Production et maintien de cellules souches pluripotentes induites par les primates dérivées de l’urine

Jessica Radmer; Johanna Geuder; Fiona C. Edenhofer; Wolfgang Enard; Mari Ohnuki

doi:10.3791/64922

Article de méthode

Production et maintien de cellules souches pluripotentes induites par les primates dérivées de l’urine

DOI :

10.3791/64922

⸱

28 juillet 2023

Jessica Radmer¹ , Johanna Geuder¹ , Fiona C. Edenhofer¹ , Wolfgang Enard¹ , Mari Ohnuki¹^,²^,³

¹Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, ²Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, ³Hakubi Center, Kyoto University

Dans cet article

Résumé

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Le présent protocole décrit une méthode pour isoler, étendre et reprogrammer des cellules dérivées de l’urine de primates humains et non humains en cellules souches pluripotentes induites (CSPi), ainsi que des instructions pour le maintien sans alimentation des CSPi nouvellement générées.

Résumé

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Les approches interspécifiques qui étudient les cellules souches pluripotentes des primates et leurs dérivés sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la maladie, du développement et de l’évolution. Pour rendre les cellules souches pluripotentes induites par les primates (CSPi) plus accessibles, cet article présente une méthode non invasive pour générer des CSPi de primates humains et non humains à partir de cellules dérivées de l’urine, et leur maintien à l’aide d’une méthode de culture sans nourrisseur.

L’urine peut être échantillonnée dans un environnement non stérile (p. ex. la cage de l’animal) et traitée avec un cocktail d’antibiotiques à large spectre pendant la culture cellulaire primaire afin de réduire efficacement la contamination. Après multiplication des cellules dérivées de l’urine, les CSPi sont générées par une méthode de transduction modifiée d’un système vectoriel du virus Sendai disponible dans le commerce. Les premières colonies d’iPSC peuvent déjà être visibles après 5 jours, et peuvent être cueillies après 10 jours au plus tôt. Le passage systématique d’amas avec tampon de dissociation sans enzyme soutient la pluripotence des CSPi générées pendant plus de 50 passages.

Introduction

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Les comparaisons génomiques des primates humains et non humains (PNH) sont cruciales pour comprendre notre histoire évolutive et l’évolution des traits spécifiques à l’homme¹. De plus, ces comparaisons permettent d’inférer la fonction en identifiant les séquences d’ADN conservées², par exemple, pour prioriser les variantes associées à la maladie³. Les comparaisons de phénotypes moléculaires tels que les niveaux d’expression génique sont cruciales pour mieux interpréter les comparaisons génomiques et découvrir, par exemple, les différences phénotypiques cellulaires. En outre, ils ont - comme les co....

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Protocole

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Cette procédure expérimentale a été approuvée par le comité d’éthique responsable de l’expérimentation humaine (20-122, Ethikkommission LMU München). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes.
REMARQUE : L’approbation du comité d’éthique approprié doit être obtenue avant d’entreprendre des expériences portant sur des échantillons humains et des échantillons de PSN. Toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pertinents. Chacune des étapes suivantes doit être effectuée en utilisant une technique stérile dans une enceinte de sécurité biolog....

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Résultats

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Lors de l’isolement de cellules de l’urine humaine et de l’urine de PSN, différents types de cellules peuvent être identifiés directement après l’isolement. Les cellules squameuses, ainsi que diverses cellules rondes plus petites, sont excrétées avec l’urine; l’urine féminine contient beaucoup plus de cellules malpighiennes que l’urine masculine (Figure 1B - Jour 0; Figure supplémentaire S1). Après 5 jours de culture dans un milieu urinaire primaire, les premières cellules a.......

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Discussion

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Les CSPi sont des types cellulaires précieux car ils permettent la génération de types cellulaires autrement inaccessibles in vitro. Comme les matériaux de départ pour la reprogrammation, par exemple, les fibroblastes ne sont pas facilement disponibles chez toutes les espèces de primates, cet article présente un protocole pour la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine. Ces cellules peuvent être obtenues de manière non invasive, même à partir d’échantillons d’urine de primates non stériles, e.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par DFG EN 1093/5-1 (numéro de projet 458247426). M.O. a été soutenu par JSPS Overseas Research Fellowship. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. La cytométrie en flux a été réalisée avec l’aide de la cytométrie en flux de l’installation centrale du centre biomédical de Munich. Nous tenons à remercier Makoto Shida et Tomoyo Muto de l’ASHBi, Université de Kyoto, pour leur soutien à la vidéographie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accumax&trade ; solution de détachement cellulaire (solution de détachement)	Sigma-Aldrich	SCR006
Amphotéricine B-Solution	Merck	A2941-100ML
Anti-humain TRA-1-60 Anticorps de souris ;	Stem Cell Technologies	60064	Dilution : 1/200
Anticorps conjugué au PE TRA-1-60 humain ;	Miltenyi Biotec	130-122-965	Dilution : 1/50
Bambanker&trade ; (Milieu de congélation cellulaire)	Nippon Genetics	BB01
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100G
Plaque multipuits de culture cellulaire, 12 puits CELLSTAR	Greiner BIO-ONE	665180
Comtesse & commerce ; II compteur de cellules automatisé	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CryoKing® ; 1,5 mL Tubes avec code-barres 2D (Cryotubes)	Sued-Laborbedarf	52 95-0213	Différents types de cryotubes peuvent être utilisés pour la congélation. Les tubes à code-barres 2D ont l’avantage de pouvoir stocker les informations sur l’échantillon dans une base de données avec des informations uniques sur le tube.
CytoTune&Trade ; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)	Thermo Fisher Scientific	A16519
CytoTune&trade ;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)	Thermo Fisher Scientific	A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dichlorhydrate	Sigma-Aldrich	10236276001
DMEM High Glucose	TH. Geyer	L0102
DMEM/F12 w L-glutamine	Fisher Scientific	15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; 488	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Dilution : 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor&trade ; 594	Thermo Fisher Scientific	A-21207	Dilution : 1/500
DPBS sans calcium sans magnésium	TH. Geyer	L0615-500
EpCAM Anticorps polyclonal recombinant de lapin (22 HCLC)	Thermo Fisher Scientific		710524 Dilution : 1/500
Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)	Carl Roth	CN06.3
Falcon Tube 15 mL fond conique	Greiner BIO-ONE	188271-N
Falcon Tube 50 mL fond conique	Greiner BIO-ONE	227261
Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, Brésil (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10500064
FlowJo V10.8.2	FlowJo ;
Gélatine de peau de porc	Sigma-Aldrich	G1890-1KG
Geltrex&trade ; Sans LDEV, qualifié hESC, à facteur de croissance réduit Matrice de membrane basale	Thermo Fisher Scientific	A1413301
GlutaMAX&trade ; Supplément	Thermo Fisher Scientific	35050038
Heracell&trade ; 240i Incubateur CO2	Fisher Scientific	16416639
Heraeus HeraSafe armoire de sécurité	Kendro	51017905
Human EGF, qualité premium	Miltenyi Biotec	130-097-749
ImageJ ;	Fiji	Version 2.9.0
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035
Tube de microcentrifugation PP, 1,5 mL	Nerbe Plus	04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S	Nikon	TE2000-S
Anticorps anti-alpha-fœtoprotéine de souris	R& D Systems	MAB1368	Dilution : 1/100
Souris anti-alpha-Smooth Muscle Actin	anticorps R& D Systems	MAB1420	Dilution : 1/100
Anticorps anti-tubuline bêta-III	de souris R& D Systems	MAB1195	Dilution : 1/100
mTeSR ; 1	STEMCELL Technologiess	85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb ;	Technologie de signalisation cellulaire	4903S	Dilution : 1/400
Normocure&trade ; (réactif antimicrobien)	Invivogen	anti-noc
Oct-4 Anticorps de lapin ;	Technologie de signalisation cellulaire	2750S	Dilution : 1/400
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Pénicilline-Streptomycine (10.000 U/ml) (PS)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Le mélange de pénicilline-streptomycine contient 100 U/mL de pénicilline et 100 µ ; g/mL de streptomycine.
réfrigérée Recombinante Humaine FGF-basic	PeproTech	100-18B
Centrale réfrigérée	PeproTech	100-00AB
	SIGMA ;	4-16KS
Cellule épithéliale rénale Milieu basal	ATCC	PCS-400-030
Kit de croissance des cellules épithéliales rénales	ATCC	PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Souris mAb #4900	Technologie de signalisation cellulaire	4900S	Dilution : 1/400
SSEA4 (MC813) Souris mAb	NEB	4755S	Dilution : 1/500
StemFit® ; Basic02	Nippon Genetics	3821.00	La production de ce milieu a été arrêtée, utilisez plutôt StemFit Basic04CT pour les lignées cellulaires humaines ou StemFit Basic03 pour les primates non humains.
Triton X-100 ;	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
TrypLE&trade ; Sélectionnez Enzyme (1x), sans rouge de phénol (Enzyme de dissociation)	Thermo Fisher Scientific	12563011
Waterbath Precision GP 05	Thermo Fisher Scientific	TSGP05
Y-27632, Sel de dichlorhydrate (Rock Inhibitor)	Biozol	BYT-ORB153635
Tampon			d’anticorps Pour la composition, voir le supplément tableau S1
Tampon			Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1
Milieu			Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1
Milieu			d’urine primaire Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1
		de culture PSC	Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1
Milieu de génération PSC			Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1
Tampon			d’urine Pour la composition, voir le tableau supplémentaire S1

663441Centrifugeuse de paillasse de dilution de blocage REMC Milieu de lavage

Références

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Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
Kircher, M., et al.

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Mots-clés

iPSC de primates cellules d riv es d urine culture sans cellules nourrici res reprogrammation par le virus Sendai repiquage en amas marqueurs de pluripotence cytom trie en flux immunocytochimie diff renciation en feuillets embryonnaires

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