Depuis l’émergence des détecteurs directs d’électrons et l’amélioration des logiciels et du matériel, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est devenue une technique qui permet régulièrement aux chercheurs de déterminer la structure des macromolécules avec un détail proche de l’atome 1,2. Cette accélération a été catalysée par une série de nouveaux développements au rythme extrêmement rapide, de la préparation des échantillons à la collecte et au traitement des données. Pour permettre une large démocratisation de cette technique auprès des non-experts, des pipelines plus performants et accessibles ont été créés. Étonnamment, moins de 10 ans après la « révolution de la résolution », la cryo-EM est devenue une technique essentielle pour la caractérisation des protéines, tant dans le milieu universitaire que dans l’industrie 3,4.
L’un des aspects les plus remarquables de la communauté de recherche en cryo-EM a été la volonté de partager ouvertement les protocoles, les stratégies et les logiciels5. Cette ouverture de technologie et d’expertise a contribué de manière significative au rythme très rapide du développement, mais certains goulets d’étranglement continuent d’empêcher qu’il soit pleinement accessible. Dans cette collection de méthodes, nous visons à décrire certains des développements récents dans la préparation de grilles adaptées à l’analyse structurelle par cryo-EM, qui est, avec l’accès au matériel d’analyse de données, le principal goulot d’étranglement pour de nombreux projets. Nous discutons également des nouveaux protocoles actuellement en cours de développement dans ce domaine, pour de nouvelles approches dans les analyses cryo-EM.
Comme indiqué ci-dessus, l’un des goulets d’étranglement actuels pour l’application régulière de la cryo-EM en laboratoire est la préparation des échantillons. Plusieurs problématiques peuvent être rencontrées au niveau de l’application de l’échantillon aux grilles : le plus souvent, l’orientation préférée de l’échantillon dans la glace, et sa dénaturation à l’interface air-eau. Protéger l’échantillon de l’interface air-eau est une solution à ce problème, en utilisant des films de support de carbone ou de graphène qui empêchent physiquement l’échantillon d’être en contact avec l’air. Pour faciliter l’application de couches minces sur des grilles, de Martin Garrido et al.6 ont développé un bloc de flottaison de support produit par une imprimante 3D qui permet d’appliquer de petites gouttes d’eau et d’échantillon de manière contrôlée. À l’aide de ce bloc, les couches de graphène et de carbone sont déposées de manière peu coûteuse et conviviale.
Une autre façon de prévenir les dommages à l’interface air-eau est de limiter le temps d’exposition de la protéine à l’atmosphère. Pour cela, deux instruments différents, développés par Klebs et al.7 et Budell et al.8, utilisent de nouvelles approches pour une préparation rapide (aussi peu que 10 ms) de la grille, réduisant ainsi la probabilité de problèmes d’orientation des particules. Un autre avantage de ces appareils est la possibilité d’effectuer des expériences résolues en temps, une nouvelle frontière passionnante pour les études structurales.
Dans une approche contrastée, Nguyen et al.9 rapportent une méthode pour figer les grilles pour l’analyse cryo-EM en l’absence de dispositifs commerciaux ou sur mesure, qui sont soit très coûteux, soit difficiles à construire. Ils montrent comment des grilles de qualité similaire peuvent être obtenues à l’aide d’un appareil bon marché, fait maison et ne nécessitant aucune instrumentation coûteuse, contribuant ainsi à la démocratisation de la cryo-EM.
Dans la cryo-EM, l’échantillon d’intérêt n’est pas toujours une protéine, mais peut plutôt être une petite molécule ou un grand système biologique tel qu’une cellule entière. La préparation de tels échantillons est unique et nécessite des étapes spécifiques, ainsi que différentes stratégies de collecte de données.
Pour la diffraction d’électrons microcristallins (MicroED), l’échantillon à étudier est un petit produit chimique que l’on trouve généralement sous la forme d’une poudre. La poudre est appliquée directement sur la grille EM pour conserver une forme cristalline. La collecte des données est ensuite effectuée en mode diffraction, comme le montrent Martynowycz et Gonen10. En revanche, les cellules entières sont trop épaisses pour l’analyse cryo-EM. Pour remédier à cette situation, Bisson et al. rapportent une méthode permettant d’utiliser un MEB pour forer physiquement dans un tel échantillon, afin d’obtenir des sections minces adaptées aux études structurales11.
De l’échantillon à la structure, il est important de conserver un enregistrement pour chaque étape du processus, car de nombreux paramètres sont modifiés pour chaque échantillon de protéines, de la concentration de protéines aux paramètres du microscope et à l’analyse des données. À cette fin, Wypych et al.12 ont développé un outil de gestion de l’information basé sur le Web qui permet aux utilisateurs d’organiser leur flux de travail et de garder une trace de tous les détails nécessaires aux publications futures. Ceci est particulièrement critique alors que l’automatisation devient de plus en plus répandue dans la cryo-EM, en particulier dans les milieux industriels.
Cryo-EM a progressé à un rythme exceptionnel au cours de la dernière décennie, tant sur le plan matériel que logiciel. Pour assurer une large diffusion des meilleures pratiques et l’adoption à grande échelle de nouvelles méthodes, un ensemble transparent de protocoles est nécessaire. Ce numéro spécial contribuera à cet effort.