance de cellules dendritiques bovinesBio-Rad, Royaume-UniPBP015KZZCocktail de cytokines composé d’IL-4 bovine recombinante et
d’IFN-&gamma bovin GM-CSF ; Kit ELISABio-RadMCA5638KZZKit d’utilisation pour mesurer l’expression de l’IFN-&gamma ; en culture surnageant
Anticorps CD14Bio-RadMCA2678FAnticorps monoclonal CD14 anti-bovin de souris, clone CC-G33, isotype IgG1
Anticorps CD25Bio-RadMCA2430PEAnticorps monoclonal CD25 de souris, clone IL-A11, isotype IgG1
Anticorps CD4Bio-RadMCA1653A647Anticorps monoclonal CD4 anti-bovin de souris, clone CC8, isotype IgG2a
Anticorps CD40Bio-RadMCA2431FAnticorps monoclonal CD40 anti-bovin de souris, clone IL-A156, isotype IgG1
Anticorps CD8Bio-RadMCA837FAnticorps monoclonal CD8 anti-bovin de souris, clone CC63, isotype IgG2a
CD86 AnticorpsBio-RadMCA2437PESouris anti-bovin CD86 anticorps monoclonal, clone IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réelBio-Rad-Thermalcycler PCR machine
Corning Centrifuge TubeFalcon Corning  ;352096 & 35207015 mL et 50 mL, fond conique en poypropylène haute clarté, gradué, stérile, bouchon à vis d’étanchéité, tube faucon
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028Kit de fixation/perméabilisation avec BD golgiPlug, utilisation pour la coloration cellulaire par cytomètre en flux
EthanolSigma Aldrich1009832500Absolute pour l’analyse EMSURE  ; ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064Qualifié, inactivé par la chaleur
Plaque Ficoll PLUSGE Health care Life Sciences, USA341691Milieu d’isolement des lymphocytes
Agent de nettoyage FlowClean BeckmanCoulter, Life SciencesA64669500 mL
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, États-Unis-Cytomètre en flux Logiciel d’histogramme
FlowTubes/ FACS  ; (Tri unicellulaire activé par fluorescence) TubeFalcon Corning  ;352235tube à essai en polystyrène à fond rond stérile de 5 mL avec capuchon à pression pour crépine de cellule, à utiliser pour l’analyse par cytométrie en flux
Fluoresceinisothiocynat-DextranSigma Aldrich, Allemagne60842-46-8FITC-dextran MW
Cytomètre en flux GalliosBeckman Coulter-FlowCytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR PlatesBio-RadHSP960196 puits, profil bas, paroi mince, à jupe, blanc/clair
Microbilles CD14 humainesMiltenyi Bioteck, Allemagne130-050-201Microbilles de 2 mL conjuguées à l’isotype IgG2a de l’anticorps monoclonal anti-humain CD14, utilisées pour la sélection de monocytes bovins à partir de PBMC
KaluzaBeckman Coulter,Allemagne-Logicield’analyse de données multicolores pour cytomètre en flux
Colonne MACS MiltenyiBioteck, Allemagne130-042-401Colum de tri cellulaire activé magnétique ou de séparation cellulaire magnétique immunitaire pour la séparation de diverses populations de cellules CD14 sur la base des antigènes de surface cellulaire
CMH Classe II DQ DR Anticorps polymorpheBio-RadMCA2228FSouris anti-mouton CMH Classe II DQ DR Polymorphe :FITC, clone 49.1, isotype IgG2a, réactif croisé avec le bovin
Microcentrifugeuse TubeSigma AldrichHS43251,5 mL, fond conique, gradué, tube stérial
Microsoft Power PointMicrosoft-Lesillustrations graphiques de la conception expérimentale
Souris IgG1 Contrôle négatif :FITC pour CD14, CD40 AnticorpsBio-RadMCA928FContrôle isotype CD14 et CD40 Anticorps monoclonal  ;
Souris IgG1 Négatif Contrôle :PE pour l’anticorps CD86Bio-RadMCA928PEContrôle isotypique CD86 Anticorps monoclonal  ;
Souris IgG1 Négatif Contrôle :RPE pour l’anticorps CD25Bio-RadMCA928PEContrôle isotypique CD25 Anticorps monoclonal  ;
négatif IgG2a de souris : FITC pour l’anticorps CMH de classe IIContrôle bio-RadMCA929Fisotype pour anticorps monoclonal CMH de classe II  ;
Nobivac RageMSD Santé animale, Royaume-Uni-1& micro ; L/mL de vaccin inactivé en culture cellulaire contenant > 2 souches U.I./mL du virus de la rage
Scellés optiquesBi0-RadTCS08030,2 mL Tube PCR plat à 8 capuchons, optique, ultraclair, compatible avec l’appareil qPCR
Pénicilline-StreptomycineGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
Tampon phosphate salin (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7,4, 1x
concentrationPrism - Logiciel GraphPad 5  ;Logiciel Dotmatics-Statistique
Anticorps Ki-67 anti-humain purifiéBiolegend, USA350501Anticorps monoclonal, réactif croisé avec une vache, clone ki-67
Souris purifiée IgG1 k Isotype Ctrl AnticorpsBiolegend400101Contrôle isotypique pour l’anticorps monoclonal Ki-67
READIDROP Propidium IodideBD Bio Sciences1351101Marqueur de cellules vivantes/mortes utilisé pour la cytométrie en flux, colorant réactif
aux amines Protéine IL-2 humaine recombinanteR& D System, USA202-IL-010/CFInterleukine-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Kit d’utilisation pour l’extraction de l’ARN total ; Tampon RLT = tampon de lyse ; Tampon RW1 = tampon de lavage strict contenant de la guanidine ; Tampon RDD = tampon DNase ; Tampon RPE = tampon de lavage doux ; RNaseOUT = inhibiteur de la RNase.
RPMI 1640 MediumSigma AldrichR8758Milieux de culture cellulaire avec L-glutamine et bicarbonate de sodium
SMART-servier art médical  ;Les Laboratoires Servier-Souslicence creative commons attribution 3.0 unported license
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymérase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, colorants de normalisation ROX.
Système de synthèse de premier brin SuperScript IIIInvitrogen, Thermo Fisher18080051 Kit pour synthèse de l’ADNc
Plaque d’essai pour culture tissulaire 24TPP, Suisse92024Plaque à 24 puits, stérilisée par rayonnement, croissance renforcée traitée, volume 3,18 mL
Trypan Blue SolutionGibco, Thermo Fisher152500610,4 %, 100 mL, colorant pour évaluer la
viabilité cellulaireEau distillée sans DNase/RNase UltraPureInvitrogen, Thermo Fisher109770230.1 & micro ; Eau distillée filtrée à membrane
Tubes de prélèvement sanguin à l’héparine VACUETTEThermo Fisher Scientific15206067Les tubes de prélèvement sanguin à l’héparine VACUETTE ont un dessus vert et contiennent de l’héparine de lithium, de sodium ou d’ammonium séchée par pulvérisation sur les parois internes et sont utilisés en chimie clinique, en immunologie et en sérologie. L’héparine, un anticoagulant, active l’antithrombine, qui bloque la cascade de coagulation et produit ainsi un échantillon de sang total/plasma.
EauSigma AldrichW3500-1LFiltre stérile, bioréactif adapté à la culture cellulaire
deContrôle

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

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