Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile

Summary

Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .

Abstract

La jonction neuromusculaire (JNM) de la drosophile est devenue un système modèle précieux dans le domaine des neurosciences. L’application de la microscopie confocale chez la drosophile NMJ permet aux chercheurs d’acquérir des informations synaptiques, englobant à la fois des données quantitatives sur l’abondance des synapses et des informations détaillées sur leur morphologie. Cependant, la distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse ultrastructurale. Cette étude présente une méthode innovante et efficace de préparation des échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. La procédure commence par la mise en place d’un treillis métallique à la base d’une bouteille ou d’un tube à essai à fond plat, puis par le positionnement d’échantillons de larves fixes sur le treillis. Un maillage supplémentaire est placé sur les échantillons, en veillant à ce qu’ils soient positionnés entre les deux mailles. Les échantillons fixés sont soigneusement déshydratés et infiltrés avant de procéder à la procédure d’enrobage. Ensuite, l’enrobage des échantillons dans de la résine époxy est effectué à plat, ce qui permet de préparer les muscles pour le positionnement et la section. Grâce à ces étapes, tous les muscles des larves de drosophile peuvent être visualisés en microscopie optique, ce qui facilite le positionnement et la sectionnement ultérieurs. L’excès de résine est éliminé après avoir localisé les 6^e et 7^e muscles des segments corporels A_{, 2} et A_{, 3}. Une section ultra-mince en série du 6^ème ou 7^ème muscle est effectuée.

Introduction

La microscopie électronique est l’une des méthodes les plus idéales pour étudier l’ultrastructure des matériaux biologiques qui permet de démontrer visuellement et avec précision la structure interne des cellules au niveau¹ à l’échelle nanométrique. Cependant, en raison de la complexité du processus de préparation des échantillons et du coût élevé, la microscopie électronique n’est pas aussi populaire que la microscopie optique. Les progrès récents des techniques de microscopie électronique ont permis d’améliorer considérablement la qualité des images, ce qui a coïncidé avec une réduction remarquable de la charge de travail associée. Par conséq....

Protocol

REMARQUE : La méthode de préparation d’échantillon de microscopie électronique à transmission utilisée dans cet article a été décrite précédemment¹⁶. Il est important de noter que la sélection des réactifs et l’ajustement de la posologie sont nécessaires en fonction de l’échantillon. De nombreux réactifs chimiques toxiques sont utilisés dans le processus de préparation des échantillons, par conséquent, l’opérateur doit prendre certaines mesures de protection, telles que le port de vêtements et de gants de protection et l’utilisation d’une hotte.

1. Procédure de dissection, de fixation et de mise en place

Results

La paroi corporelle de la larve de drosophile est composée de 30 fibres musculaires identifiables disposées de manière régulière et ressemble à une fine tranche après dissection et fixation²¹ (Figure 1A). L’échantillon reste plat pendant le processus de déshydratation en raison de la présence de treillis métalliques (Figure 1B, C). Le muscle du corps larvaire est enfoui dans une fine plaque de résine époxy (

Discussion

Les échantillons de larves de drosophile ont tendance à se recroqueviller pendant la déshydratation, car les échantillons sont minces, ce qui rend difficile la localisation précise de la jonction neuromusculaire, augmentant ainsi la difficulté et la charge de travail pour la préparation des échantillons. L’amélioration traditionnelle consiste à raccourcir l’échantillon⁷, mais les échantillons étaient toujours enroulés à des degrés différents.

Dans notre méthode.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Époxypropane	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Agent pénétrant
Drosophila Stocks	Bloomington	aucun	Les souches de drosophile de contrôle de type sauvage utilisées dans cette recherche étaient toutes W1118, et ont été élevées selon les méthodes de culture standard
Tubes à essai en verre à fond plat	Haimen Chenxing Experimental equipment Company  ;	Tubes	à essai en verre à fond plat (bouteille) avec bouchon éponge (ou bouchon de bouteille)
Réticulant K4M	; Agar Scientific	Cat# 1924B	Les résines d’enrobage sont basées sur une formule d’acrylate et de méthacrylate hautement réticulés.
Résine K4M (monomère B)	; Agar Scientific	Lot# 631557	Résine Monomère
Film polyvinyle	Haimen Chenxing Équipement expérimental Entreprise  ;	aucun	Le film de polyéthylène transparent est le meilleur, épaisseur d’environ 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI#02827-AF	Dodécényl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 Epoxy	SPI	02823-DA	Accélérateur
SPI-Chem NMA	SPI	SpI#02828-AF	Durcisseur pour époxy
SPI-PON 812 Epoxy	SPI SPI	#0259-AB	Résine Monomère
Treillis d’acier  ;	Yuhuiyuan Gardening Store(en ligne)	aucun	Réseau en cuivre ou en acier inoxydable
Microscopie électronique à transmission	Hitachi H-7650	11416692	Toutes les grilles (sur lesquelles des échantillons ont été recueillis) ont été colorées au citrate de plomb et observées sous microscopie électronique à transmission.
Microtome ultrafin Microtome	ultrafin Leica UC7	595915	Toutes les opérations de sectionnage sont effectuées sur un microtome ultrafin Leica UC7 à l’aide d’un couteau diamanté