Article de méthode

Développement de souches d’espèces de Leishmania avec expression constitutive de eGFP

DOI :

10.3791/64939

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21 avril 2023

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1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L. donovani exprimant le gène de l’eGFP en tant que transgène intégré stable à l’aide du système pLEXSY. Les parasites transfectés ont été clonés par dilution limite, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée chez les deux espèces ont été sélectionnés pour une utilisation ultérieure dans les tests de dépistage de médicaments.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les parasites protozoaires du genre Leishmania provoquent la leishmaniose , une maladie aux manifestations cliniques variables qui touche des millions de personnes dans le monde. L’infection par L. donovani peut entraîner une maladie viscérale mortelle. Au Panama, en Colombie et au Costa Rica, L. panamensis est responsable de la plupart des cas signalés de leishmaniose cutanée et cutanéo-muqueuse. L’étude d’un grand nombre de candidats médicaments avec les méthodologies disponibles à ce jour est assez difficile, étant donné qu’elles sont très laborieuses pour évaluer l’activité des composés contre les formes intracellulaires du parasite ou pour effectuer des essais in vivo . Dans ce travail, nous décrivons la génération de souches de L. panamensis et de L. donovani avec expression constitutive du gène qui code pour une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) intégrée dans le locus codant pour l’ARNr 18S (ssu). Le gène codant pour eGFP a été obtenu à partir d’un vecteur commercial et amplifié par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour l’enrichir et ajouter des sites de restriction pour les enzymes BglII et KpnI. L’amplicon eGFP a été isolé par purification en gel d’agarose, digéré avec les enzymes BglII et KpnI, et ligaturé dans le vecteur d’expression de Leishmania pLEXSY-sat2.1 précédemment digéré avec le même ensemble d’enzymes. Le vecteur d’expression avec le gène cloné a été propagé dans E. coli, purifié, et la présence de l’insert a été vérifiée par PCR de colonie. Le plasmide purifié a été linéarisé et utilisé pour transfecter les parasites L. donovani et L . panamensis. L’intégration du gène a été vérifiée par PCR. L’expression du gène eGFP a été évaluée par cytométrie en flux. Les parasites fluorescents ont été clonés par dilution limitante, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée ont été sélectionnés par cytométrie de flux.

Introduction

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Les parasites protozoaires du genre Leishmania provoquent la leishmaniose, une maladie avec un large éventail de manifestations cliniques. Cette maladie est répandue dans 98 pays, et son incidence annuelle est estimée entre 0,9 et 1,6 million de cas1. Les espèces de Leishmania pathogènes pour l’homme sont divisées en deux sous-genres, à savoir L. (Leishmania) et L. (Viannia). Infection par certaines espèces appartenant au L. Les sous-genres (Leishmania), tels que L. donovani et L. infantum, peuvent entraîner une leishmaniose viscérale (LV), qui est mortelle si elle n’est pas traitée2. Espèces appartenant au L. Le sous-genre (Viannia) est associé à la plupart des cas de leishmaniose cutanée (CL) et de leishmaniose cutanéo-muqueuse (LCM) en Amérique centrale et du Sud, en particulier au Panama, en Colombie et au Costa Rica, L. panamensis étant le principal agent étiologique de ces présentations cliniques 3,4.

La chimiothérapie anti-leishmania existante qui comprend des médicaments tels que les antimoniaux pentavalents, la miltefosine et l’amphotéricine B est très toxique et coûteuse. En outre, l’augmentation de la résistance aux médicaments au cours des dernières décennies s’est ajoutée aux facteurs qui interfèrent avec le traitement efficace des patients dans le mondeentier 5. Des différences substantielles ont été démontrées entre les espèces du genre Leishmania en ce qui concerne la sensibilité aux médicaments, en particulier entre les espèces du Nouveau Mondeet de l’Ancien Monde 6,7. Pour ces raisons, il est nécessaire de concentrer les efforts sur l’identification et le développement de nouveaux médicaments anti-leishmania, en accordant une attention particulière aux approches spécifiques aux espèces. L’étude de grandes bibliothèques de candidats médicaments avec des méthodologies traditionnelles est assez difficile, étant donné que ces méthodologies sont très laborieuses pour évaluer l’activité des composés contre les amastigotes intracellulaires ou pour réaliser des expériences in vivo 8 ; Par conséquent, il a été nécessaire de développer de nouvelles techniques qui réduisent ces inconvénients, y compris la mise en œuvre de gènes rapporteurs et le développement de tests de dépistage phénotypiques à haut contenu9.

L’utilisation de gènes rapporteurs a montré le potentiel d’accroître l’efficacité du processus de criblage des médicaments, car elle facilite le développement de tests à haut débit et in vivo. Des parasites Leishmania recombinants exprimant plusieurs gènes rapporteurs ont été générés par divers groupes de recherche. Des gènes rapporteurs, tels que la β-galactosidase, la β-lactamase et la luciférase, ont été introduits chez plusieurs espèces de Leishmania à l’aide de vecteurs épisomiques, montrant une utilité limitée pour le dépistage de médicaments dans les formes extra- et intracellulaires du parasite 10,11,12,13,14,15. Ces approches ont la limitation de nécessiter une forte pression sélective en culture pour éviter l’élimination de la construction épisomique, ainsi que l’utilisation de réactifs supplémentaires pour révéler l’activité du gène rapporteur. Inversement, la protéine fluorescente verte (GFP) et sa variante, la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), ont été utilisées dans la génération d’un grand nombre de souches transgéniques de Leishmania pour des tests de criblage de médicaments in vitro en raison de leur flexibilité et de leur sensibilité, ainsi que de la possibilité d’automatiser le processus de criblage par cytométrie en flux ou fluorométrie15, 16,17,18,19. Malgré des résultats prometteurs, les cultures de ces souches transgéniques étaient très hétérogènes dans leurs niveaux de fluorescence, car le nombre de copies du gène GFP n’était pas le même chez tous les parasites. De plus, le maintien de la fluorescence nécessitait une pression sélective constante sur les parasites en culture, puisque le gène GFP a été introduit dans une construction épisomique.

Pour les raisons mentionnées précédemment, de nombreux efforts ont été consacrés à la mise au point de nouvelles méthodologies pour la production de souches recombinantes stables. Ces efforts ont principalement reposé sur l’intégration de gènes rapporteurs dans les loci ribosomiques, en tirant parti des taux de transcription plus élevés des gènes ribosomales20. Des souches de L. infantum et de L. amazonensis ont été générées après avoir intégré les gènes codant pour la β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 et tdTomato23, et leur utilité a été évaluée dans les tests de dépistage de médicaments. Divers groupes ont développé des souches de L. donovani qui expriment la GFP de manière constitutive en intégrant son gène codant dans le locus de l’ARN ribosomique 18S (locus ssu) par recombinaison homologue24,25; ils ont montré une expression stable et homogène de la GFP dans la population transfectée, y compris les amastigotes intracellulaires 24,25, et ils ont été mis en œuvre avec succès dans les tests de dépistage de médicaments24,25,26. Bolhassani et coll.27 ont mis au point des souches de L. major et de L. infantum exprimant la GFP sous forme de transgène intégré. Ils ont utilisé le vecteur d’intégration pLEXSY, conçu à l’origine pour l’expression transgénique de protéines dans un système utilisant L. tarentolae comme hôte28. Le vecteur pLEXSY-GFP s’est révélé très efficace pour la génération de différentes souches de Leishmania exprimant constitutivement GFP 24,25,27,29,30. Chez ces parasites, la fluorescence est homogène et maintenue dans les formes intracellulaires, pouvant être détectée dans les lésions plantaires de souris infectées27.

Dans ce travail, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L . donovani exprimant le gène codant pour eGFP en tant que transgène intégré à l’aide du système pLEXSY. Les souches générées par ce procédé sont utilisées dans notre laboratoire pour effectuer des tests de criblage de médicaments qui évaluent l’activité anti-leishmania potentielle de molécules d’origine naturelle et synthétique.

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Protocole

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Pour garder les échantillons stériles, toutes les étapes impliquant la culture de parasites doivent être effectuées à l’intérieur d’une hotte de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ou conformément aux réglementations locales en matière de santé et de sécurité. Un résumé graphique de ce protocole se trouve à la figure 1.

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma sommaire du protocole de génération de parasites L. panamensis et L. donovani exprimant l’eGFP à l’aide de la famille de vecteurs pLEXSY-2.1. Les six sections principales décrites dans l’article sont représentées ici. 1) Amplification et insertion du gène eGFP dans le vecteur pLEXSY-2.1 : le gène cible est amplifié, ajoutant les sites de reconnaissance des enzymes KpnI et BglII, et l’amplicon eGFP et le plasmide pLEXSY sont digérés séquentiellement avec les deux enzymes pour une ligature ultérieure avec la T4 ligase. 2) Linéarisation du plasmide d’expression pLEXSY: la construction pLEXSY + eGFP est digérée avec SwaI pour la linéarisation et la purification de la cassette d’expression 7-8 kbp. 3) Transfection et 4) sélection polyclonale: Les promastigotes de Leishmania sont transfectés avec la cassette d’expression par électroporation et remis en culture pour la sélection antibiotique des parasites recombinants. La fluorescence parasitaire est confirmée par cytométrie en flux. 5) Confirmation de l’intégration génomique et 6) clonage par dilution limitante : l’intégration de la cassette d’expression pLEXSY-eGFP est confirmée par PCR diagnostique, à l’aide d’une amorce directe hybridant à la cassette d’expression et d’une amorce inverse hybridant à une séquence chromosomique absente de la cassette d’expression. Les cultures transfectées pourraient être enrichies pour les parasites fluorescents par clonage en limitant la dilution, et les clones ayant les intensités fluorescentes moyennes les plus élevées pourraient être sélectionnés pour d’autres applications. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Amplification et insertion du gène eGFP dans le vecteur pLEXSY-2.1

  1. Amplification du gène eGFP
    NOTE: Comme ce protocole utilise la famille de vecteurs pLEXSY-2.1 (voir Tableau des matériaux) pour l’expression constitutive des protéines cibles suite à l’intégration de la cassette d’expression dans le locus chromosomique de l’ARNr 18S (ssu) des espèces Leishmania , la première étape consiste à introduire dans le gène eGFP les séquences contenant les sites de restriction qui permettent son insertion dans les vecteurs pLEXSY-2.1. Dans ce cas, comme la eGFP ne doit être exprimée que par cytosolisme, les sites de restriction pour les enzymes BglII et KpnI ont été ajoutés aux extrémités 5' et 3' du gène eGFP, respectivement. Le clonage avec KpnI entraîne la fusion de la protéine cible en un marqueur polyhistidine C-terminal de six résidus, suivi d’un codon stop codé dans le plasmide pLEXSY-2.1 pour une purification ultérieure de la protéine d’intérêt. Pour cette raison, la séquence d’amorce inverse ne contient pas de codon stop.
    1. Selon la source plasmidique de l’eGFP, analyser la séquence cible à l’aide d’un outil d’analyse de restriction tel que NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 pour s’assurer qu’elle ne contient pas de sites internes pour les enzymes de restriction utilisées pour le clonage (BglII et KpnI) ou pour SwaI, qui est l’enzyme utilisée pour la linéarisation vectorielle avant la transfection.
    2. Concevoir des amorces avant et arrière pour l’amplification eGFP contenant les séquences de restriction BglII et KpnI. À titre d’exemple, la source eGFP pour ce protocole était le plasmide32 pEGFP-N1-1X, et les séquences d’amorce étaient celles rapportées par Bolhassani et al.27 :
      Abécédaire avant (EGFP1) : 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (site de restriction BglII en gras).
      Introduction inversée (EGFP2) : 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (site de restriction KpnI en gras).
    3. Amplifier le gène cible à l’aide d’une polymérase haute fidélité pour assurer la préservation de la séquence codante. À titre d’exemple, pour les amorces EGFP1 et EGFP2, exécutez le protocole de cycle PCR tel que rapporté par Bolhassani et al.27. Effectuer une dénaturation initiale de 2 min à 94 °C, suivie de 30 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 57 °C et 1 min à 72 °C. Exécutez une dernière étape d’extension de 10 min à 72 °C. Ajouter les amorces à une concentration finale de 0,2 μM.
    4. Purifier le fragment à l’aide d’une trousse de purification de produit PCR conventionnelle ou d’une précipitation standard d’acétate de sodium et d’éthanol, comme décrit ailleurs33.
  2. Insertion de l’eGFP dans le vecteur d’expression pLEXSY-2.1
    1. Coupez les extrémités du produit eGFP-PCR à l’aide de BglII et KpnI, en suivant les instructions du fabricant.
      1. Tout d’abord, configurez la réaction pour l’enzyme nécessitant la concentration de sel la plus faible (dans ce cas, KpnI), selon les instructions du fabricant, et incuber à 37 °C pendant 1 h.
      2. Ensuite, ajoutez 100 mM de NaCl et 10 unités de BglII et incuber pendant 15 min. Purifier la réaction, comme décrit à l’étape 1.1.4.
    2. Digérer le vecteur d’expression pLEXSY avec BglII et KpnI, en suivant le protocole de digestion séquentielle décrit à l’étape 1.2.1.
    3. Liiger le vecteur pLEXSY et le gène eGFP avec la T4 ligase en utilisant un rapport molaire de 1:3 (vector:insert). Ajouter brièvement 100 ng de pLEXSY digéré et 28 ng de produit eGFP digéré à une réaction de 20 μL contenant un tampon ligase à une concentration finale de 1x et 3 unités d’ADN ligase T4. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
    4. Transformer les cellules compétentes d’E. coli , telles que XL-10, DH5α ou DH10B, avec le produit de ligature obtenu à l’étape 1.2.3 à l’aide de protocoles de transformation standard33. Plaquer les cellules transformées dans de la gélose Luira-Bertani (LB)-ampicilline et incuber pendant 24 h à 30 °C pour sélectionner des clones recombinants (les plasmides pLEXSY sont plus stables chez E. coli à 30 °C qu’à 37 °C).
    5. Dépistage de la présence de l’insert dans les plasmides par PCR de colonie.
      1. Choisissez des colonies individuelles, remettez en suspension dans 20 μL d’eau exempte de nucléase, chauffez à 95 °C pendant 15 minutes et prenez 1 μL du lysat comme matrice d’ADN pour la PCR des colonies. Utiliser l’amorce directe pour l’amplification eGFP, décrite à l’étape 1.1.2 (dans cet exemple, EGFP1), et l’amorce A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') comme amorce inverse29.
      2. L’amorce A264 est conçue pour recuire 80 pb après le codon stop de l’insert dans les vecteurs d’expression pLEXSY-2.1. À titre d’exemple, pour la paire d’amorces EGFP1 + A264, utilisez un protocole de cycle PCR consistant en une dénaturation initiale de 2 min à 94 °C, suivie de 30 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 50 °C et 1 min à 72 °C. Exécutez une dernière étape d’extension de 10 min à 72 °C. Les amorces sont ajoutées à une concentration finale de 0,2 μM.
        REMARQUE: Le produit attendu utilisant ce jeu d’amorces a une longueur de 859 pb. Les sites de recuit des amorces EGFP1 et A264 sont représentés à la figure 2.
    6. Préparer l’ADN plasmidique purifié à partir d’un clone positif pour une transfection ultérieure à l’aide d’un kit d’isolation plasmidique commercial ou d’une précipitation alcaline standard33. Utiliser 50 mL d’une culture de nuit à 30 °C pour isoler un minimum de 10 μg de plasmide/clone positif.

2. Linéarisation du plasmide d’expression pLEXSY

  1. Utiliser au moins 10 μg du plasmide purifié pLEXSY-eGFP pour la digestion avec SwaI (site de reconnaissance : 5'-ATTTAAAT-3'). Assimiler pendant 3-4 h à 25 °C et inactiver la chaleur à 65 °C pendant 20 min.
  2. Exécutez le produit de digestion dans une électrophorèse sur gel d’agarose pour séparer les fragments obtenus. Cette digestion générera deux fragments, un fragment de 2,9 kbp représentant les éléments nécessaires à la réplication et à la sélection chez E. coli, et un fragment de 7-8 kbp représentant la cassette d’expression linéarisée.
  3. Purifier la cassette d’expression à l’aide d’une trousse commerciale d’extraction de gel d’agarose.

3. Transfection de L. panamensis et L. donovani par électroporation

NOTE: La culture de Leishmania est effectuée comme décrit ailleurs34. Dans cet exemple, L. panamensis et L. donovani promastigotes ont été cultivés dans le milieu insecte de Schneider, complétés par 20 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 50 μg/mL de gentamicine, et incubés à 26 °C.

  1. Cultiver les cultures de parasites jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de promastigotes en phase logarithmique ou en phase stationnaire précoce pour utiliser environ 4 x 107 parasites par transfection. La densité cellulaire maximale par fiole de culture avant d’atteindre la phase stationnaire peut varier en fonction de l’espèce de Leishmania et de l’adaptation des souches aux conditions de laboratoire. Mettez en commun le contenu de plusieurs flacons de culture si nécessaire.
  2. Centrifuger la culture parasitaire à 2 000 x g pendant 3 min à température ambiante (RT).
  3. Resuspendre la pastille dans un tampon d’électroporation à 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 et 6 mM glucose; pH 7,5)27 pour obtenir une concentration de 1 x 108 parasites/mL. Mettre sur la glace pendant 10 min.
    NOTE: Le tampon d’électroporation doit être stérilisé par filtration avant utilisation.
  4. En parallèle, des tubes de pré-refroidissement avec 2-10 μg de pLEXSY-eGFP linéarisé construisent dans un volume maximum de 50 μL d’eau ou 10 mM de tampon tris (pH 8,0) et des cuvettes d’électroporation de d = 2 mm.
  5. Ajouter 350 μL de parasites pré-refroidis dans le tube avec le plasmide linéarisé et transférer la totalité des 400 μL dans la cuvette d’électroporation sur glace. En parallèle, électroporate les cellules parasitaires sans ADN plasmidique comme contrôle négatif.
  6. Electroporate en utilisant l’un de ces deux protocoles :
    Décroissance exponentielle : 450 V, 450 μF, une impulsion.
    Constante de temps : 450 V, T = 3,5 ms, une impulsion.
    REMARQUE: Ces protocoles ont été exécutés à l’aide d’un pulseur de gènes commercial (Table of Materials) avec des modules PC et CE.
  7. Remettre la cuvette sur glace pendant 10 min et transférer les parasites électroporés dans 5 mL du milieu de culture approprié. Cet exemple a utilisé le milieu insecte de Schneider complété par 20% (v/v) FBS. Incuber à 26 °C pendant 20 h.

4. Sélection polyclonale en culture

  1. Environ 20 h après l’électroporation, observer les cultures au microscope. Au moins la moitié de la population parasitaire doit présenter une morphologie et une motilité visuellement bonnes (promastigotes ressemblant à des gouttes avec flagelle oscillant se déplaçant dans les milieux et/ou formant des agrégats parasitaires actifs). Ajouter l’antibiotique sélectif approprié en fonction du plasmide pLEXSY utilisé. Dans cet exemple, pLEXSY-sat2.1 est utilisé, qui contient la streptothricine acétyltransférase comme marqueur de sélection. Par conséquent, utilisez la nourséothricine comme antibiotique sélectif à une concentration de 0,1 mg / mL.
  2. Suivez les cultures au microscope jusqu’à ce qu’une différence claire entre les parasites électroporés avec et sans ADN plasmidique soit visible.
  3. Vérifier la fluorescence du parasite par cytométrie en flux.
    1. Centrifuger 1 mL de culture en phase stationnaire à 2 000 x g pendant 3 min à TA. Laver deux fois dans du PBS et remettre en suspension la pastille finale dans 1 mL de PBS.
      REMARQUE: La fluorescence de eGFP peut être détectée dans le canal FL1 de la plupart des cytomètres commerciaux. Les paramètres de gain pour la diffusion avant et latérale, et le canal FL1 peut varier d’un cytomètre à l’autre. Pour cet exemple, un cytomètre d’espace CyFlow (Sysmex) a été utilisé.
    2. Exécutez les échantillons, en collectant 20 000 événements à une vitesse de 0,5 μL/s, et définissez les valeurs de gain pour les canaux de diffusion directe (FSC), de diffusion latérale (SSC) et de fluorescence 1 (FL-1) sur 225,0, 200,0 et 520,0, respectivement. Exécuter un échantillon témoin avec des parasites non fluorescents pour déterminer la population parasitaire dans un diagramme à points FSC par rapport à SSC.
    3. Créez une porte (G1) contenant la population parasitaire et filtrez le canal FL-1 à travers cette porte pour déterminer l’autofluorescence des promastigotes et définir une porte de portée (G2) pour le canal FL-1.
    4. Exécutez les parasites transfectés pour vérifier s’il y a fluorescence. Notez le pourcentage de parasites fluorescents dans G1 et la moyenne de l’intensité de fluorescence dans G2.

5. Confirmation de l’intégration génomique

NOTE: L’intégration de la cassette d’expression pLEXSY-eGFP peut être confirmée par PCR diagnostique, en utilisant une amorce directe hybridant à la cassette d’expression (varie selon le vecteur pLEXSY-2.1 utilisé) et l’amorce inverse F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hybridant à une séquence chromosomique flanquante ssu absente dans la cassette d’expression. Dans cet exemple, l’amorce avant F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') est utilisée car elle s’hybride dans la cassette d’expression pLEXSY-sat2.1. Une représentation schématique des sites intégrés de recuit de la cassette d’expression et de l’amorce pour la PCR diagnostique est illustrée à la figure 2.

  1. Purifier l’ADN génomique de 2 à 5 mL d’une culture parasitaire en phase stationnaire par extraction conventionnelle de phénol/chloroforme35 ou avec une trousse commerciale.
  2. Effectuer la PCR diagnostique pour pLEXSY-sat2.1 à l’aide d’un protocole de cycle consistant en une dénaturation initiale de 2 min à 94 °C, suivie de 30 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 53 °C et 1 min à 72 °C. Exécutez une dernière étape d’extension de 10 min à 72 °C. Les amorces sont ajoutées à une concentration finale de 0,2 μM.

figure-protocol-2
Figure 2 : Représentation schématique de la cassette d’expression intégrée. Les boîtes étiquetées Chr-S (gris) représentent les séquences chromosomiques adjacentes du locus de l’ARNr 18S (ssu) dans lequel la cassette d’expression est intégrée. La cassette d’expression intégrée se compose de séquences 5' et 3' (bleu) pour la recombinaison homologue dans le locus ssu, d’un promoteur ribosomique Leishmania supplémentaire (rouge) pour une production accrue de protéines, du gène eGFP (vert), d’un gène marqueur de sélection (jaune) et de trois régions non traduites (gris clair)), à savoir utr1, 2 et 3, qui fournissent les signaux d’épissage pour le traitement post-transcriptionnel de l’ARNm pour une expression optimisée de l’eGFP et du marqueur de sélection chez les parasites Leishmania. Les sites de recuit pour les amorces avant et arrière utilisées pour vérifier la présence de l’insert par PCR de colonie (étape 1.2.5) sont marqués par les flèches noires étiquetées respectivement cpcr-fwd (amorce EGFP1) et cpcr-rev (amorce A264), qui délimitent un produit de 859 pb. Les sites de recuit pour les amorces avant et arrière utilisées pour la vérification de l’intégration génomique par PCR diagnostique (étape 5) sont marqués par les flèches noires étiquetées comme sat-fwd (F2999 primer) et ssu-rev (F3002 primer), respectivement, qui délimitent un produit de 2 271 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Clonage par limitation de la dilution (facultatif)

  1. Après confirmation de la fluorescence par cytométrie en flux, préparer une dilution de parasites recombinants à une concentration de cinq promastigotes/mL36.
  2. Ajouter 100 μL de cette dilution dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. De cette façon, les plaques sont ensemencées à une densité moyenne de 0,5 promastigotes/puits, ce qui garantit que certains puits reçoivent un seul parasite tout en minimisant la probabilité d’avoir plus d’un parasite par puits36.
  3. Laisser la plaque intacte pendant au moins 12 h. Suivez la plaque au microscope à un grossissement minimum de 100x jusqu’à ce que des puits avec une croissance parasitaire soient détectés.
  4. Lorsqu’un puits d’assiette est plein de parasites, utilisez le contenu pour inoculer une culture de 5 mL. Cela prend 1-2 semaines.
  5. Lorsque les cultures ensemencées par clonage atteignent la phase stationnaire, vérifier la fluorescence à l’aide de la cytométrie en flux, comme décrit à l’étape 4.3. Sélectionner les clones à utiliser pour d’autres essais in vitro et in vivo en fonction du pourcentage de parasites fluorescents et de l’intensité de fluorescence moyenne mesurée dans le canal FL-1. Visez les clones avec 98% à 99% de parasites fluorescents et sélectionnez ceux avec l’intensité de fluorescence moyenne la plus élevée.

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Résultats

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Après la construction de la construction pLEXSY-eGFP et la transformation des cellules E. coli compétentes, les colonies contenant la construction avec l’insert eGFP généreront un produit d’environ 859 pb après avoir exécuté la PCR de colonie décrite à la section 1.2 (figure 3A). La digestion totale du plasmide purifié à partir de colonies positives à l’aide de SwaI devrait donner deux fragments caractéristiques dans l’électrophorèse sur gel, un fragment de 2,9 kbp qui est ...

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Discussion

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Les avantages et les inconvénients de divers gènes rapporteurs ont été étudiés chez plusieurs parasites protozoaires. Parmi eux, GFP et eGFP sont intrinsèquement fluorescents et permettent une quantification et une imagerie faciles. L’activité fluorescente de ces protéines peut être détectée avec une manipulation minimale à l’aide de la microscopie à fluorescence, de la fluorimétrie ou de la cytométrie en flux. Peu d’études ont été réalisées pour générer une L exprimant la GFP. (Viannia), malgré la robu...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par le Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panama, numéro de subvention NI-177-2016, et Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panama, numéros de subvention SNI-169-2018, SNI-008-2022 et SNI-060-2022.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microplaques à 96 puitsCorningCLS3340Fond plat transparent, polystyrène noir, stérile, couvercle
AgaroseSigma-AldrichA4718
Sel sodique d’ampicillineSigma-AldrichA8351BioXtra, adapté à la culture cellulaire
BglIIenzyme de restriction New England BioLabsR0144S2 000 unités. 10 000 unités/mL
Fioles de culture cellulaireCorningCLS430168Surface 25 cm2, col incliné, capuchon (joint d’étanchéité)
Système d’imagerie ChemiDocBio-Rad17001401
CyFlow SpaceSysmexNon disponible
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021poudre, BioReagent, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire d’insectes, adapté à la culture cellulaire végétale, &ge ; 99.5 %
Sérum de bovin fœtalSigma-AldrichF7524
Tampon de charge en gelSigma-AldrichG2526  ; Le taux de migration varie en fonction de la composition du gel. Diluer 1:3 à 1:6 avec l’échantillon avant le chargement.
Système d’électroporation Gene Pulser XcellBio-Rad1652660Le système est composé d’une unité principale, de deux modules accessoires, du prolongateur de capacité (module CE) et du contrôleur d’impulsions (module PC), ainsi que d’une chambre de cuvette ShockPod.
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes d’électroporationBio-Rad1652086paquet de 50, 0,2 cm&ndash ; cuvette d’électroporation stérile à espace, à utiliser avec les systèmes Gene Pulser et MicroPulser, pour cellules de mammifères et autres cellules eucaryotes
Solution de gentamicineSigma-AldrichG139750 mg/mL dans de l’eau déminéralisée, liquide, 0,1 &mu ; m filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
GoTaq Long PCR Master MixPromegaM4021
HEPES solutionSigma-AldrichH08871 M, pH 7,0-7,6, stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
Microscope inverséOlympusIXplore Standard
KpnI-HF enzyme de restrictionNew England BioLabsR3142S4 000 unités. 20 000 unités/mL
LB Bouillon à géloseSigma-AldrichL3147Milieu de croissance microbienne riche en nutriments hautement référencé avec agar, adapté aux milieux réguliers  ; E. coli  ; culture.
LB Bouillon  ;Sigma-AldrichL2542Milieu de croissance microbienne liquide
Mini-Sub Cell GT Système d’électrophorèse horizontalBio-Rad1640300Mini système d’électrophorèse horizontale, comprend des peignes à 8 et 15 puits, un plateau transparent aux UV de 7 cm x 10 cm
pEGFP-N1-1xAddgene172281Expression de l’ARNm eGFP fusionné avec 1 répétition en tandem d’une séquence de 50 bases
kit d’expression pLEXSYcon2.1Jena BioscienceEGE-1310satContient le vecteur d’expression constitutive intégratif pLEXSY-sat2.1. Sélection antibiotique des transfectants avec Nourseothricine (NTC, clonNAT). Contient toutes les amorces pour les PCR diagnostiques et le séquençage.
Chlorure de potassiumMillipore529552Biologie moléculaire - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222Jusqu’à 15 &mu ; g de plasmide prêt à la transfection à partir de cultures de 3 ml.
Schneider&prime ; s Milieu pour insectesSigma-AldrichS0146Milieu utilisé dans notre laboratoire pour l’élevage de Leishmania.
SOC MediumSigma-AldrichS1797
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS3014pour la biologie moléculaire, la DNase, la RNase et la protéase, aucun détecté, &ge ; 99 % (titrage)
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-AldrichRDD038BioReagent, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire d’insectes, &ge ; 99,0 %, à écoulement libre, enzyme de restriction Redi-Dri
SwaI New England BioLabsR0604S2 000 unités. 10 000 unités/mL
Filtres à seringueCorningCLS431212membrane en cellulose régénérée, diam. 4  ; mm, taille des pores 0,2  ; &mu ; Thermocycleur m
T100Bio-Rad1861096Système de thermocycleur, comprend un thermocycleur à 96 puits, un cordon d’alimentation, un anneau de support de tube
T4 DNA LigasePromegaM1801Relie deux brins d’ADN avec des extrémités cohésives ou émoussées
Tampon Tris-Borate-EDTASigma-AldrichT4415BioReagent, adapté à l’électrophorèse, concentré 10 fois
Wizard Genomic DNA Kit de purificationPromegaA1120
Wizard SV Système de nettoyage en gel et PCRPromegaA9285
XL10-Gold Cellules UltracompétentesAgilent200317XL10-Gold Kanr Cellules Ultracompétentes, 10 x 0,1 mL. Dispose du gène de résistance à la kanamycine sur l’épisome F', pour un clonage extrêmement exigeant chez les vecteurs résistants au chloramphénicol. Efficacité : > 5 x 10 9 transformants/µ ; g pUC18.

Références

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Souches de Leishmaniaexpression de l eGFPcytom trie en fluxtransfection de parasitesparasites recombinantsr action de polym risation en cha nelin arisation de plasmideessais de criblage de m dicamentsclonage de promastigotespurification sur gel d agarose

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