Method Article

Explorer les fonctions du tissu adipeux

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTICLES DISCUTÉS :

Cho, D. S., Doles, J. D. Préparation de cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaires de souris. Journal des expériences visualisées. (162), DOI : 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogéniques et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins. Journal des expériences visualisées. (162), DOI : 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. Isolement d’adipocytes viables et de fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages. Journal des expériences visualisées. (164), DOI : 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Exploration de la structure du tissu adipeux par clarification du méthylsalicylate et imagerie 3D. Journal des expériences visualisées. (162), DOI : 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. Analyse des réseaux lymphatiques et sanguins pendant l’obésité. Journal des expériences visualisées. (165), DOI : 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction adipocytaire. Journal des expériences visualisées. (171), DOI : 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolement, prolifération et différenciation des cellules souches dérivées du tissu adipeux du macaque rhésus. Journal des expériences visualisées. (171), DOI : 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Culture adipocytaire tridimensionnelle comme modèle pour étudier le remodelage du tissu adipeux blanc induit par la cachexie. Journal des expériences visualisées. (167), DOI : 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolement et caractérisation de vésicules extracellulaires dérivées d’adipocytes humains à l’aide de la filtration et de l’ultracentrifugation. Journal des expériences visualisées. (170), DOI : 10.3791/61979 (2021).

Discussion

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Caractérisée par une augmentation de la masse du tissu adipeux (AT) et un remodelage pro-inflammatoire des cellules immunitaires AT, l’obésité est devenue un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, car elle augmente considérablement le risque de développer des maladies cardiovasculaires, un diabète de type 2 et des maladies du foie. Par conséquent, l’exploration de la structure et de la fonction de l’AT est devenue un défi clinique important. Dans cette collection de méthodes, nous présentons plusieurs méthodes de pointe développées pour étudier la structure et la fonction du TA dans des conditions physiologiques et pathologiques.

L’AT est un tissu hétérogène composé de plusieurs populations cellulaires, notamment des adipocytes matures, des cellules progénitrices adipeuses (APC), des progéniteurs fibro-inflammatoires (FIP), des cellules endothéliales et des cellules immunitaires. Par conséquent, afin de caractériser ce tissu, un phénotypage unicellulaire peut être effectué. Dans leurs articles, Cho et al. et Peics et al. fournissent des protocoles pour isoler et caractériser les APC blancs résidant dans l’AT de souris par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)1,2. Cette étape est cruciale non seulement pour compter le nombre d’APC résidents, qui est un facteur important pour déterminer la capacité d’expansion de l’AT, mais aussi pour explorer davantage la fonction de ces cellules au niveau de la cellule unique. Peics et al. proposent également une méthode pour isoler les FIPs2 de souris blanches résidentes de l’AT, des cellules productrices de collagène non adipogéniques qui peuvent contribuer au développement d’un phénotype pro-inflammatoire connu pour jouer un rôle dans le dysfonctionnement de l’AT. De même, Estrada-Gutierrez et al. décrivent un protocole permettant d’isoler simultanément des adipocytes matures viables et des cellules de fraction vasculaire stromale à partir de biopsies viscérales humaines de TA3. Dans l’ensemble, ces protocoles constituent l’étalon-or pour générer une suspension de cellules uniques à partir d’AT humaine et de souris, ce qui constitue la première étape critique pour compter davantage et phénotyper fonctionnellement les différentes sous-populations de cellules AT.

La relation entre la structure et la fonction est très pertinente dans l’AT. Une caractéristique du dysfonctionnement de l’AT pendant l’obésité est liée à l’augmentation de la taille des adipocytes et à un remodelage profond de l’AT. Ce remodelage impacte non seulement les populations de cellules adipocytaires et immunitaires, mais aussi le réseau lymphatique et le réseau des vaisseaux sanguins. Pour apprécier ces modifications dans l’ensemble de l’AT, Gilleron et al. développent un protocole de compensation AT très simple, peu coûteux et rapide4. Ce protocole simple permet de visualiser en trois dimensions la morphologie des biopsies entières de TA de souris et de grandes biopsies de TA humaines. Cela inclut les réseaux neuronaux et vasculaires, les adipocytes et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires, qui sont tous des paramètres importants à étudier dans l’obésité et ses pathologies associées. Pour caractériser l’impact de l’obésité sur les vaisseaux lymphatiques et sanguins du TA, Czepielewski et al. proposent une méthode in vivo pour colorer simultanément l’arborisation lymphatique et les vaisseaux sanguins en injectant des lectines conjuguées au fluorochrome5. Ce protocole permet d’analyser la morphologie in vivo des deux réseaux, y compris leur densité, leur volume et leur ramification. Il est intéressant de noter que la combinaison de cette stratégie de marquage avec une procédure d’effacement de l’AT4 permet une cartographie à haute résolution de l’ensemble de l’AT de la souris en trois dimensions (3D)5. Dans l’ensemble, ces approches peuvent caractériser la structure de l’AT dans des conditions physiologiques et physiopathologiques, ce qui permet de mieux comprendre la corrélation entre la structure et la fonction de l’AT.

En raison de sa grande hétérogénéité et de sa formidable capacité de remodelage, l’analyse de la fonction des adipocytes au sein de l’AT in vivo n’est pas simple, et plusieurs systèmes de culture ont donc été développés. Le principal avantage de tous ces systèmes de culture cellulaire est le haut niveau de contrôle sur la population cellulaire et le micro-environnement. Jager et al. développent un protocole simple pour manipuler l’expression de l’ARN dans les adipocytes matures différenciés 3T3-L16. Bien que ce système de culture soit loin d’être les conditions physiologiques idéales, les adipocytes 3T3-L1 restent fonctionnels en ce qui concerne la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipogenèse et la lipolyse. Par conséquent, ce protocole fournit un outil puissant pour manipuler l’expression des protéines et des ARN non codants et étudier leur rôle sur les fonctions adipocytaires. Pour se rapprocher des conditions physiologiques idéales, Poret et al. décrivent une méthode pour générer des adipocytes matures fonctionnels en utilisant des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) obtenues à partir d’un macaque rhésus AT7. Ce protocole explique comment isoler les ADSC primaires et comment induire leur prolifération et leur différenciation. Les auteurs suggèrent en outre que cette procédure pourrait être adaptée à d’autres espèces. Bien que ce système de culture soit plus proche des conditions physiologiques idéales par rapport à la lignée cellulaire 3T3-L1, les adipocytes matures dérivés des ADSC primaires sont cultivés en 2D, ce qui est différent de l’in vivo. Pour faire face à ce problème, Batista Jr. et al. fournissent un protocole efficace pour un système de culture tissulaire d’impression tridimensionnelle8. Dans ce travail, les auteurs génèrent des adiposphéroïdes à partir de cellules de fraction vasculaire stromale de souris, et ils différencient les précurseurs adipocytaires directement dans ce système de culture 3D. Cette approche est irrévocablement plus proche des conditions physiologiques idéales que la méthode de culture 2D, mais l’absence de vaisseaux qui pourraient apporter des nutriments aux adipocytes au centre des sphéroïdes doit être prise en considération. La modulation de l’expression des protéines et de l’ARN non codant, telle que décrite6, au sein de ces systèmes de culture pourrait permettre de mieux comprendre le rôle fonctionnel de ces cibles dans des adipocytes plus pertinents sur le plan physiologique. Cependant, un système aussi complexe reste à mettre en place. L’intérêt majeur de ces systèmes de culture ex vivo/in vitro est le haut niveau de contrôle sur le microenvironnement, qui inclut également les facteurs sécrétés par les cellules. À cet égard, le protocole d’Akbar et al. isole et caractérise les vésicules extracellulaires (VE) sécrétées par les adipocytes humains9. Récemment, on a constaté que les VE étaient d’importants régulateurs métaboliques ; Cette méthode est obligatoire pour analyser l’impact métabolique de ces VE dérivées d’adipocytes dans différentes situations métaboliques.

Dans la présente collection de méthodes, nous donnons un aperçu des protocoles de pointe couvrant plusieurs aspects de l’analyse AT, y compris les systèmes de culture ex vivo et in vitro , l’exploration 3D de tissus entiers et l’analyse de cellules uniques. Bien qu’aucun système de culture ne soit parfait, il est important de choisir le système de culture adapté à la question biologique. Par conséquent, cette collection de méthodes fournit une large boîte à outils de procédures pour isoler, différencier et manipuler les adipocytes in vitro. La combinaison de toutes les différentes méthodes décrites ici permettra de mieux comprendre la morphologie et la fonction de l’AT.

Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à révéler

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Jean-François Tanti et Mireille Cormont pour leur soutien scientifique et leurs contributions. Ces travaux ont été soutenus par l’INSERM, Université Côte d’Azur, et par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) à travers le Labex d’Investissements d’Avenir SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), le programme UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01), et le Programme Jeune Chercheur à J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) et à J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

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  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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