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Article de méthode

Surveillance des changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine lors d’une infection virale à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance

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DOI :

10.3791/64887

⸱

5 mai 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Dans cet article

Résumé

La présente étude décrit un protocole permettant de surveiller les changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) au cours d’une infection virale à l’aide d’un système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA).

Résumé

Les cellules endothéliales tapissent la surface interne de tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques, créant une barrière semi-perméable régulant les échanges de fluides et de solutés entre le sang ou la lymphe et leurs tissus environnants. La capacité d’un virus à traverser la barrière endothéliale est un mécanisme important qui facilite la dissémination du virus dans le corps humain. De nombreux virus altèrent la perméabilité endothéliale et/ou provoquent une perturbation de la barrière cellulaire endothéliale pendant l’infection, ce qui peut provoquer des fuites vasculaires. La présente étude décrit un protocole d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA), utilisant un analyseur cellulaire commercial en temps réel pour surveiller l’intégrité endothéliale et les changements de perméabilité pendant l’infection par le virus Zika (ZIKV) des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Les signaux d’impédance enregistrés avant et après l’infection par le virus Zika ont été traduits en valeurs d’indice cellulaire (IC) et analysés. Le protocole RTCA permet de détecter des effets transitoires sous forme de changements morphologiques cellulaires lors d’une infection virale. Ce test pourrait également être utile pour étudier les changements dans l’intégrité vasculaire des HUVEC dans d’autres configurations expérimentales.

Introduction

Les cellules endothéliales (CE) tapissent la surface interne de tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Ils sont reliés par des adhérents, des jonctions lacunaires serrées, créant une barrière semi-perméable entre le sang ou la lymphe et les tissus environnants 1,2. Les jonctions cellule-cellule endothéliale intactes sont essentielles pour réguler le transport des macromolécules, des solutés et des fluides, ce qui est crucial pour les activités physiologiques des tissus et organes correspondants3. La barrière endothéliale est dynamique et modulée par des stimuli spécifiques4. La perturbation ou la perte de la fonction de barrière endothéliale est une caractéristique de la physiopathologie de la maladie dans l’inflammation aiguë et chronique dans la pathogenèse de nombreuses maladies 5,6,7, y compris l’infection virale 8,9,10,11. Pour les flavivirus, il a été constaté que la protéine non structurale NS1 peut modifier la perméabilité endothéliale, par exemple, via une perturbation de la couche endothéliale de type glycocalyx en raison de l’augmentation de l’expression et de l’activation de la cathepsine L, des sialidaides et de l’endoglycosidase héparinase9. À l’état pathologique, l’intégrité de la monocouche endothéliale est affectée et les jonctions cellule-cellule sont perturbées, ce qui peut entraîner des lésions et des dysfonctionnements endothéliaux12 et, éventuellement, des manifestations pathologiques généralisées dans plusieurs systèmes d’organes 13,14. L’infection virale des CE entraîne des modifications des voies de signalisation cellulaire et du profil d’expression des gènes cellulaires, ce qui peut affecter les fonctions de barrière liquidienne, provoquer une perturbation des CE et induire des fuites vasculaires10,15. Il a été démontré que l’infection par le virus Zika (ZIKV) des CE perturbe l’intégrité jonctionnelle qui provoque des changements dans la perméabilité vasculaire et entraîne un dysfonctionnement de la barrière endothéliale, entraînant des fuites vasculaires10,15. Des études ont montré que le virus Zika est lié à de graves malformations congénitales ; Cependant, on ne sait pas grand-chose sur le mécanisme exact par lequel cela se produit16,17. Il est donc essentiel de comprendre les changements de la barrière endothéliale au cours d’une infection pour comprendre le mécanisme de la maladie.

Les CE sont actuellement utilisées comme un important système modèle vasculaire expérimental in vitro pour divers processus physiologiques et pathologiques 18,19,20,21. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été largement utilisées comme système cellulaire primaire non immortalisé pour étudier l’endothélium vasculaire et la biologie vasculaire in vitro 22,23,24,25. Les HUVEC ont été isolés pour la première fois pour la culture in vitro au début des années 1970 à partir de la veine ombilicale du cordon ombilical humain26. Les HUVEC ont une morphologie en forme de pavé qui se fait facilement proliférer en laboratoire. En raison de la contrainte de cisaillement après avoir été maintenue pendant de longues périodes à l’état confluent, un allongement de la forme de la cellule est observé. Les HUVEC peuvent être caractérisés par la présence de corps de Weibel et de Palade (WPB), de vésicules pinocytaires, de petites quantités de fibrilles situées près du noyau, de mitochondries de formes tubulaires qui présentent rarement des ramifications, un noyau ellipsoïde avec un fin motif granulaire de chromatine condensée et un à trois nucléoles présents dans chaque noyau27. Bien que les HUVEC présentent de nombreuses caractéristiques morphologiques, l’identification des HUVEC ne peut être réalisée par le seul examen optique. Des dosages, tels que la coloration par immunofluorescence de l’endothélium vasculaire (VE)-cadhérine, sont couramment utilisés pour la surveillance de l’intégrité vasculaire dans les HUVEC 28,29,30,31.

Cette étude décrit le protocole d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) de l’infection des HUVEC. Le système RTCA utilise des plaques spécialisées recouvertes d’or contenant des microélectrodes qui fournissent une surface conductrice pour la fixation de la cellule. Lorsque les cellules se fixent à la surface de la microélectrode, une barrière qui empêche le flux d’électrons à travers les microélectrodes se forme. La mesure de l’impédance générée par les microélectrodes peut être utilisée pour obtenir des informations sur certains processus cellulaires, notamment les attachements cellulaires, la prolifération et la migration32. Le test rapporté est un test cellulaire basé sur l’impédance qui, couplé à un analyseur de cellules en temps réel, fournit une mesure continue de la prolifération des cellules vivantes, des changements morphologiques (tels que le rétrécissement cellulaire) et de la qualité de l’attachement cellulaire de manière non invasive et sans marquage. Dans cette étude, l’analyseur cellulaire en temps réel est utilisé pour surveiller l’intégrité endothéliale et les changements morphologiques des HUVEC pendant l’infection par le virus Zikv. En bref, l’instrument mesure le flux d’électrons transmis dans des plaques de microtitration spécialisées recouvertes de microélectrodes d’or en présence d’un milieu de culture (solution conductrice d’électricité). L’adhérence cellulaire ou les changements dans le nombre et la morphologie des cellules perturbent le flux d’électrons et provoquent des variations d’impédance qui peuvent être capturées par l’instrument (Figure supplémentaire 1). La différence entre la croissance, la prolifération et l’observance du HUVEC avant et après l’infection par le virus Zika est enregistrée en temps réel par un signal d’impédance électrique, puis traduite en valeur d’indice cellulaire (IC). La valeur de l’IC de la pré-infection est utilisée comme base de référence pour la normalisation de la valeur de l’IC. Les changements dans les valeurs de l’IC reflètent des changements morphologiques cellulaires ou une perte d’adhérence cellulaire lors de l’infection33. Les résultats de l’étude montrent que le protocole RTCA permet de détecter des effets transitoires ou des changements morphologiques cellulaires au cours d’une infection virale par rapport à un test final, tel que la coloration par immunofluorescence de la VE-cadhérine. La méthode RTCA pourrait être utile pour analyser les changements de l’intégrité vasculaire HUVEC lors d’une infection par d’autres virus.

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Protocole

1. Préparation des cellules

  1. Préparation des HUVEC
    1. Cultiver 7,5 x 105 cellules HUVEC/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75cm2 (enrobé de 20 μg/mL de collagène de type 1) contenant 12 mL de milieu de cellules endothéliales (MEC) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 0,01 % de supplément de croissance de cellules endothéliales (ECGS) contenant des facteurs de croissance, des hormones et des protéines nécessaires à la culture de HUVEC, et 0,01 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 (Figure 1).

2. Mise en place de l’expérience RTCA

  1. Vérification de la résistance exécutée sur RTCA
    1. Double-cliquez sur l’icône du logiciel RTCA sur le bureau pour lancer l’application. Une fenêtre de connexion apparaîtra, tapez le nom d’utilisateur et le mot de passe pour vous connecter.
    2. Placez une plaque de résistance RTCA à 96 puits avec le puits A1 orienté vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Dans l’onglet Exp Notes du logiciel RTCA, tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil (plaque de contrôle qualité).
    4. Dans l’onglet Mise en page sous l’onglet Cellule du logiciel RTCA, mettez en surbrillance tous les puits et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés (grisés).
    5. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Step_1. Entrez les balayages : 10 et l’intervalle : 30 s. Cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel pour lancer l’exécution de la vérification.
      REMARQUE : Assurez-vous que la connexion des puits à la station RTCA est correcte en observant « Plaque balayée. Connexions OK » en bas de la page.
  2. Exécution de vérification de la résistance pour l’analyse des données
    1. Dans l’onglet Index des cellules , vérifiez les données à la fin de l’exécution. Toutes les valeurs de l’IC doivent être inférieures à 0,063.
    2. Dans la partie inférieure de l’onglet Index des cellules , vérifiez les données brutes de numérisation. Les données brutes de numérisation doivent présenter des modèles de valeurs répétées de 40,0 ± 2,0 (rangées A et H), 67,5 ± 2,5 (lignes B et G), 93,6 ± 2,9 (lignes C et F) et 117,6 ± 3,2 (lignes D et E).
    3. Pour arrêter l’exécution de la vérification, cliquez sur Plaque > Plaque de dégagement. La plaque de résistance RTCA à 96 puits est maintenant prête à être retirée de la station RTCA.
  3. Obtenir une lecture de fond sur le RTCA
    1. Lavez la plaque de microélectrode d’or spécialisée recouverte de collagène de type 1 (recouverte de 20 μg/mL de collagène de type 1) avec 60 μL/puits de solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; avec bicarbonate de sodium, sans chlorure de calcium ni sulfate de magnésium) 2x.
    2. Jeter le reste de l’HBSS et ajouter 50 μL/puits d’ECM. Placez la plaque de microélectrode en or spécialisée contenant l’ECM avec le puits A1 orienté vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Dans l’onglet Exp Notes du logiciel RTCA, tapez le nom de l’expérience, le numéro de série de l’appareil et le type d’appareil (format 96 puits).
    4. Dans l’onglet Mise en page sous l’onglet Cellule du logiciel RTCA, mettez en surbrillance les puits qui seront utilisés et cliquez avec le bouton droit de la souris sur les puits en surbrillance pour vous assurer que tous les puits sont activés (grisés).
    5. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Step_1, puis sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel pour obtenir une lecture en arrière-plan.
      REMARQUE : Assurez-vous que la connexion des puits est correcte en observant « Plaque balayée. Connexions OK » en bas de la page.
    6. Une fois la lecture de fond obtenue, la plaque de microélectrode d’or spécialisée est maintenant prête pour l’ensemencement des cellules et prête à être retirée de la station RTCA.
  4. Préparation HUVEC dans la plaque de microélectrode d’or spécialisée
    1. Ensemencer les HUVEC dans la plaque de microélectrode d’or spécialisée avec 50 μL/puits de milieu conditionné, 1 x 104 cellules/puits (milieu conditionné : ECM complété par 10 % de FBS, 0,01 % d’ECGS et 0,01 % de P/S). Replacez la plaque dans la station RTCA avec le puits A1 orienté vers l’intérieur pour une incubation de nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Une numération cellulaire a été effectuée sur la suspension cellulaire avec un facteur de dilution de deux à l’aide d’un hémocytomètre.
    2. Dans l’onglet Planification , cliquez sur Ajouter une étape dans le coin supérieur gauche. Cliquez sur Step_2 et modifiez les balayages : 601 et l’intervalle : 2 min. Cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Step_2 et cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel.
    3. Après 20 h d’incubation et lorsque les valeurs de l’IC dans l’onglet Well Graph montrent un plateau, la plaque est prête pour l’infection. Dans l’onglet Planification du logiciel RTCA, cliquez sur Étape d’abandon.
    4. La plaque de microélectrode en or spécialisée est maintenant prête à être retirée de la station RTCA pour les étapes suivantes.

3. Infection virale chez les HUVEC

  1. Dilution du virus
    1. La culture souche de ZIKV est maintenue à -80 °C. Pour cette étude, retirer le stock de virus conservé dans les flacons cryogéniques et diluer le stock de virus Zika avec de l’ECM sans sérum dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL pour obtenir une multiplicité d’infections (MOI) de 0,1 et 1.
      NOTA : Le stock de virus Zika a été préalablement préparé en multipliant dans des cellules Vero et en récoltant le surnageant du virus Zika34.
  2. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer et jeter le milieu conditionné (ECM complété par 10 % de FBS, 0,01 % d’ECGS et 0,01 % de P/S) de chaque puits. Rincez chaque puits avec 60 μL de HBSS 2x. Insérez le HBSS à l’aide du côté du puits ; Ne tirez pas sur la monocouche de cellule.
    2. En travaillant de la dilution la plus élevée à la plus faible, ajoutez 40 μL de chaque échantillon de virus dilué dans une MEC sans sérum dans le puits. Triplicer le puits pour chaque dilution et maintenir six puits sans infection (thrombine témoin négative et thrombine témoin positive). Ne tirez pas sur la monocouche de cellules ; Au lieu de cela, ajoutez le virus dilué à l’aide du côté du puits. Utilisez un embout de pipette neuf pour chaque insertion.
      REMARQUE : La thrombine a été choisie comme témoin positif car elle peut augmenter rapidement la perméabilité endothéliale des HUVEC.
    3. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2 pour permettre l’adsorption du virus. Agitez la plaque 5 fois toutes les 15 minutes pour permettre l’adsorption du virus dans toute la monocouche cellulaire.
  3. Ajout du milieu de culture cellulaire de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirez et jetez la suspension virale de la concentration la plus faible à la plus élevée.
    2. Laver les cellules infectées avec 60 μL de HBSS 2x. Recouvrir le puits d’ECM complété par 2 % de FBS. Pour les puits témoins positifs, diluer la thrombine à 20 U/mL avec de l’ECM additionnée de 2 % de FBS, et recouvrir les puits d’un milieu ECM contenant de la thrombine. Ne tirez pas sur la monocouche de cellules ; Au lieu de cela, ajoutez un média de recouvrement à l’aide du côté du puits.
  4. Repositionnement de la plaque de microélectrode d’or spécialisée infectée dans la station RTCA
    1. Dans l’onglet Planification , cliquez sur Ajouter une étape dans le coin supérieur gauche. Cliquez sur Step_3 et modifiez les balayages : 3 601 et l’intervalle : 2 min. Cliquez sur Appliquer.
    2. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche. Placez la plaque de microélectrode en or spécialisée infectée avec le puits A1 tourné vers l’intérieur dans la station RTCA située dans l’incubateur de culture cellulaire.
    3. Cliquez sur Step_3 et cliquez sur Démarrer/Continuer dans le coin supérieur gauche du logiciel.

4. Analyse des données et exportation des données

  1. Ajout d’informations expérimentales pour chaque puits
    1. Dans l’onglet Layout (Mise en page ), cliquez sur l’onglet Cell (Cellule) (Figure 2A). Pour entrer les informations de la cellule cible et déterminer le type de puits pour chaque puits, mettez en surbrillance le puits et tapez le nom, le numéro et la couleur de la cellule cible en bas du logiciel. Cliquez sur Apply (Appliquer ) (Figure 2B).
    2. Pour sélectionner et déterminer le type de puits pour chaque puits dans l’onglet Cellule , mettez le puits en surbrillance, sélectionnez le type de puits (échantillon, témoin positif ou contrôle négatif), puis cliquez sur Définir.
    3. Dans l’onglet Layout (Mise en page ), cliquez sur l’onglet Treatment (Traitement (Figure 2C). Pour saisir les informations sur le traitement, mettez en surbrillance le puits et saisissez le nom du traitement, la concentration du traitement, l’unité et la couleur. Cliquez sur Apply (Appliquer ) (Figure 2D).
    4. Pour sélectionner et déterminer le type de puits pour chaque puits dans l’onglet Traitement , mettez le puits en surbrillance, sélectionnez le type de puits (échantillon, témoin positif ou témoin négatif), puis cliquez sur Définir.
      REMARQUE : Pour chaque sélection, plusieurs puits peuvent être mis en surbrillance en même temps.
  2. Normalisation de la valeur de l’IC
    1. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la droite de l’onglet Analyse des données et sélectionnez Index des cellules normalisées dans la liste déroulante Axe Y (Figure 3A). Dans la section Axe X en bas, sélectionnez le temps normalisé comme dernier point de temps mesuré où la plaque de microélectrode en or spécialisée a été retirée pour cause d’infection (Figure 3B).
      REMARQUE : Le processus de normalisation effectué par le logiciel élimine la majeure partie de la variabilité due aux différences d’ensemencement et de fixation des puits, à condition que le point de normalisation choisi soit avant l’ajout du virus et/ou du traitement. Par conséquent, le point de temps optimal de normalisation devrait être le dernier point de temps avant l’ajout du virus et/ou du traitement. Le point temporel à normaliser peut être vérifié dans l’onglet Planification sous Step_2. Le temps total indiqué est le point temporel à normaliser (Figure 3C).
  3. Tracé des données obtenues à l’aide du logiciel RTCA
    1. Dans l’onglet Analyse des données , sélectionnez les puits à ajouter dans le graphique en les mettant en surbrillance et en cliquant << Ajouter. L’index de cellule normalisé par rapport au graphique temporel est maintenant prêt à être copié et exporté. Assurez-vous de cocher la case Moyenne .
  4. Exportation de données à l’aide d’un logiciel RTCA
    1. Dans le coin supérieur gauche du logiciel RTCA, cliquez sur Plaque > Exporter les informations sur l’expérience.... Cochez la case pour sélectionner les données à exporter. Cliquez sur OK.
      REMARQUE : Les données brutes (valeurs CI brutes) peuvent être exportées lorsque l’option Index de cellule > Tout est cochée.
    2. Sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer le fichier d’exportation. Cliquez sur ENREGISTRER. Une fenêtre contextuelle apparaîtra indiquant l’exportation des informations expérimentales. Une fois l’exportation terminée, une autre fenêtre s’affiche indiquant que les informations de l’expérience exportées sont prêtes à être affichées.

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Résultats

Avant l’infection par le virus Zika, l’IC enregistré pour la monocouche HUVEC cultivée sur une plaque de microtitration spécialisée recouverte de microélectrodes d’or était supérieur à 8, ce qui suggère de fortes propriétés d’adhérence. Les plaques ou les puits dont l’indice IC est inférieur à 8 doivent être jetés. Les HUVEC ont ensuite été infectés par le virus Zika à un moment d’inertie de 0,1 et 1, et l’impédance cellulaire a été enregistrée pendant 7 jours. La valeur de l’IC des HUVEC infectés par le virus Zikv P6-74...

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Discussion

L’infection virale cytocide dans les cellules permissives est généralement associée à des changements substantiels dans la morphologie cellulaire et la biosynthèse36. Les changements morphologiques cellulaires induits par le virus, tels que le rétrécissement cellulaire, l’élargissement cellulaire et/ou la formation de syncytia, sont également connus sous le nom d’effets cytopathiques (EPC), caractéristiques de certaines infections virales37. Dans les CE, l’EPC a été décrite...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) et un financement dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLNest615601
37 ° ; C incubateur à 5 % de CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2 flacon de culture tissulaire  ;Corning430725U
Solution antibiotique pénicilline-streptomycine (P/S)Sciencell0503
Enceinte de sécurité biologique, Classe IIHoltenHB2448
Collagène de type 1SIgma-AldrichC3867
Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)Sciencell1052
Milieu de cellules endothéliales (ECM)Sciencell1001
E-plate 96Agilent Technologies, Inc.
Sérum fœtal bovin (FBS)Sciencell0025
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HémocytomètreLaboroptik LTDNeubauer Cellules
(HUVECs)Microscope inversé Sciencell8000
ZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 Ordinateur portableDell  ;-
Micropipette multicanaux (10 - 100 & micro ; L)Eppendorf3125000036
Micropipette multicanaux (30 - 300 & micro ; L)Eppendorf3125000052
Réactif réservateurTarsonsT38-524090
Plaque de résistance RTCA 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (Version 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.
Pipettes monocanaux (10 - 100 & micro ; L)Eppendorf3123000047
Pipettes monocanaux (100 - 1000 & micro ; L)Eppendorf3123000063
Pipettes monocanaux (20 - 200 & micro ; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence Analyseur de cellules en temps réel SP (Modèle : W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
05232368001 endothéliales de la veine ombilicale humaine améliorées 052323500015454433001

Références

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