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Article de méthode

Mesure de la cinétique du tissu adipeux in vivo chez l’homme à l’aide de l’approche de marquage au deutérium (2H)

721 vues

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DOI :

10.3791/64883

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21 juillet 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

Dans cet article

Résumé

Voici un protocole pour mesurer in vivo la cinétique du tissu adipeux chez l’homme à l’aide de la méthode de marquage au deutérium (2H).

Résumé

Le tissu adipeux blanc est un organe hautement plastique qui est nécessaire au maintien de l’homéostasie énergétique de l’ensemble du corps. La masse du tissu adipeux et les changements dans la masse grasse ou la distribution sont régulés par des changements dans la synthèse et la dégradation (c’est-à-dire le renouvellement) des cellules adipeuses et des triacylglycérols. Les preuves suggèrent que la manière et l’ampleur de l’expansion du tissu adipeux sous-cutané (c’est-à-dire l’hypertrophie par rapport à l’hyperplasie) et le renouvellement peuvent influencer la santé métabolique, car l’adipogenèse a été impliquée dans la pathogenèse de l’obésité et des maladies connexes. Malgré le rôle potentiel du renouvellement adipeux dans la santé humaine, il existe un manque de connaissances sur la cinétique in vivo des cellules adipeuses. Cela est dû, en partie, à la lenteur du taux de renouvellement des cellules dans le tissu adipeux et à la complexité pratique du marquage direct de leurs précurseurs métaboliques in vivo. Nous décrivons ici des méthodes permettant de mesurer in vivo la cinétique adipeuse et les taux de renouvellement chez l’homme par la consommation d’eau marquée au deutérium (2H). L’incorporation de 2H dans les fractions désoxyribonucléotidiques de l’ADN dans les pré-adipocytes et les adipocytes fournit une mesure précise de la formation et de la mort cellulaires (renouvellement adipeux). Dans l’ensemble, il s’agit d’une approche novatrice pour mesurer la cinétique adipeuse in vivo et représente un écart substantiel par rapport à d’autres évaluations in vitro .

Introduction

L’obésité est une maladie caractérisée par un excès de tissu adipeux blanc (TA) et constitue un facteur de risque important pour le développement du diabète de type II et des maladies cardiovasculaires1. Le TA blanc est un organe hautement plastique qui stocke de l’énergie sous forme de triacylglycérols (TG) et est essentiel à l’homéostasie métabolique2. L’AT blanc conserve la capacité de s’étendre, de réduire et de se remodeler à l’âge adulte3, et la masse de l’AT est déterminée par des changements dynamiques du volume des adipocytes (via la synthèse et la dégradation des TG), la formation continue d’adipocytes via la prolifération et la différenciation des pré-adipocytes (c’est-à-dire l’hyperplasie ou l’adipogenèse) et la mort des cellules adipeuses4.

Les preuves suggèrent qu’il existe un lien important entre le renouvellement sous-cutané du TA (par exemple, la formation et la mort des adipocytes) et la santé cardiométabolique 5,6,7,8, et le rôle de l’adipogenèse dans la pathogenèse des troubles liés à l’obésité reste discutable4. Cependant, on sait peu de choses sur le renouvellement in vivo des TA chez l’homme, en partie en raison du faible taux de renouvellement des composants cellulaires des TA et de la complexité du marquage direct de leurs précurseurs métaboliques in vivo. Bien que les méthodes in vitro aient fourni des informations, ces approches ne fournissent pas une évaluation in vivo complète dans le milieu naturel du TA.

Une méthode a été mise au point par le laboratoire Hellerstein9 pour évaluer in vivo le renouvellement de l’AT en utilisant l’incorporation de l’isotope stable deutérium (2H) de l’eau lourde (2H2O) dans l’AT (Figure 1)10. Le protocole, qui a été validé chez la souris et l’homme, comprend une augmentation initiale de 2H2O pour augmenter l’enrichissement en 2H de l’eau corporelle, suivie d’un apport quotidien adéquat pour maintenir des valeurs d’enrichissement stables et proches du plateau. Le 2H du 2H2O (c’est-à-dire l’eau lourde) est incorporé dans le groupement désoxyribose (dR) des désoxyribonucléotides dans l’ADN des cellules adipeuses, et l’enrichissement isotopique est mesuré dans l’ADN par spectrométrie de masse et l’application de l’analyse de distribution isotopomère de masse (MIDA)9,10,11. Le marquage de la fraction désoxyribose des désoxyribonucléotides puriques dans l’ADN avec des précurseurs d’isotopes stables présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes précédentes, telles que celles qui impliquaient le marquage avec des fractions de base nucléotidique de pyrimidine (par exemple, à partir de 3-H-thymidine ou de bromo-désoxyuridine). Il convient de noter que la réincorporation endogène de bases, en particulier pour les pyrimidines, mais pas pour la dR, dans la réplication de l’ADN a précédemment confondu l’interprétation de l’incorporation de marquage12. De plus, l’incorporation d’un marqueur isotopique stable dans dR n’entraîne aucune génotoxicité, contrairement à l’incorporation d’agents radioactifs ou génotoxiques tels que le 3H (tritium) ou la bromo-désoxyuridine. Par conséquent, l’utilisation à long terme de cette technique chez les modèles animaux et les humains est sûre.

La mesure de la synthèse de l’ADN marqué 2H dénote le passage d’une cellule à travers la phase S de la division cellulaire et identifie les pré-adipocytes et adipocytes nouvellement formés (via la différenciation des pré-adipocytes) ou l’adipogenèse13. Les cellules qui subissent un renouvellement rapide (par exemple, les monocytes) remplacent rapidement leur ADN et atteignent un plateau d’enrichissement en 2H, fournissant ainsi une référence interne pour le test. Le rapport entre l’enrichissement en 2H de l’ADN des cellules adipeuses et celui des monocytes (cellules de référence) ou la mesure du corps intégré en 2H2O permet de calculer la fraction de cellules adipeuses nouvellement synthétisées. Ce protocole décrit des méthodes permettant de mesurer les taux de renouvellement cellulaire adipeux in vivo (adipogenèse) chez l’homme via le protocole de marquage métabolique 2H, y compris des techniques raffinées pour purifier les adipocytes par sélection immunitaire négative et enrichir la population pré-adipocytaire14.

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Protocole

L’Institutional Review Board (IRB) du Pennington Biomedical Research Center a approuvé toutes les procédures (#10039-PBRC), et tous les sujets humains ont donné un consentement éclairé écrit.

1. Période d’étiquetage O de huit semaines 2H2

  1. Administrer des aliquotes d’eau marquée au deutérium à 70 % ou à 99,9 % (2H2O) dans des contenants en plastique stériles.
  2. Demandez aux participants de boire des doses de 35 mL de 2H2O enrichi à 99,9 % ou des doses de 40 mL de 2H2O enrichi à 70 % trois fois par jour au cours de la semaine 1 (période d’amorçage) et de boire deux doses de 35 mL ou de 50 mL, respectivement, par jour au cours des semaines 2 à 8.
    REMARQUE : Les étourdissements transitoires ou les vertiges sont les seuls effets indésirables connus de la consommation de 2H2O et sont liés à des changements rapides dans le débit d’eau en vrac, qui sont perçus par les follicules pileux de l’oreille interne. Par conséquent, demandez aux participants de prendre les doses à au moins ~2 heures d’intervalle pour éviter l’apparition rare d’étourdissements transitoires ou de vertiges15. Pour la même raison, ne rattrapez pas les doses oubliées en doublant une seule dose. L’administration de la dose décrite ci-dessus (espacée de ≥2 h) rend cet effet indésirable extrêmement rare chez les sujets humains (<1 % de plusieurs centaines de sujets).
  3. Surveiller le respect de l’apport en 2H2O par des prélèvements urinaires pour mesurer l’enrichissement en 2H dans l’eau corporelle et également par le retour hebdomadaire des flacons vides pour le comptage.
    1. Nettoyez les échantillons d’urine à l’aide de charbon actif et d’un filtre.
      1. Ajoutez 8 ml d’urine dans un tube de 10 ml avec 1 ml de charbon actif.
      2. Placez l’échantillon sur une bascule pendant 10 min et centrifugez-le pendant 5 min à 800 x g afin que le charbon de bois se déplace au fond du tube. Filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.
    2. Mesurer l’enrichissement en 2H2O dans l’eau corporelle (urine) par spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS).
      REMARQUE : L’enrichissement en 2H2O peut être analysé par différentes méthodes, notamment la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse16, l’analyseur élémentaire à conversion à haute température (TC/EA) couplé à l’IRMS17, la spectroscopie infrarouge à anneau de cavité (IRIS)18 ou à l’aide d’un dispositif H/appareil fixé à un spectromètre de masse (p. ex., IRMS)19.
    3. Utilisez les enrichissements moyens en 2H2O mesurés dans l’urine au cours de la période de marquage de 8 semaines pour calculer l’exposition aux précurseurs de 2 H2O et la fraction de cellules AT nouvellement synthétisées (voir les sections 7 et 8 ci-dessous).

REMARQUE : Le protocole d’étiquetage 2H2O maintient un enrichissement en 2H dans l’eau corporelle proche du plateau dans une plage de 1,0 % à 2,5 % pendant la durée de la période d’étiquetage de 8 semaines (figure 2)10.

2. Prélèvements de biopsies de tissu adipeux sur des sujets humains

  1. Après avoir nettoyé la peau avec une solution de povidone iodée, administrez une anesthésie topique (par exemple, 2 % de lidocaïne/0,5 % de bupivacaïne), faites une incision de ~0,75 cm dans la peau et prélevez des biopsies sous-cutanées de l’AT via la technique de lipoaspiration à l’aiguille dans des conditions stériles13.
  2. Peser un tube stérile de 50 mL contenant 5 mL de tampon HEPES 1 M à température ambiante (RT), pH 7,3. Placez immédiatement l’AT dans le tube avec le tampon HEPES pour le traitement.
  3. Pesez le tube de 50 ml contenant l’AT et notez le poids.

3. Isolement des adipocytes purifiés

  1. Ajouter une solution de collagénase de type 1 / HEPES (2 mg / mL) à 2 g / mL d’AT.
  2. Digérer l’AT en l’incubant dans un bain-marie en agitant (100 tr/min) pendant 1 h à 37 °C jusqu’à ce qu’il y ait un mélange homogène avec quelques gros morceaux intacts d’AT.
  3. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 8 min à la RT pour séparer les adipocytes et la fraction stromo-vasculaire (SVF).
  4. Retirez délicatement la couche supérieure de graisse (adipocytes) et transférez-la dans un tube séparé. Ne pas perturber la pastille (SVF) au fond du tube.
  5. Comme décrit précédemment14, purifier les adipocytes en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique.
    REMARQUE : Cette étape importante est effectuée pour « nettoyer » les adipocytes, car d’autres types de cellules à renouvellement cellulaire rapide, y compris les cellules hématopoïétiques, endothéliales et souches, peuvent adhérer aux adipocytes flottants et avoir un impact sur les mesures.
    1. Placez ~400 μL d’adipocytes dans un tube de 5 mL pour une immuno-purification négative.
    2. Ajouter l’anticorps bloquant le FcR (100 μL/mL).
    3. Ajoutez un cocktail d’anticorps biotinylés contre les marqueurs des cellules endothéliales (CD31 anti-humains ; 1:100), des cellules hématopoïétiques (CD45 anti-humains ; 1:400) et des cellules souches mésenchymateuses (CD34 anti-humains ; 1:100) à la solution adipocytaire pendant 15 min à RT.
    4. Ajouter un cocktail de sélection de biotine (100 μL/mL) à la solution adipocytaire, bien mélanger et incuber pendant 15 min à RT avec inclinaison / rotation douce.
    5. Mélangez les nanoparticules magnétiques en pipetant de haut en bas, ajoutez les particules (50 μL/mL) à la solution adipocytaire, mélangez bien et incubez pendant 10 min à RT avec une rotation douce (10 tr/min).
    6. Ajouter le tampon PBS/2 % FBS/1 mM EDTA à la solution adipocytaire pour un volume total de 1 mL.
    7. Placez le tube dans l’aimant et laissez-le reposer pendant 5 min.
    8. Prenez l’aimant et, d’un mouvement continu, retournez l’aimant contenant le tube et versez le contenu dans un nouveau tube de 5 ml. Ne tapotez pas le tube pendant que vous versez. Les cellules attachées aux anticorps sont liées par les nanoparticules magnétiques et éliminées, tandis que les adipocytes immuno-purifiés sont conservés.
    9. Congelez les adipocytes purifiés dans le liquide N2 et conservez-les à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.

4. Isolement des pré-adipocytes

  1. Pour isoler une population enrichie de pré-adipocytes, utilisez un protocole pour exploiter leur capacité à se fixer au plastique après une culture à court terme du SVF20.
  2. Dans une hotte à flux laminaire, remettre en suspension la pastille SVF dans 5 mL de tampon de lyse érythrocytaire pendant 5 à 10 min à RT (bien mélanger) et centrifuger à 800 x g. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 % de FBS dans de l’alpha (α)MEM.
  3. Plaquez les cellules sur une boîte de culture en plastique pendant ~8-12 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et avec une atmosphère de 5 % de CO2 .
  4. Après ~8-12 h, laver délicatement les cellules non adhérentes de la plaque de culture avec du PBS à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
  5. Après avoir aspiré le PBS, ajouter 1 à 1,5 mL de trypsine à 0,25 % / 1 mM d’EDTA dans la boîte de culture pour détacher les cellules adhérentes (population enrichie de pré-adipocytes). Placez la boîte de culture dans l’incubateur à 37 °C pendant ~5-8 min pour aider à soulever les cellules.
  6. Ajoutez 10 % de FBS/αMEM dans la plaque et lavez-la soigneusement pour recueillir toutes les cellules de la plaque. Transférez la solution cellulaire dans un tube de 15 ml ou 50 ml et centrifugez à 800 x g pendant 8 min.
  7. Retirez le surnageant et conservez la pastille (pré-adipocytes) à −80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.

5. Isolement des monocytes sanguins

REMARQUE : Les monocytes sont analysés pour représenter une population cellulaire (presque) complètement retournée, et la mesure de l’enrichissement en 2H dans les monocytes peut être utilisée comme marqueur de référence de l’exposition à 2H2O chez chaque individu. Alternativement, l’enrichissement corporel en 2H2O peut être mesuré et utilisé pour calculer l’expositionà 2 H2O.

  1. Prélevez du sang total frais de sujets humains dans des tubes de vacutainer contenant de l’EDTA.
  2. Centrifuger le sang à 1 000-2 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    REMARQUE : N’utilisez pas le frein.
  3. Retirez la couche supérieure de plasma. Attention à ne pas toucher la couche leucocytaire blanche juste sous le plasma.
  4. Aspirez la couche leucocytaire blanche à l’aide d’une pipette de transfert et transférez-la dans un tube de 50 ml. Ajouter ~10 ml de PBS à la couche leucocytaire.
  5. Ajouter délicatement 10 ml d’un milieu à gradient de densité pour superposer la couche leucocytaire.
    REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de la pipette touche le bas du tube et éjectez-la avec précaution afin qu’il y ait une couche claire de milieu à gradient de densité au fond. Évitez d’introduire des bulles.
  6. Centrifugez le tube à 800 x g pendant 30 min avec le frein desserré.
  7. Pipeter (~10 ml) la couche blanche (fraction mononucléaire), en effectuant des mouvements circulaires avec la pointe de la pipette de transfert près du bord mais sans toucher la couche supérieure. Transférez dans un nouveau tube de 50 ml et ajoutez 10 ml de PBS. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min (ne pas utiliser le frein) et jeter le surnageant.
  8. Ajouter 5 mL de tampon de lyse érythrocytaire à la pastille. Mélangez et laissez reposer 2 min à RT.
  9. Ajouter 5 mL de PBS avec 0,1 % de BSA dans la solution tampon/pastille de lyse érythrocytaire, centrifuger à 800 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
  10. Isolez les monocytes en tant que cellules CD14+ à l’aide de billes immunomagnétiques. Effectuez l’isolement des cellules CD14+ en suivant le protocole du fabricant.
  11. Conservez les monocytes isolés à −80 °C jusqu’à l’extraction de l’ADN.

6. Préparation de l’ADN (isolement, hydrolyse et dérivatisation)

  1. Isolez l’ADN des pré-adipocytes, des adipocytes et des monocytes sanguins à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN en suivant les instructions du fabricant.
  2. Pour libérer les désoxyribonucléosides, hydrolyser enzymatiquement l’ADN (~200 μL) pendant une nuit (pas plus de 24 h) à 37 °C dans 50 μL de cocktail d’hydrolyse enzymatique contenant 1 mL de nucléase S1, 1 mL d’enzyme phosphatase et 36,8 mL de tampon d’hydrolyse 5x dans des tubes en verre à vis de 16 mm x 100 mm (10 mL). De plus, incluez les échantillons suivants : un blanc d’eau, un blanc de cocktail d’hydrolyse, un blanc de colonne du kit d’extraction d’ADN et 500 ng d’étalons d’ADN.
    1. Pour préparer le tampon d’hydrolyse 5x, placez 94 ml d’eau pure de biologie moléculaire dans un bécher stérile. Pesez 3,08 g d’acétate de sodium et 21,5 mg de sulfate de zinc, ajoutez de l’eau et mélangez jusqu’à dissolution. Ajustez le pH à 5,0 avec de l’acide acétique glacial et testez avec du papier pH. Ajouter de l’eau pour atteindre un volume total de 100 ml.
    2. Pour préparer l’enzyme phosphatase, il faut remettre en suspension un flacon de phosphatase acide dans 1 mL d’eau pure.
    3. Pour préparer l’enzyme de nucléase S1 de 0,5 U/μL, diluez 2,5 μL de nucléase S1 dans 2 mL de 1 tampon d’hydrolyse (ajoutez 1 mL de tampon d’hydrolyse 5 x à 4 mL d’eau pure).
  3. Dérivatiser les hydrolysats en dérivés de pentafluorobenzylhydroxylamine (PFBHA). Plus précisément, ajouter les éléments suivants directement aux échantillons d’ADN digérés, y compris les étalons et les blancs, dans des tubes à bouchon à vis de 16 mm x 100 mm (10 ml) : 100 μL de chlorhydrate de pentafluorobenzylhydroxylamine (PFBHA ; 1 mg/mL) et 75 μL d’acide acétique glacial. Vortex (brièvement), bouchez les flacons et placez les échantillons d’hydrolysat sur un bloc chauffant réglé à 100 °C pendant 30 min.
  4. Retirez les échantillons et laissez-les refroidir pendant ~5 min à RT. Après refroidissement, ajouter 2 ml d’anhydride acétique et 100 μL de 1-méthylimidazole dans chaque tube sous une hotte. Placez les tubes sur un bloc chauffant à 100 °C pendant 5 min.
  5. Retirez les échantillons, puis laissez-les refroidir pendant ~15-20 min. Une fois refroidi, ajoutez 3 ml d’eau de biologie moléculaire à chaque échantillon, agitez brièvement et laissez reposer pendant 10 minutes.
  6. Ajouter 2 mL de dichlorométhane (DCM) dans les tubes et agiter vigoureusement les échantillons pendant 15 s pour extraire le dérivé dans la phase organique.
  7. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min pour séparer les phases. Transvaser avec précaution la couche inférieure de dichlorométhane dans un flacon de GC propre de 1,6 ml.
    REMARQUE : Ne transférez aucune partie de la phase aqueuse, car cela augmenterait le bruit de fond.
  8. Évaporer à sec avec de l’azote pendant ~20 min pour éliminer le DCM et l’acide acétique résiduel, suivi d’un séchage de ~10 min dans un vide rapide à RT pour éliminer toutes les traces des réactifs.

7. Analyse de l’ADN par chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse (GC-MS)

  1. Une fois secs, remettre en suspension les dérivés de PFBHA dans 150 μL d’acétate d’éthyle, et boucher. Ensuite, analyser l’incorporation de 2H dans l’ADN sur un instrument de chromatographie en phase gazeuse (GC)/spectrométrie de masse (MS) équipé d’une colonne DB-225 utilisant l’ionisation chimique négative du méthane et collectant les ions en mode de surveillance sélective des ions à m/z 435, m/z 436 et m/z 437 (représentant les isotopomères de masse M0, M1 et M2 , respectivement). Suivez les instructions du fabricant de l’instrument utilisé.
    1. Réglez les conditions GC comme suit : colonne : revêtement de film de 30 m x 0,25 mm de diamètre intérieur x 0,25 μm ; chromatographe : gaz porteur d’hélium à débit constant de 1,0 mL/min ; injections sans division pulsées ; température de l’injecteur : 250 °C ; Ligne de transfert MS : 325 °C ; conditions du four : température initiale 100 °C, maintien 2 min, rampe à 40 °C/min jusqu’à une température de 220 °C, maintien 7,5 min, deuxième rampe à 40 °C/min à 320 °C, maintien pendant 1 min. La durée totale est de 16,0 min. Les temps d’élution typiques de dR sont de 10,5 min et 10,8 min pour le premier et le deuxième pic, respectivement.
    2. Régler les conditions MS comme suit : source d’ionisation chimique négative de méthane avec détection en mode de surveillance d’ions uniques ; ions collectés pour dR : m/z 435, m/z 436 et m/z 437 (représentant respectivement les isotopomères de masse M0, M1 et M2 ).
      REMARQUE : Siliconez le liner en verre ouvert avec un petit bouchon de laine de verre siliconée dans la partie inférieure du tapis. Changez souvent cette doublure (toutes les ~100 injections).
  2. Calculez les rapports d’abondance des isotopomères massiques M1 dans la dérivée dR non enrichie (abondance naturelle) comme suit :
    Rapport M1 = Abondance M1/(somme des abondances M0, M1 et M2)
    Ensuite, soustrayez les rapports d’abondance naturelle M1 des rapports M1 dans le dR des échantillons marqués pour calculer les enrichissements (abondance isotopique en excès, ou %EM1)21.
  3. Mesurer simultanément les abondances massives d’isotopomères des étalons d’ADN de référence (non enrichis) sur une gamme d’abondances d’ions M0 qui couvre la gamme d’abondances d’ions M0 dans les échantillons analysés.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour corriger la « sensibilité à l’abondance » des rapports isotopiques mesurés par GC/MS22.
  4. Construisez un graphique de l’abondance d’ions M0 mesurée par rapport aux rapports M1 de l’isotopomère de masse mesuré dans les étalons non étiquetés afin de déterminer la concentration de l’échantillon sur colonne qui est la plus précise pour l’isotopomère de masse M1 (c’est-à-dire où elle est la plus proche du rapport d’abondance naturelle M1 connu et calculé, ou le « sweet spot »). Le rapport M1 pour ce dérivé dR non enrichi est de 0,1669.
  5. Injectez les échantillons expérimentaux de manière à ce qu’ils soient le plus près possible de ce « sweet spot » dans la zone du pic M0. Utilisez une régression quadratique du rapport M1 des étalons non enrichis par rapport à l’aire du pic M0 pour estimer un rapport M1 « d’abondance naturelle ajusté » pour chaque échantillon à sa concentration particulière de M0. Soustrayez cela du rapport M1 de l’échantillon de cellules adipeuses pour obtenir le pourcentage d’enrichissement supérieur à l’abondance naturelle, ou %EM1 (Figure 3)23.
  6. Calculer l’enrichissement maximal théorique en M1 (EM1*) dans les cellules adipeuses à l’aide des équations24 de l’analyse de distribution isotopomère de masse (MIDA) basées sur l’exposition corporelle à 2H2O (mesurée dans l’urine) intégrée sur la période de 8 semaines (Figure 4) ou les enrichissements en monocytes mesurés provisoirement (étape 7.5).

8. Calcul de la fraction de cellules nouvellement synthétisées, ou adipogenèse in vivo

  1. Calculez la fraction de nouvelles cellules ( %), qui est une mesure de l’adipogenèse in vivo ou de la formation de pré-adipocytes ou d’adipocytes nouvellement synthétisés, à l’aide de la formule suivante :
    Fraction de nouvelles cellules ( %) = [(enrichissement en M1 dans les cellules [adipeuses] de l’échantillon)/EM1* (enrichissement en M1 maximal théorique)] x 100
    REMARQUE : *L’enrichissement en 2H dans les monocytes peut également être utilisé comme dénominateur de l’équation. Cette mesure en monocytes représente un marqueur cellulaire de référence de l’expositionà 2 H2O chez chaque individu et peut être utilisée pour confirmer les calculs de l’enrichissement maximal théorique en M1à partir des valeurs 2 H2O mesurées dans le corps.

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Résultats

Le protocole de marquage 2H2O (section 1) maintient un enrichissement en 2H près du plateau dans l’eau corporelle dans une plage de 1,0 % à 2,5 % pendant la durée de la période d’étiquetage de 8 semaines10, comme le montre la figure 2. Une étude antérieure a utilisé le protocole de marquage 2H2O pour évaluer la cinétique adipeuse via l’incorporation de 2H dans l’ADN des cellules adipeuses, comm...

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Discussion

Les évaluations in vivo sont nécessaires pour fournir de nouvelles connaissances sur la dynamique du renouvellement blanc de l’AT et son rôle dans l’obésité et les maladies métaboliques associées, car les évaluations in vitro n’englobent pas l’environnement naturel de l’AT. Bien que l’utilisation de la datation rétrospective au radiocarbone pour évaluer la dynamique adipeuse ait été informative 7,25, cette appro...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient le noyau de spectrométrie de masse du Pennington Biomedical Research Center.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-méthylimidazoleMilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Anhydride acétiqueAldridge539996
ACK Tampon de lyse (tampon de lyse érythrocytaire)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS  ;Agilent
Anti-humain CD31 (PECAM-1) BiotineInvitrogen13-0319-82
Anti-humain CD34 BiotineInvitrogen13-0349-82
Anti-humain CD45BioLegend304004
Antibiotique Solution antimycosiqueMilliporeSigmaA5955
Collagénase de type 1Worthington Biochimique CorporationLS004196
Deoxyribose (2-désoxy d-ribose)MilliporeSigma31170
Oxyde de deutériumMilliporeSigma756822
colonne DB-225 (30m, 0.25mm, 0.25um)J& W Scientific122-2232
Dichlorométhane (DCM)MilliporeSigma34856
Étalon d’ADN (ADN de thymus de veau)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (kit d’extraction d’ADN)Qiagen69504
Easy Sep Kit de biotine humaineStem Cell Technologies17663
EasySep Human CD14 Sélection positive CocktailStem Cell Technologies18058C
Acétate d’éthyleFisherEX0241-1
Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rondVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
Flacons GC (2 mL)FisherC-4011-1W
Inserts pour flacons GCFisherC-4011-631 ; C-4012-530
Acide acétique glacialFisherAC14893-0010
Tubes en verre (pour l’hydrolyse)Fisher14-959-35AA
Tampon HEPESThermoFisher15630080
Hyclone Eau, qualité biologie moléculaireThomas ScientificSH30538.02
MEM alphaFisher Scientific32561-037
PFBHA (chlorhydrate d’o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzylhydroxylaminMilliporeSigma194484
bandelettes indicatrices de pHFisher987618
Acide phosphataseCalbiochem (VWR)80602-592
Nucléase S1 (d’Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
Sulfate de sodiumMilliporeSigma23913
)

Références

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