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Article de méthode

Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile

1.1K vues

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DOI :

10.3791/64934

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15 septembre 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

Dans cet article

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Résumé

Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .

Résumé

La jonction neuromusculaire (JNM) de la drosophile est devenue un système modèle précieux dans le domaine des neurosciences. L’application de la microscopie confocale chez la drosophile NMJ permet aux chercheurs d’acquérir des informations synaptiques, englobant à la fois des données quantitatives sur l’abondance des synapses et des informations détaillées sur leur morphologie. Cependant, la distribution diffuse et la portée visuelle limitée du TEM présentent des défis pour l’analyse ultrastructurale. Cette étude présente une méthode innovante et efficace de préparation des échantillons qui surpasse l’approche conventionnelle. La procédure commence par la mise en place d’un treillis métallique à la base d’une bouteille ou d’un tube à essai à fond plat, puis par le positionnement d’échantillons de larves fixes sur le treillis. Un maillage supplémentaire est placé sur les échantillons, en veillant à ce qu’ils soient positionnés entre les deux mailles. Les échantillons fixés sont soigneusement déshydratés et infiltrés avant de procéder à la procédure d’enrobage. Ensuite, l’enrobage des échantillons dans de la résine époxy est effectué à plat, ce qui permet de préparer les muscles pour le positionnement et la section. Grâce à ces étapes, tous les muscles des larves de drosophile peuvent être visualisés en microscopie optique, ce qui facilite le positionnement et la sectionnement ultérieurs. L’excès de résine est éliminé après avoir localisé les 6e et 7e muscles des segments corporels A, 2 et A, 3. Une section ultra-mince en série du 6ème ou 7ème muscle est effectuée.

Introduction

La microscopie électronique est l’une des méthodes les plus idéales pour étudier l’ultrastructure des matériaux biologiques qui permet de démontrer visuellement et avec précision la structure interne des cellules au niveau1 à l’échelle nanométrique. Cependant, en raison de la complexité du processus de préparation des échantillons et du coût élevé, la microscopie électronique n’est pas aussi populaire que la microscopie optique. Les progrès récents des techniques de microscopie électronique ont permis d’améliorer considérablement la qualité des images, ce qui a coïncidé avec une réduction remarquable de la charge de travail associée. Par conséquent, la microscopie électronique a joué un rôle important dans l’avancement des connaissances scientifiques dans divers domaines2.

La drosophile est un excellent modèle animal pour effectuer des manipulations génétiques afin de contrôler précisément l’expression spatiale et temporelle des gènes cibles3. De plus, la drosophile présente les avantages d’une courte période de croissance et d’un élevage facile par rapport aux modèles mammifères ; par conséquent, la drosophile est largement utilisée dans la recherche morphologique 4,5.

Chez les larves de drosophile, les boutons de jonction neuromusculaire (JNM) sont largement répartis dans les muscles 6,7, et l’immunocoloration de la JNM peut facilement fournir des informations sur la quantité et la morphologie des synapses 8,9 . Les boutons NMJ situés dans les muscles 6e/7des segments A2 et A3 sont bien adaptés à la recherche quantitative et morphologique par microscopie optique. C’est à cause de leur taille et de leur abondance10,11. Par conséquent, les larves de drosophile sont considérées comme un modèle utile pour la recherche en neurosciences12.

Cependant, il est difficile d’observer l’ultrastructure du bouton NMJ par le TEM. Étant donné que la fenêtre de balayage de la microscopie électronique à transmission est étroite, il est difficile de positionner les boutons NMJ13 largement distribués. L’autre raison est que la paroi corporelle de la drosophile est susceptible de s’enrouler pendant l’étape de déshydratation alcoolique du protocole de préparation des échantillons7.

Les études traditionnelles ont généralement choisi des boutons entre les 6ème et 7ème muscles dessegments A2 et A3 comme matériaux d’échantillonnage en raison de leur abondance et de leur taille14,15. Les 6eet 7emuscles des segments A2 et A3 sont plus gros que les autres muscles et contiennent plus de boutons. Cependant, lorsque des échantillons ont été préparés pour la microscopie électronique, les échantillons fixes avaient tendance à devenir minces et sujets à l’enroulement, ce qui entraînait un mauvais positionnement des 6e et 7e muscles des segments A2 et A3.

Nous rapportons ici une nouvelle procédure de traitement qui est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle de préparation des échantillons 7,16, en permettant aux échantillons de rester plats pendant la déshydratation ultérieure, facilitant ainsi un meilleur positionnement des jonctions neuromusculaires larvaires de la drosophile.

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Protocole

REMARQUE : La méthode de préparation d’échantillon de microscopie électronique à transmission utilisée dans cet article a été décrite précédemment16. Il est important de noter que la sélection des réactifs et l’ajustement de la posologie sont nécessaires en fonction de l’échantillon. De nombreux réactifs chimiques toxiques sont utilisés dans le processus de préparation des échantillons, par conséquent, l’opérateur doit prendre certaines mesures de protection, telles que le port de vêtements et de gants de protection et l’utilisation d’une hotte.

1. Procédure de dissection, de fixation et de mise en place

  1. Dissection
    1. Disséquez les larves errantes de la fin du 3e stade dans la solution de janvier et obtenez toute la paroi du corps en suivant les procédures standard17. Préparez la solution de Jan comme suit : 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 35 mM de saccharose, 5 mM d’HEPES, pH 7,4
      REMARQUE : La paroi corporelle des larves de drosophile fait référence à l’enveloppe externe ou tégument du stade larvaire de la drosophile des fruits. Cela comprend la cuticule, les cellules épidermiques et les tissus sous-jacents qui forment l’exosquelette larvaire. La paroi du corps fournit un soutien structurel et une protection et sert de barrière entre le corps larvaire et l’environnement extérieur17.
  2. Fixation
    1. Fixez la paroi du corps larvaire dans la chambre de dissection à 4 °C pendant la nuit avec le fixateur. Pour préparer le fixateur, mélangez 2 % de glutaraldéhyde et 2 % de formaldéhyde dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4)
    2. Rincer les échantillons plusieurs fois avec un tampon cacodylate de sodium.
    3. Préparez 1% d’OsO4 dans un tampon cacodylate. Fixer les échantillons dans 1% d’OsO4 pendant 2 h, puis plusieurs rinçages à l’eau distillée.
      REMARQUE : La double fixation avec des aldéhydes et de l’OsO4 offre une meilleure protection de l’ultrastructure cellulaire. De plus, OsO4 peut colorer le tissu de l’échantillon, ce qui permet au contraste entre la lumière et l’échantillon d’être plus apparent18.
    4. Colorer les échantillons de jonction neuromusculaire de la drosophile avec de l’acétate d’uranyle saturé à 2 % pendant 2 h, puis les rincer à l’eau désionisée plusieurs fois (figure 1A).
  3. Placement de l’échantillon
    1. Coupez deux morceaux ronds de treillis métallique de taille similaire (taille des pores 270 μm) avec des ciseaux.
    2. Placez à l’avance un treillis métallique (270 μm) à la base d’une bouteille à fond plat.
    3. Placez les échantillons de larves fixes sur le maillage, puis placez un autre maillage dessus afin que les échantillons soient placés entre les deux mailles.

2. Déshydratation

NOTE Dans cet article, la méthode de déshydratation par gradient d’éthanol a été utilisée.

  1. Déshydrater séquentiellement les échantillons dans un gradient de concentration croissant d’éthanol (50 %, 70 %, 85 %, 95 % une fois, 100 % deux fois), chacun pendant 20 minutes à 4 °C.
  2. Rincer les échantillons deux fois avec de l’oxyde de propylène à température ambiante pendant 5 minutes à chaque fois (figure 1C).

3. Infiltration

REMARQUE : L’infiltration est l’une des étapes nécessaires à la préparation de l’échantillon TEM. L’infiltration permet le remplacement progressif du milieu de déshydratation par le milieu d’enrobage dans l’échantillon pour permettre le remplissage de l’interstice cellulaire avec le milieu d’enrobage19.

  1. Placer les échantillons dans la solution mixte d’oxyde de propylène et de résine époxy dans un rapport de 1:1 et 1:2 pendant 1 h chacun, puis dans la résine époxy pure pendant 2 h à température ambiante.

4. Intégration

  1. Préparez un film de polyéthylène et coupez-le en un grand carré (environ 5 × 5 cm) et un petit support rectangulaire creux (environ 2 × 2 cm). Collez le petit carré avec le grand carré.
  2. Prépositionnez suffisamment de résine époxy au centre du grand carré.
  3. Placez les échantillons dans la résine époxy prépositionnée avec le côté musculaire vers le haut. Utilisez un stéréoscope.
  4. Ajoutez quelques gouttes de résine aux échantillons, puis recouvrez-les d’un film PE (un peu plus grand que l’entretoise) (Figure 1D-E).
  5. Polymériser les échantillons à 37 °C, 42 °C et 60 °C pendant 24 h respectivement (figure 1F).

5. Procédure de sectionnement

  1. Retirez les parties en excès de la paroi du corps larvaire à l’aide d’une lame tranchante et conservez un trapèze, y compris le segment A2/A3 .
    REMARQUE : La ligne supérieure doit être près du 13e muscle et la ligne de base doit être éloignée de l’échantillon vers la résine époxy. La hauteur entre la ligne supérieure et la ligne de base est d’environ 5 à 8 mm.
  2. Retirez le trapèze du reste de l’échantillon et collez-le sur la capsule remplie de résine avec la colle A/B.
  3. Confirmer la position des 6ème et 7ème muscles des segments A2 et A3 sous la microscopie optique (Figure 1G) et maintenir le plan tangent parallèle au 6ème muscle.
  4. Coupez un cinquième de l’échantillon le long des deux côtés du segment A3 .
    REMARQUE : Retirez la majeure partie du 6e muscle et conservez 1/3 de la largeur du 7e muscle.
  5. À l’aide d’un microtome ultramince, préparez une section ultrafine de l’échantillon en commençant par le 6e muscle.
    REMARQUE : Chaque tranche a une épaisseur d’environ 90 nm.
  6. Attaché autant de tranches que possible à chaque maille de cuivre.
  7. Effectuez la microscopie électronique à transmission comme décrit précédemment16.

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Résultats

La paroi corporelle de la larve de drosophile est composée de 30 fibres musculaires identifiables disposées de manière régulière et ressemble à une fine tranche après dissection et fixation21 (Figure 1A). L’échantillon reste plat pendant le processus de déshydratation en raison de la présence de treillis métalliques (Figure 1B, C). Le muscle du corps larvaire est enfoui dans une fine plaque de résine époxy (

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Discussion

Les échantillons de larves de drosophile ont tendance à se recroqueviller pendant la déshydratation, car les échantillons sont minces, ce qui rend difficile la localisation précise de la jonction neuromusculaire, augmentant ainsi la difficulté et la charge de travail pour la préparation des échantillons. L’amélioration traditionnelle consiste à raccourcir l’échantillon7, mais les échantillons étaient toujours enroulés à des degrés différents.

Dans notre méthode...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation des sciences naturelles de Chine 32070811 et le Fonds d’essai d’analyse de l’Université du Sud-Est (Chine) 11240090971. Nous remercions le Laboratoire de microscopie électronique et le Centre d’analyse morphologique, École de médecine, Université du Sud-Est, Nanjing, Chine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-ÉpoxypropaneSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Agent pénétrant
Drosophila StocksBloomingtonaucunLes souches de drosophile de contrôle de type sauvage utilisées dans cette recherche étaient toutes W1118, et ont été élevées selon les méthodes de culture standard
Tubes à essai en verre à fond platHaimen Chenxing Experimental equipment Company  ;Tubesà essai en verre à fond plat (bouteille) avec bouchon éponge (ou bouchon de bouteille)
Réticulant K4M  ; Agar ScientificCat# 1924BLes résines d’enrobage sont basées sur une formule d’acrylate et de méthacrylate hautement réticulés.
Résine K4M (monomère B)  ; Agar ScientificLot# 631557Résine Monomère
Film polyvinyleHaimen Chenxing Équipement expérimental Entreprise  ;aucunLe film de polyéthylène transparent est le meilleur, épaisseur d’environ 0,2 mm
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodécényl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 EpoxySPI02823-DAAccélérateur
SPI-Chem NMASPISpI#02828-AFDurcisseur pour époxy
SPI-PON 812 EpoxySPI SPI#0259-ABRésine Monomère
Treillis d’acier  ;Yuhuiyuan Gardening Store(en ligne)aucunRéseau en cuivre ou en acier inoxydable
Microscopie électronique à transmissionHitachi H-765011416692Toutes les grilles (sur lesquelles des échantillons ont été recueillis) ont été colorées au citrate de plomb et observées sous microscopie électronique à transmission.
Microtome ultrafin Microtomeultrafin Leica UC7595915Toutes les opérations de sectionnage sont effectuées sur un microtome ultrafin Leica UC7 à l’aide d’un couteau diamanté

Références

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

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