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Au cours de la dernière décennie, l’application de la microscopie Raman cohérente (CRM) à l’imagerie cellulaire et tissulaire a suscité un regain d’intérêt 1,2. La CRM est une technique d’imagerie chimique puissante avec deux variantes populaires : la microscopie à diffusion Raman cohérente anti-Stokes (CARS) et la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS). L’ERNS est de plus en plus populaire par rapport aux CARS parce qu’elle est moins affectée par les interférences de fond non Raman et qu’elle dépend linéairement de la concentration3. La CRM acquiert des informations sur les vibrations moléculaires similaires à la spectroscopie Raman, mais offre une vitesse d’acquisition considérablement améliorée4. Ceci est réalisé par une excitation vibratoire cohérente à travers une paire de lasers pulsés à haute intensité de crête. Parce que la CRM fournit une cartographie chimique résolue spatialement à haute résolution spatiale et temporelle, elle a trouvé des applications importantes dans le diagnostic du cancer, le métabolisme des lipides, le métabolisme cellulaire, le transport de médicaments et bien d’autres 5,6,7,8. Cependant, l’un des principaux goulets d’étranglement qui entrave l’adoption généralisée de la technique est sa complexité technique et l’absence de protocoles standardisés. Bien que des lasers et des microscopes commerciaux soient déjà disponibles, presque tous les systèmes actuellement utilisés dans le domaine impliquent divers niveaux de personnalisation des lasers, des optiques, des microscopes et des détecteurs, ce qui crée un obstacle important pour les chercheurs intéressés à entrer dans le domaine ou à adopter cette technologie. Le manque d’accès entrave encore plus les applications biologiques. L’objectif de cette collection de méthodes est de fournir des exemples détaillés et des conseils sur l’instrumentation, les nouvelles approches d’imagerie et les applications d’imagerie cellulaire ou tissulaire in vitro/in vivo. Nous avons inclus sept publications d’experts dans le domaine qui sont résumées ici.
Clark et al. présentent une comparaison côte à côte de la SRS hyperspectrale et de la CARS en termes de sensibilité, de résolution spatiale et de résolution spectrale9. Les deux techniques sont mises en œuvre avec la focalisation spectrale des lasers femtosecondes, une approche couramment utilisée qui utilise les lasers femtosecondes à large bande spectralement déformée pour obtenir une résolution Raman à bande étroite. Une comparaison directe permet d’évaluer les différences de détection et de sélectionner de manière optimale la modalité pour différentes applications d’imagerie chimique.
De la Cadena et al. publient une nouvelle méthode de SRS multiplex qui permet d’acquérir rapidement des images SRS à large bande10. La technique est basée sur une détection d’amplificateur différentiel multicanal à verrouillage personnalisée, qui permet de détecter jusqu’à 32 canaux simultanément. De plus, une caractérisation détaillée du bruit est présentée et une méthode de détection équilibrée est démontrée pour éliminer le bruit laser. Ce protocole fournit des conseils pratiques aux utilisateurs intéressés par la construction de systèmes SRS multiplex.
Shi et al. démontrent l’utilisation de colorants Raman hautement multiplexés dans l’imagerie SRS11. Avec l’amélioration de la pré-résonance, ils démontrent que la SRS pourrait fournir une sensibilité comparable à l’immunofluorescence standard. Cette méthode contourne la limite des canaux spectralement résolvables dans l’immunofluorescence conventionnelle et permet de surveiller de nombreuses protéines simultanément et d’étudier leurs interactions. Des conseils détaillés sur le traitement des échantillons et la coloration à la teinture Raman sont fournis pour faciliter l’adoption de cette méthode puissante.
Miao et al. présentent l’imagerie vibrationnelle des tissus gonflés et l’analyse (VISTA), une technique d’imagerie à super-résolution qui combine la SRS avec la microscopie à expansion12. VISTA contourne les obstacles associés à l’imagerie fluorescente et réalise une imagerie volumétrique à super-résolution sans marquage dans des échantillons biologiques avec une résolution spatiale allant jusqu’à 78 nm. Ils exploitent en outre un algorithme d’apprentissage profond pour réaliser une segmentation à plusieurs composants, y compris des agrégats de protéines dans les cellules et les tissus cérébraux.
Espinoza et al. présentent l’utilisation de l’imagerie SRS bicolore en temps réel des protéines et des lipides pour des applications de diagnostic tissulaire13. L’imagerie SRS bicolore peut générer des images équivalentes à H&E pour les applications de pathologie. Ce protocole décrit les détails de la mise en œuvre d’une technique de modulation orthogonale et de focalisation spectrale pour l’imagerie SRS bicolore simultanée. La conversion d’images SRS bicolores en images pseudo-H&E est également démontrée avec du tissu cérébral de souris pour illustrer les applications de diagnostic tissulaire.
Yuan et al. publient un système de chambre flexible pour l’imagerie SRS à long terme de cellules vivantes14. La plupart des chambres d’observation de cellules vivantes existantes sont conçues pour l’imagerie en fond clair et en fluorescence. Ils sont incompatibles avec la détection SRS en raison de la nécessité d’un objectif à grande ouverture numérique et d’un condenseur. Les auteurs font la démonstration d’une imagerie SRS time-lapse de 24 h avec la chambre flexible, qui a maintenu une température, un CO2 et un taux d’humidité constants.
Enfin, Wu et al. démontrent simultanément la fluorescence à deux photons in vivo (TPEF) et l’imagerie SRS15. Deux systèmes laser distincts sont combinés pour obtenir une sensibilité optimale pour les deux modalités d’imagerie afin de fournir des informations complémentaires. In vivo L’imagerie SRS des tissus présente des défis uniques en raison de la nécessité d’épi-détection de la lumière dépolarisée et rétrodiffusée. Ce protocole traite des détails de la configuration optimale d’un microscope TPEF-SRS et de la manière dont il peut être utilisé pour l’imagerie in vivo de la moelle épinière de la souris.
Cette collection de publications représente l’état actuel de l’instrumentation CRM et les avancées techniques. Les chercheurs qui s’intéressent à la fois au développement de méthodes et aux applications trouveront cette collection utile pour comparer les configurations et établir des points de référence (sensibilité, résolution, etc.) pour la construction ou l’optimisation de leurs propres systèmes. Les lignes directrices et les pratiques exemplaires fournies dans ces protocoles éclaireront les applications in vitro et in vivo actuelles et futures. L’adoption à grande échelle de la technologie CRM attend encore des applications clés et innovantes et la commercialisation de solutions CRM complètes. Néanmoins, la normalisation des approches et des points de référence en matière d’imagerie est essentielle pour assurer la reproductibilité et la fiabilité et faciliter la mise en œuvre à plus grande échelle de la CRM16.
Le domaine du CRM se développe à une vitesse rapide. Les développements techniques repoussant les limites de la sensibilité, de la spécificité et de la résolution continuent de pousser la technologie vers de nouveaux territoires. Par exemple, la résolution spatiale de la SRS commence à dépasser la limite de diffraction 17,18. La sensibilité de la pré-résonance électronique SRS approche maintenant celle de la fluorescence19. Par rapport à la fluorescence, le CRM présente des avantages distincts. Par exemple, l’utilisation du traçage du deutérium a permis d’étudier in vivo la dynamique métabolique de petites molécules à une résolution subcellulaire pour la première fois20. Avec de petites balises, il est possible d’effectuer une détection Raman hautement multiplexée de 24 cibles marquées ou plus21. Les progrès de l’intelligence artificielle offrent de nouvelles capacités pour le CRM en tirant parti de son contenu d’information élevé et de ses caractéristiques spécifiques aux molécules pour segmenter et classer des objets présentant de subtiles différences de caractéristiques spatiales et spectrales22. Ensemble, ces avancées techniques en CRM sont sur le point d’accélérer et d’élargir les applications en imagerie biologique et biomédicale.