Une relaxation myocardique et cardiaque rapide est essentielle à une physiologie normale. On sait maintenant que les mécanismes de relaxation mécanique dépendent de la vitesse de déformation. Ce protocole donne un aperçu de l’acquisition et de l’analyse d’expériences pour approfondir le contrôle mécanique de la relaxation.
Article de méthode
Contrôle mécanique de la relaxation à l’aide de trabécules cardiaques intactes
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dysfonction diastolique est un phénotype commun dans les présentations de maladies cardiovasculaires. En plus d’une raideur cardiaque élevée (pression ventriculaire gauche diastolique élevée), une altération de la relaxation cardiaque est un indicateur diagnostique clé de la dysfonction diastolique. Alors que la relaxation nécessite l’élimination du calcium cytosolique et la désactivation des filaments minces sarcomériques, cibler de tels mécanismes n’a pas encore fourni de traitements efficaces. Des mécanismes mécaniques, tels que la pression artérielle (c’est-à-dire la postcharge), ont été théorisés pour modifier la relaxation. Récemment, nous avons montré que la modification de la vitesse de déformation d’un étirement, et non de la postcharge, était à la fois nécessaire et suffisante pour modifier le taux de relaxation ultérieur du tissu myocardique. La dépendance de la relaxation à la vitesse de déformation, appelée contrôle mécanique de la relaxation (MCR), peut être évaluée à l’aide de trabécules cardiaques intactes. Ce protocole décrit la préparation d’un modèle animal, d’un système et d’une chambre expérimentaux, l’isolement du cœur et l’isolement ultérieur d’une trabécule, la préparation de la chambre expérimentale et les protocoles expérimentaux et d’analyse. Les preuves de l’allongement des souches dans le cœur intact suggèrent que la MCR pourrait fournir de nouvelles arènes pour une meilleure caractérisation des traitements pharmacologiques, ainsi qu’une méthode pour évaluer la cinétique du myofilament dans les muscles intacts. Par conséquent, l’étude de la MCR peut élucider une voie vers de nouvelles approches et de nouvelles frontières dans le traitement de l’insuffisance cardiaque.
Introduction
La relaxation cardiaque est altérée dans presque toutes les formes d’insuffisance cardiaque (y compris l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection réduite) et dans de nombreuses maladies cardiovasculaires. En plus de nombreuses méthodes pour évaluer la fonction cardiaque dans les muscles perméabilisés, l’évaluation des muscles cardiaques intacts suscite de plus en plus d’intérêt. Ces tissus sont évalués déchargés (extrémités libres de contraction) ou chargés (longueur ou force contrôlée). Historiquement, les myocytes isolés intacts ont été évalués dans un état non chargé, où le corps cellulaire est libre de raccourcir pendant la contraction. Les trabécules cardiaques intactes sont souvent évaluées dans des conditions isométriques, où la longueur n’est pas autorisée à changer, mais où le stress (force par section transversale) est généré. Les méthodes des myocytes intacts et des trabécules commencent à converger avec des modifications de la charge 1,2.
Des protocoles pour serrer la charge d’un muscle (c.-à-d. contrôler le stress développé d’un muscle à une valeur spécifiée qui simule des postcharges physiologiques) ont été développés sur plusieurs décennies 3,4,5. Dans les tissus cardiaques intacts, les pinces de charge permettent aux chercheurs d’imiter plus étroitement le cycle cardiaque in vivo en utilisant des charges secondaires isotoniques ou de type Windkessel 6,7,8,9. L’objectif de ce protocole est d’obtenir des données utilisées pour quantifier le TCM (c.-à-d. la dépendance du taux de relaxation à la vitesse de déformation)8,9.
Bien que le protocole MCR ait été adapté à partir de travaux antérieurs, l’accent de ce protocole (par rapport à des protocoles similaires utilisant des tissus cardiaques intacts) est sur les mécanismes biomécaniques qui modifient la relaxation. Il existe plusieurs protocoles utilisant le serrage de charge 3,4,5,7,10 et des protocoles axés sur les modèles Windkessel 1,2,11, mais ce protocole décrit spécifiquement comment l’étirement avant relaxation modifie le taux de relaxation. Nous avons montré que ce contrôle se produit pendant une période proto-diastolique8, une phase décrite à l’origine par Wiggers12. Dans les cœurs sains normaux, le myocarde subit une contrainte d’allongement lors de l’éjection avant la fermeture de la valve aortique (c’est-à-dire avant la relaxation isovolumique)13. Ceci est imité en prolongeant la durée du contrôle de la postcharge jusqu’à ce que le muscle commence à s’étirer. Les preuves cliniques suggèrent que cet allongement peut être atténué ou perdu dans les états pathologiques14, et les implications et les mécanismes de la modification des taux de souches systoliques terminales n’ont pas été entièrement élucidés. Compte tenu de la rareté des options de traitement pour les maladies diastoliques et l’insuffisance cardiaque avec une fraction d’éjection préservée, nous postulons que la MCR peut fournir un aperçu de nouveaux mécanismes sous-jacents à la relaxation altérée.
Alors que la dissection grossière décrite ici se concentre sur les rongeurs, l’isolement de trabecula peut être effectué à partir de n’importe quel cœur intact, et a déjà été utilisé avec un trabecula cardiaque humain8. De même, l’acquisition et l’analyse des données peuvent également être appliquées aux cardiomyocytes ou à d’autres types musculaires isolés 1,10. La discussion comprend des commentaires sur les modifications et adaptations possibles de la méthode, ainsi que des limitations, telles que la prudence contre l’utilisation de muscles papillaires en raison des propriétés mécaniques des cordes9.
Protocole
Le protocole suivant a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Wayne State University. Le protocole décrit ici les étapes d’utilisation de sujets expérimentaux sur des rongeurs, mais peut être adapté pour être utilisé dans d’autres organismes modèles.
1. Préparation
- Obtenez le sujet expérimental et laissez-le s’acclimater au laboratoire.
- Préparer 250 mL de solution de perfusion et 250 mL de solution modifiée de Tyrode (tableau 1), en oxygénant chacun à 10-20 ppm d’O2, avec un pH de 7,3.
- Préparez une seringue de 5 mL avec une canule attachée. Remplissez la seringue avec une solution de perfusion. Utilisez des canules de 23 G pour une souris et de 18 ou 16 G pour un petit ou un grand rat, respectivement. Faites glisser un tube en polyéthylène (PE) d’une longueur de 1 mm à l’extrémité d’une aiguille émoussée (Table des matériaux) pour éviter que l’aorte ne glisse de la canule après avoir été attachée.
- Préparation complète de la zone de dissection et de canulation (Figure 1)
- Remplissez deux bateaux de pesage propres au moins à mi-chemin avec une solution de perfusion. Immerger l’extrémité de la canule dans une solution de perfusion avec au moins une suture à double boucle placée autour de la canule. Tenez la seringue en place à l’aide d’une pince à barres.
- Placez des ciseaux chirurgicaux, un hémostatique, une pince à iris, une paire de petits ciseaux incurvés et deux pinces #3 pour un accès facile.
- Préparer le système expérimental (Figure 2) en amorçant et en faisant circuler la solution de Tyrode modifiée dans tout le système expérimental. Assurez-vous que la chambre est complètement pleine et stable.
- Activez tous les boîtiers d’acquisition de données, y compris le capteur de force, le moteur de longueur, le système de stimulation, le système de contrôle de la température et l’ordinateur d’acquisition de données.
- Copiez et renommez un dossier de modèle contenant les fichiers *.dap et pointeur requis pour référencer l’expérience en cours. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données.
- Préparer les outils d’isolation trabecula (ciseaux Vannas, pinces #5 ou #55, sonde en verre) en immergeant leurs pointes dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 10% (p/v) dans de l’eau ultrapure ou une solution de perfusion, pour enduire le métal de protéines (Figure 2B).
REMARQUE : L’ensemble du système expérimental doit être préparé avant la dissection.
2. Dissection grossière et canulation
- Consigner l’identification, le poids corporel et d’autres renseignements pertinents sur l’animal concerné.
- Éventuellement, injecter 1 000 U/kg d’héparine dans une solution saline stérile au rongeur par injection intrapéritonéale au moins 10 minutes avant l’euthanasie, afin de minimiser les risques de coagulation avant la perfusion coronaire.
- Placez l’animal dans une chambre d’induction et induisez une anesthésie générale en utilisant 3% à 5% d’isoflurane vaporisé dans 100% d’oxygène, selon la procédure standard.
REMARQUE : Allumez les épurateurs externes, les tables à tirage vers le bas ou les hottes utilisées pour minimiser l’exposition à l’isoflurane. - Une fois que le rongeur perd son réflexe de redressement et que le rythme respiratoire a ralenti:
- (Pour un rat) retirer l’animal de la chambre d’induction et le placer couché sur le dos sur un tampon de dissection, avec une anesthésie continue à travers un cône nasal.
- (Pour une souris) effectuer une luxation cervicale immédiatement après avoir retiré l’animal de la chambre d’induction. Le cône de nez n’est pas nécessaire. Tournez le vaporisateur d’isoflurane à 0%.
- Si nécessaire, fixez les membres supérieurs du rongeur au tampon de dissection loin de la paroi thoracique à l’aide de ruban adhésif soutenu par des épingles, en prenant soin de ne pas percer l’animal. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie appropriée (absence de réponse de pincement des orteils) avant de procéder à la dissection.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux (Mayo pour les rats, Metzenbaum pour les souris), juste en dessous du processus xyphoïde, coupez la peau transversalement sur toute la largeur de l’abdomen du rongeur dans l’espace péritonéal.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites deux coupes verticales parasagittales (sur les côtés de la paroi thoracique) sur les côtés gauche et droit de la paroi thoracique à partir de la coupe transversale. Ensuite, coupez à travers le diaphragme, reliant les coupes parasagittales et libérant l’espace thoracique.
- Serrez et soulevez le processus xyphoïde à l’aide d’un hémostatique vers la tête du rongeur, pour déplacer le sternum et la paroi thoracique vers la tête du rongeur, exposant l’espace thoracique et le cœur. Si nécessaire, étendez rapidement les coupures parasagittales près du deuxième espace vertébral, pour exposer complètement le cœur et / ou briser la membrane péricardique.
- À l’aide d’une pince à iris incurvée, soulevez soigneusement le cœur pour visualiser les grands vaisseaux. Placez la pince entre le myocarde et la colonne vertébrale du rongeur, serrez les vaisseaux supérieurs et soulevez le cœur, en prenant soin de ne pas serrer les oreillettes ou les segments ventriculaires.
- Tout en soulevant légèrement le cœur, placez rapidement les ciseaux d’iris incurvés (concave vers le haut) entre la pince incurvée de l’iris et la colonne vertébrale du rongeur, et coupez les grands vaisseaux et les poumons loin du cœur. Déplacez rapidement le cœur dans un bateau de pesée ou un bécher contenant une solution de perfusion fraîche et secouez pour aider à éliminer le sang du cœur.
- Tournez le vaporisateur d’isoflurane à 0%, si ce n’est déjà fait. Si de grands segments de poumon, de tissu péricardique ou d’autres tissus restent attachés au cœur, coupez-les soigneusement et jetez-les à ce moment-là pour minimiser les interférences avec la canulation.
- À l’aide de la pince à iris incurvée, déplacez le cœur dans un bateau de pesée ou un bécher propre, avec la canule préparée immergée. Canuler l’aorte, fixer l’aorte en serrant la suture de soie bouclée et rincer avec jusqu’à 5 ml de solution de perfusion.
- Retirez le cœur de la canule et placez-le dans un plat de pesée recouvert d’élastomère de silicone pour préparer l’isolement de la trabécula.
3. Isolement et équilibrage de trabecula
- Placez le cœur dans la capsule recouverte d’élastomère de silicone sous un stéréomicroscope et éclairez-le.
- Localisez le couloir d’écoulement ventriculaire droit. Épinglez l’oreillette gauche et l’apex ventriculaire à l’élastomère de silicone dans le plat.
- À l’aide de longs ciseaux Vannas, couper du tractus d’écoulement ventriculaire droit à l’apex le long du septum. Couper de la voie d’écoulement ventriculaire droite à l’oreillette droite près de l’aorte, puis couper à travers l’oreillette droite (figure 3B).
- À l’aide d’une pince, ouvrez soigneusement la paroi libre du ventriculaire droit (RV) du tractus de sortie, en prenant soin de ne pas étirer le tissu.
REMARQUE: Les expérimentateurs peuvent trouver de minces brins de tissu conjonctif blanc, qui peuvent être coupés sans souci. Les brins plus grands, de couleur rose (tissu) doivent être évalués avec soin, car il peut s’agir de trabécules qui peuvent être isolées. - Épinglez la paroi libre du triangle du ventricule droit à la capsule pour exposer le ventricule droit (Figure 3C).
- À l’aide d’une pipette en verre fondue et formée avec une extrémité mince (<500 μm de diamètre) mais pas tranchante, rechercher dans l’endocarde exposé des trabécules autoportantes (figure 3C).
REMARQUE: Une trabecula autonome est une bande de muscle que l’on peut complètement sonder dessous. Utilisez des trabécules qui ont des côtés parallèles (largeur constante), en évitant les muscles papillaires triangulaires. Soyez prudent pendant ce processus et la dissection ultérieure, car l’application d’une contrainte sur la trabecula peut causer des dommages, réduisant ainsi la force développée. - Disséquez la trabecula à l’aide de petits ciseaux Vannas. Laissez un morceau de tissu cube de ≥1 mm à chaque extrémité du trabecula pour permettre la fixation. N’étirez pas la trabecula dans la mesure du possible et minimisez le contact des outils métalliques, car les deux peuvent également endommager le muscle. Déplacez les broches qui maintiennent le cœur au besoin pour minimiser la tension sur le muscle près des trabécules identifiées.
- Couper ~ 2 pouces de l’extrémité d’une pipette de transfert de 7 mL, aspirer lentement la trabecula dans la pipette et la transférer dans un nouveau plat de pesée contenant 50% de solution de perfusion et 50% de solution de Tyrode modifiée. Laissez le muscle s’équilibrer à l’augmentation du calcium extracellulaire dans la solution mélangée pendant plusieurs minutes.
- Répétez les étapes 3.7 à 3.8 pour disséquer des trabecula supplémentaires à ce stade, afin d’obtenir des trabecula supplémentaires en tant que sauvegarde.
- Éteignez la pompe fournissant la surfusion et/ou l’aspiration à la chambre expérimentale. À l’aide de la pipette de transfert de grand alésage, déplacez la trabecula dans la chambre expérimentale remplie de la solution de Tyrode.
- Épinglez un morceau de tissu cube de >1 mm à l’extrémité de la trabecula à un crochet du capteur de force, puis épinglez le deuxième cube au moteur.
REMARQUE: Séparez le moteur et le capteur de force lors du montage du premier côté pour un meilleur accès au transducteur, puis déplacez les crochets aussi près que possible lorsque vous montez le deuxième cube de tissu pendant que la trabecula reste relâchée. - Redémarrez la superfusion et commencez à rythmer le muscle pour déterminer la tension de seuil. Marcher à 20% au-dessus de la tension seuil pendant environ 1 h pour permettre à la trabecula de s’équilibrer.
- À la fin de cette période d’équilibre, étirez lentement le muscle à l’aide du micromètre connecté au moteur jusqu’à ce que la génération de stress développée optimale soit atteinte, en observant la tension développée (minimale à maximale). Arrêtez d’augmenter la longueur musculaire lorsque la tension diastolique passive augmente plus rapidement que la tension maximale, indiquant que la longueur optimale a été dépassée.
- Éteignez l’éclairage transmis du microscope et illuminez le trabecula à l’aide d’un illuminateur à col de cygne à un angle raide. À l’aide d’une caméra connectée via l’optique du microscope qui a déjà été calibrée, capturez une image de la trabecula pendant la diastole dans le dossier expérimental. Si le trabecula est plus large que le champ de vision de la caméra, prenez plusieurs images à travers le muscle.
- Ouvrez la ou les images dans un logiciel d’imagerie qui signale les distances en pixels.
- Mesurez la distance en pixels du diamètre du muscle quatre fois sur sa longueur. Mesurez la longueur du muscle (trabécule) en pixels, à l’exclusion du grand cube de tissu.
- Si la longueur du muscle est plus longue que le champ de vision, utilisez des points de référence le long du muscle pour mesurer toute la longueur.
- À l’aide du modèle du dossier expérimental, faites la moyenne des mesures de diamètre et convertissez le diamètre et les longueurs de pixels en mm à l’aide d’un étalonnage obtenu précédemment. Calculez la section transversale comme π*diamètre 2/4 en mm2, et la longueur du muscle en μm.
4. Acquisition de données
- Une fois le muscle équilibragé, ouvrez le logiciel d’acquisition de données, sélectionnez Expériences | Contrôle de la longueur, puis entrez la longueur trabecula étalonnée (FL) et la section transversale (zone [m2]) dans la case Étalonnage.
- Dans le dossier du modèle (étape 1.7), assurez-vous que le freeform_file.txt pointe vers le dossier approprié et ouvrez le fichier freeform.dap dans un éditeur de texte. Définissez le niveau isotonique (isoton) sur 32 000 dans le fichier *.dap.
- Dans la zone Contrôle de longueur, sélectionnez l’onglet Forme libre et accédez au fichier de liste Freeform approprié. Assurez-vous que le chemin d’archivage des données est également le dossier approprié pour enregistrer les données. Commencez à acquérir des données à partir de secousses entièrement isométriques en appuyant sur Run Experiment, avant d’acquérir des données de pince de charge à l’aide d’un contrôle de rétroaction avec des paramètres de gain proportionnels et d’intégration.
- Acquérir des données de compression de charge en définissant la postcharge (isoton) dans le fichier *.dap et itérez les valeurs de gain proportionnel (propgain) et d’intégration (Ki) en enregistrant le fichier dans l’éditeur de texte. Appuyez sur Run Experiment dans l’interface du logiciel d’acquisition de données.
- Assurez-vous que la pince comprend un rallongement à sa longueur initiale (parfois appelée charge de relaxation 5) au cours de cette itération pour atteindre la plage maximale de vitesses de déformation, en réglant le mode (flswitch) de un et en augmentant le seuil de fin de la pince de charge (flthreshold) à partirde zéro.
- Contrôlez l’extrémité de la pince de charge en changeant le mode (flswitch) de un à zéro. Répétez l’acquisition tout en changeant l’extrémité de la pince de charge de l’allongement zéro à l’allongement complet à la longueur de départ.
- Pour augmenter la longueur, augmentez progressivement le seuil de fin de la pince de charge (flthreshold) de zéro jusqu’à ce que le muscle revienne presque à sa longueur initiale.
- Réinitialisez le mode (flswitch = 1) et le seuil (flthreshold = 0), puis exécutez une dernière acquisition de données.
- Si vous le souhaitez, modifiez la postcharge dans l’étude en répétant les étapes 4.4-4.6. Cette acquisition peut se faire immédiatement.
- Si vous le souhaitez, modifiez la précharge en étirant ou en raccourcissant le muscle, ou traitez le muscle en ajoutant des composés à la solution de Tyrode. Si vous modifiez la précharge ou ajoutez des composés, attendez au moins 20 minutes pour vous assurer que la réponse de force lente 9,15 s’est stabilisée et/ou que le composé pénètre complètement dans le muscle.
- Une fois l’acquisition de données terminée, retirez la trabécule. Si nécessaire, congelez ou fixez le trabecula pour analyse biochimique ou histologique.
- Nettoyez les zones de travail et le système expérimental, rincez tous les tubes avec de l’eau et éteignez tous les composants.
5. Analyse des données
- Ouvrez les fichiers de données à l’aide d’un programme d’analyse quantitative en dirigeant le programme vers le chemin de fichier approprié.
- Quantifier la relaxation en s’assurant que le programme d’analyse des données analyse le battement serré et que le programme acquiert correctement le début de la pince de charge.
- S’assurer que l’extrémité de la pince de charge est identifiée, de sorte que le taux de relaxation (1/τ) soit quantifié à partir de la dérivée négative de crête de la contrainte lors d’une relaxation isométrique.
- Utiliser la méthode de Glantz16 pour déterminer cette constante de temps exponentielle, ou une autre quantification appropriée de la relaxation (dérivée minimale de contrainte, constante de temps logistique 17 ou modèle cinématique18).
- Assurez-vous que le programme d’analyse des données calcule le taux de déformation en prenant la dérivée temporelle de la déformation, où la déformation est calculée comme la longueur en fonction du temps divisé par la longueur à la contraction optimale.
- Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les traces d’une condition donnée.
- Tracer la relation entre le taux de relaxation et le taux de déformation, en limitant les données maximales à un taux de déformation physiologique inférieur à 1 s-1. Exclure les données à faibles taux de déformation (figure 4C), car la phase de relaxation peut ne pas refléter la décroissance exponentielle17,18.
- Obtenez la pente de la ligne entre le taux de relaxation et la vitesse de déformation, et notez la pente comme indice de MCR.
- Répétez l’analyse ci-dessus pour chaque condition interrogée.
Résultats
Un ensemble de données représentatif est présenté à la figure 4, et des résultats supplémentaires peuvent être trouvés dans les publications antérieures 8,9. En bref, le taux de déformation est calculé à partir de la dérivée de la déformation, juste avant la relaxation isométrique. La déformation est la longueur en fonction du temps divisée par la longueur du muscle à la longueur optimale. Le taux de relaxation est calculé comme 1/τ, où τ est la constante de temps exponentielle16. Des vitesses de déformation multiples et les vitesses de relaxation qui en résultent sont nécessaires pour déterminer le contrôle mécanique de la relaxation (MCR). Ces données sont tracées sur un graphique du taux de relaxation en fonction du taux de déformation. La pente de la ligne fournit l’indice MCR.
Notez que les taux de déformation systolique et diastolique terminale ne sont pas susceptibles de dépasser 1 s-1. Par conséquent, la pente ne doit inclure que les taux de déformation < 1 s-1. Le taux de relaxation à de faibles taux de déformation peut être confondu par des changements dans la dérivée temporelle minimale de la contrainte (dStress/dtmin) et, dans ces cas, les données provenant d’étirements inférieurs à environ 0,15 s-1 peuvent être ignorées.
Figure 1 : Configuration de la zone de dissection macroscopique et de canulation cardiaque. De droite à gauche : a. La chambre d’induction de l’anesthésie pour l’animal est située près de la zone de dissection. b. Un tuba pour le piégeur de gaz volatils en option. c. Un coussin de dissection, où l’animal sera placé couché sur le dos, est flanqué (dans le sens des aiguilles d’une montre) d. d. un nez, pour fournir une anesthésie continue au rongeur, e. hémostatiques, f. ciseaux chirurgicaux, g. ciseaux fins incurvés placés pour un accès facile avec la main dominante (coupante), h. pinces à iris incurvées placées pour un accès facile avec la main non dominante. Les membres supérieurs du rongeur peuvent être fixés au tampon de dissection à l’aide de ruban adhésif, et i. une boîte de dissection (ou un petit bécher) avec une solution de perfusion doit être placée à proximité pour rincer le cœur. j. Une zone aménagée pour la canulation doit être placée à proximité. Une seringue avec une canule appropriée est montée sur un support annulaire. k. (Encadré) Image plus rapprochée d’une canule de 16 G, avec 1 mm de tube PE205 attaché et une suture lâchement nouée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Zone expérimentale et outils. (A) Zone expérimentale. La chambre expérimentale et le système d’acquisition de données sont préparés sur un microscope inversé voisin (à gauche). L’isolation et le montage de Trabecula se font sous un stéréoscope (à droite). (B) Les pointes de deux pinces, de grands et petits ciseaux Vannas, et une sonde en verre personnalisée sont préparées par trempage dans une solution BSA à 10%. (C) Outils de dissection supplémentaires. Une antenne parabolique en silicone élastomère permet de monter le cœur lors d’une dissection fine. Une pipette de transfert de 7 ml avec la coupe d’extrémité est montrée sous la capsule et la sonde en verre. L’extrémité coupée de la pipette de transfert est jetée et un alésage élargi est utilisé pour transférer le muscle, avec un risque minimal d’étirement ou de déshydratation. D) Image agrandie de l’extrémité d’une pipette en verre, d’environ 2 mm de long et de 0,25 à 0,5 mm de diamètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Guide de dissection. (A) La dissection grossière doit commencer par une coupe transversale (1. vert) à travers la peau dans la cavité péritonéale sous le processus xyphoïde (les côtes inférieures et les xyphoïdes sont indiquées par une fine ligne grise). Des coupes parasagittales de la cavité péritonéale jusqu’à la cage thoracique doivent suivre (2. sarcelle et 3. lignes bleues), après quoi le diaphragme doit être coupé. Un hémostatique peut ensuite être utilisé pour serrer le processus xyphoïde et élever la paroi thoracique vers la tête. (B) Un cœur de rat intact épinglé à une boîte en silicone-élastomère, orienté vers une vue de la voie de sortie ventriculaire droite (RVOT), de l’oreillette droite (RA), de l’aorte (Ao) et de l’oreillette gauche (LA). La première série de coupes devrait aller du RVOT à l’apex le long du septum (1. Ligne jaune). Une deuxième série de coupures devrait être faite à partir du RVOT le long de la base du cœur, puis à travers l’oreillette droite (2. ligne orange). (C) Le RVOT peut être soigneusement retiré de l’aorte pour ouvrir le cœur et l’épingler. Les lignes jaune et orange correspondent aux coupes décrites au point B. Les trabécules autoportantes se trouvent souvent près de la base du mur libre du VR et près du septum, mais peuvent se produire n’importe où (les lignes rouges indiquent des emplacements communs). (D) Vue agrandie de la sonde de verre sous une trabecula (la flèche jaune indique l’intersection de trabecula et de sonde). (E) Une trabecula (flèche rouge) est montée sur le système expérimental entre un capteur de force (à gauche) et un moteur (centre-droit), et est flanquée de deux fils de stimulation (horizontaux au-dessus et au-dessous de la trabécule). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Traces et résultats représentatifs. (A) Une seule trabecula cardiaque éclairée à l’aide d’une lumière LED à col de cygne à un angle raide (~75°) par rapport à l’axe de la lentille du microscope, ce qui améliore le contraste de la trabécule. Dans cet exemple, deux images sont carrelées pour montrer toute la longueur de la trabécule. (B) Courbes temps-contrainte (en haut) et en temps de déformation (en bas) pour la même trabécule. Une contraction isométrique, ainsi que trois secousses de pince de charge à des vitesses de déformation systolique croissantes sont représentées. (C) Calcul du MCR représentatif. La TCM est définie comme la pente de la ligne entre la vitesse de relaxation et la vitesse de déformation. Comme il a été noté dans la discussion, les taux de déformation peuvent être limités pour fournir un TCM quantitatif et reproductible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Solutions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Le contrôle mécanique de la relaxation (MCR) quantifie la dépendance du taux de relaxation myocardique sur le taux de tension du muscle procédant à la relaxation 8,9. La vitesse de déformation, plutôt que la postcharge, est à la fois nécessaire et suffisante pour modifier la vitesse de relaxation8. Comme il n’a pas été prouvé que les interventions visant à modifier le taux de calcium améliorent considérablement la relaxation cardiaque, l’intervention mécanique peut fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et fournir un nouveau traitement pour la dysfonction diastolique.
Le protocole de modification de la vitesse de déformation myocardique décrit ici utilise une pince de charge isotonique 8,9. Une force de la pince de charge isotonique est le contrôle quantitatif de la contrainte de postcharge. Des protocoles de type Windkessel pourraient être utilisés pour sonder davantage les changements dans la postcharge, la précharge et le travail cardiaque 2,6,7. Une rampe non contrôlée par la pince de charge pourrait également être utilisée pour mieux isoler le changement de déformation de la vitesse de déformation. Quoi qu’il en soit, la postcharge elle-même ne semble pas être un modificateur fort du taux de relaxation8.
Le protocole peut également être adapté pour aborder des conditions plus physiologiques pour la température et la cadence. Les détails du protocole actuel ont été utilisés pour montrer la présence du MCR. Il est généralement recommandé de mener des expériences dans des conditions physiologiques, selon la question expérimentale. Cependant, les expériences effectuées à 37 °C, ou à des taux de stimulation élevés, peuvent induire plus rapidement une diminution (dommage) du muscle. Une solution avec une capacité de transport d’oxygène améliorée peut être nécessaire. De plus, l’acquisition de données doit être capable d’échantillonner la longueur et la force assez rapidement pour résoudre les secousses rapides et fournir un contrôle de rétroaction.
Le protocole actuel ne décrit pas la mesure du calcium ni la mesure et le contrôle de la longueur des sarcomères. Les mesures du calcium ont été abordées dans d’autres protocoles11, tandis que la mesure de la longueur du sarcomère peut être ajoutée avec l’équipement approprié. Le contrôle de la longueur du sarcomère n’est pas utilisé dans les études MCR actuelles, car la longueur musculaire est le paramètre le plus corrélatif à l’état clinique19. Un contrôle plus poussé de la longueur du sarcomère (par rapport au contrôle de la longueur musculaire) fournirait des réponses spécifiques aux questions cinétiques, mais il est peu probable qu’il ajoute aux connaissances translationnelles en raison de la variation inter-sarcomère et de la compréhension minimale des changements de longueur du sarcomère in vivo.
Trois considérations expérimentales sont mises en évidence ici pour augmenter la reproductibilité des données.
Premièrement, les trabécules cardiaques autonomes peuvent être difficiles à trouver chez certains animaux (résultats et communications non publiés). Alors que les muscles contractés peuvent être trouvés chez la plupart des rats, un taux de réussite raisonnable pour obtenir des données de trabecula chez les rats est d’un sur trois. Le succès de Trabecula peut être plus élevé avec les rats Brown Norway x Lewis F1, qui ont également été utilisés historiquement20 et ont signalé avoir plus de trabécules (communications non publiées). Pour les souris, les taux de réussite sont susceptibles d’être plus faibles, avec moins d’une sur 10 attendue pour les souris d’un fond BL/6; cependant, on s’attend à un taux plus élevé pour les souris issues d’un fond FVBN (communications et observations non publiées).
Deuxièmement, les dommages aux muscles peuvent réduire la production. Si les forces développées sont inférieures à 10 mN mm-2 à 25 °C et à une stimulation de 0,5 Hz, les chercheurs peuvent avoir besoin d’effectuer un dépannage pour évaluer si un étirement ou un contact involontaire entre les pinces métalliques et le muscle se produit, si les solutions ne sont pas correctement préparées ou si l’équipement de stimulation ou expérimental fonctionne correctement. D’autres protocoles utilisant du trabecula intact ont suggéré d’utiliser des seringues Luer-lock comme récipients de transfert11. Bien que cela soit possible, surtout si l’utilisateur contrôle un débit très lent ou un segment musculaire plus petit, le protocole actuel utilise une pipette de transfert d’alésage beaucoup plus grande pour minimiser les dommages possibles. Une autre étape où des dommages ischémiques peuvent survenir est pendant la dissection. L’aorte doit être canulée et rincée avec une solution de perfusion dans les 3 minutes suivant la première coupure abdominale (rat) ou la luxation cervicale (souris), comme les limites indiquées dans les protocoles d’isolement des cardiomyocytes21,22. Cela minimise le temps pendant lequel le tissu cardiaque n’est pas exposé à la solution de perfusion de type cardioplégie. De plus, les dissections qui durent plus de 30 minutes ne produisent généralement pas de trabécule tremblante. Ainsi, les opérateurs devraient pratiquer une dissection rapide mais prudente pour minimiser les dommages. Une section transversale supérieure à 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) peut souffrir d’ischémie centrale20.
Troisièmement, la façon dont les muscles sont attachés au moteur et au transducteur de force doit être prise en compte. Ce protocole se concentre actuellement sur les hameçons et les trabécules autonomes. La vitesse de tension parfois rapide de l’étirement avant la relaxation peut faire glisser un muscle s’il n’est pas fixé correctement, c’est pourquoi le protocole actuel n’utilise pas de « paniers » pour maintenir le trabecula23,24. D’autres méthodes de montage (adhésifs, clips, etc25,26) peuvent également être envisagées et validées. Le protocole décrit ici utilise des trabécules et non des muscles papillaires. Les cordes du muscle papillaire induisent une élasticité en série qui peut inhiber les modifications du MCR9. Cependant, il est peu probable que l’emplacement exact des attaches dans le muscle ait un impact sur les mesures, car la longueur (et le diamètre) de la trabecula varie considérablement.
Une limitation du perçage des extrémités musculaires avec des crochets est que le point de montage lui-même peut également être endommagé. Une déchirure possible du tissu musculaire fixé avec des contractions fréquentes (en fonction de leur force) peut modifier la longueur ou l’élasticité de la série. Ce taux de déchirure est difficile à contrôler. De même, les dommages aux tissus et au crochet peuvent être exacerbés pendant l’étirement, ce qui peut également causer des problèmes. L’inspection visuelle et les valeurs de force développées restant >80 % de la force isométrique équilibrée devraient être utilisées pour évaluer si la préparation est endommagée et devraient être exclues.
Une autre limitation ou considération affecte les questions expérimentales auxquelles la méthode peut répondre. Par exemple, considérons l’utilisation du monoxime de 2,3-butanedione (BDM) dans la solution de perfusion. BDM est une phosphatase, qui peut altérer la fonction du muscle. De plus, la longue période de déchargement et l’absence de stimulation signifient que l’état de phosphorylation latente a probablement changé. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence si vous essayez d’évaluer directement la contractilité musculaire d’un animal (par rapport aux différences entre les génotypes ou les traitements), car l’état contractile a probablement changé. Cependant, l’impact de la phosphorylation peut être évalué pharmacologiquement en ajoutant un agoniste ou un antagoniste de la voie.
En résumé, la MCR donne un aperçu de la façon dont la relaxation est régulée par le mouvement musculaire (taux de tension). La MCR peut aider à mieux comprendre le diagnostic et la surveillance de la maladie diastolique, ainsi que des cibles pour une intervention pharmacologique, telle que la modification de la cinétique de la myosine. Le protocole et les conseils décrits ici présentent les connaissances acquises au cours de plusieurs années d’essais et devraient être applicables à d’autres systèmes et modèles de maladies cardiaques.
Remerciements
Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health (1R01HL151738) et l’American Heart Association (18TPA34170169).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguille/canule émoussée de calibre 18 ou 16 pour la | canulation de l’aorte du rat, utiliser 1 mm de tube PE160 ou PE205 comme arrêt | ||
| 2,3-butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| Aiguille/canule émoussée de calibre 23 pour la | canulation de l’aorte de souris, utiliser 1 mm de tube PE50 comme arrêt | ||
| Seringue | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95 % d’oxygène/5 % de CO2 | AirSystème | ||
| gaz EZ Systems | EZ-SA800 | Peut utiliser n’importe quelle méthode/système d’anesthésie approprié | |
| Albumine sérique bovine | Fisher BioReagents | BP-1600 | pour enrober les pointes des forcepts fins, ciseaux |
| Chlorure de calcium Dihydraté | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Contenants/ Boîtes de dissection | FisherBrand | 08-732-113 | Boîtes de pesée pour la création de plaques de dissection |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | pour la dissection macroscopique |
| de souris D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Logiciel d’acquisition de données | SLControl | ||
| Système d’acquisition de données | MicrostarLabs | DAP5216a | Peut utiliser n’importe quelle acquisition de données. Il s’agit d’une acquisition de données basée sur PCI à utiliser avec SLControl ; doit disposer d’un PC avec un emplacement PCI |
| Logiciel d’analyse de données | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x pour la canulation de l’aorte |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x pour l’isolation de la trabécule |
| Système expérimental | Aurora Scientific | 801C | Peut utiliser n’importe quelle chambre expérimentale appropriée avec contrôle de la force et de la longueur |
| Ciseaux fins, incurvés | Outils de science fine | 14061-09 | pour l’enlèvement du cœur |
| Col de cygne Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Logiciel d’imagerie | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Instruments de précision | 15915 | pour l’ablation du cœur |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Sulfate | de magnésium Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Ciseaux | Outils scientifiques fins | 14110-15 | pour la dissection grossière du rat |
| Ciseaux Metzenbaum | Outils de science fine | 14116-14 | pour la dissection grossière de souris |
| Caméra connectée au microscope | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Comprend un logiciel d’acquisition |
| Microscope/système d’imagerie numérique | Olympus | IX-73 | Peut utiliser n’importe quel microscope approprié. ; Nécessaire pour mesurer la longueur musculaire, la section transversale |
| Goupille/aiguille de montage | BD PrecisionGlide | 305136 | Pour tenir le cœur dans le plat. ; 27 G x 1-1/4 |
| Goupille/aiguille de montage | Outils scientifiques fins | 26000-40 | Pour tenir le cœur dans le plat. Goupille insecte de 0,4 mm de diamètre (Alt à l’aiguille 27G) |
| Oxygène (O2) | OX USP300 | ||
| Rainin | Rabbit | Peut être n’importe quel moyen de créer un écoulement dans la chambre expérimentale | |
| Capteur de pH et d’oxygène | Mettler Toledo | SevenGo pH et OD | |
| Bicarbonate de potassium | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Chlorure de potassium | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | pour la dissection macroscopique du rat |
| Suture en soie, Taille : 4/0 | Outils de sciences fines | 18020-40 | coupés en morceaux de ~1,5 pouce, trempés dans l’eau |
| Bicarbonate de sodium | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich S9888-1KG | ||
| Hydroxyde de sodium | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Phosphate de sodium dibasique | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stéréomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Ciseaux à ressort ; | Outils scientifiques fins | 91500-09 | pour l’ouverture du RV |
| SYLGARD 184 Base en élastomère de silicone | Dow Corning | 3097358-1004 | Pour la création de plaques de dissection |
| Porte-seringue Harbor | Frieght | Helping Hands 60501 | Peut être utilisé comme alternative pour le support d’anneau |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Pipette de transfert | FisherBrand | 13-711-7M | coupe ~ 1" de la pointe à l’alésage |
| élargi Vannas Ciseaux à ressort | Outils de science fine | 15000-00 | pour l’isolation de la trabécule |
Références
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Réimpressions et autorisations
