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Tous les organismes multicellulaires sur terre, y compris les animaux et les plantes, ont évolué à partir d’eucaryotes unicellulaires il y a ~1,7 milliard d’années1. Distinctes des procaryotes primitifs, les cellules eucaryotes ont un noyau délimité par une membrane et de nombreux organites entourés de membranes dans leur cytoplasme, y compris les mitochondries, l’appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique (RE), les lysosomes et les vésicules. Ces organites forment des compartiments dans lesquels sont localisées des fonctions biologiques spécialisées et des activités métaboliques très efficaces. En raison de la résolution limitée de la microscopie optique, la plupart des organites intracellulaires contiennent des structures fonctionnelles qui tombent en dessous de la limite de diffraction de la lumière, ce qui rend leur visualisation difficile2. Des techniques innovantes de marquage microscopique et biologique commencent à permettre la visualisation à haute résolution d’architectures ultrafines et la dynamique in vivo des organites. Cette collection rassemble des méthodes récentes qui ont réussi à étiqueter et à imager différents organites intracellulaires chez différentes espèces et, ainsi, ont approfondi notre compréhension de la régulation spatio-temporelle de la biologie des organites.
Au cours des dernières décennies, le développement de capteurs fluorescents et le marquage de protéines dans les cellules vivantes ont grandement facilité notre compréhension de la dynamique des réseaux intracellulaires, de la transduction du signal et des interactions cellule-cellule. En utilisant des méthodes synthétiques inorganiques avancées, des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents de taille nanométrique, également connus sous le nom de points quantiques ou QD, ont été inventés en tant que nouvelle classe de rapporteurs optiques. Normalement, les particules QD ont une taille comprise entre 2 et 10 nm et ont une photosensibilité élevée, une stabilité et une faible cytotoxicité pour les cellules. Les particules QD sont apparues comme des alternatives aux colorants organiques et aux protéines fluorescentes pour l’imagerie des processus intracellulaires à haute résolution. Dans le protocole d’Aishwarya et al., les auteurs décrivent un immunomarquage médié par QD suivi d’une imagerie par microscopie électronique à transmission (TEM)3. En effectuant un marquage et une imagerie QD ciblés par anticorps sous TEM à super-résolution, les auteurs ont réussi à visualiser la localisation de Sigmar1 sur plusieurs organites cellulaires dans des cellules cardiaques de souris adultes et ont mis en évidence son enrichissement sur les lysosomes et les membranes mitochondriales. En plus de souligner la haute résolution et la haute sensibilité du QD-TEM, les auteurs mentionnent également plusieurs inconvénients des méthodes. Par exemple, le tétroxyde d’osmium utilisé dans l’immunomarquage médié par QD détruit de manière irréversible les propriétés de l’échantillon, et l’optimisation des étapes de fixation et de démasquage de l’antigène est un élément clé mais difficile pour garantir des images de haute qualité.
Outre le QD, de nombreux autres colorants différents ont été appliqués avec succès pour le marquage des organites dans les cellules vivantes. Ces méthodes ont facilité l’imagerie en direct du processus de transformation ou de translocation des organites cellulaires in vivo. Parfois, plusieurs colorants spécifiques aux organites sont utilisés pour visualiser simultanément différents types d’organites. Dans le protocole de Liu, Li et al.4, les auteurs fournissent un protocole détaillé pour la coloration en direct et l’imagerie des mitochondries et des lysosomes dans les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en utilisant deux colorants différents : MitoTracker Green et LysoTracker Red4. Dans cette étude, les deux colorants ont montré une sensibilité à la fluorescence élevée et une stabilité spécifiques aux mitochondries et aux lysosomes, respectivement. De plus, les auteurs ont observé et enregistré avec succès le processus cellulaire critique in vivo de la mitophagie induit par le cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans les cellules MEF en utilisant le protocole. Dans la discussion, les auteurs mentionnent que le protocole peut être appliqué avec différentes lignées cellulaires ou cellules de tissus en optimisant la concentration de colorant et le temps de coloration.
En utilisant des constructions rapporteures composées de protéines spécifiques aux organites fusionnées à des marqueurs fluorescents, on peut observer in vivo la dynamique et les modèles d’expression des organites sans immunomarquage. Dans le protocole de Liu, Zhu et al.5, les auteurs fournissent un protocole détaillé pour l’imagerie de la plupart des types d’organites subcellulaires chez la levure bourgeonnante vivante, Saccharomyces cerevisiae5. Pour les débutants travaillant avec des levures en herbe, ce protocole est utile pour apprendre à identifier la localisation subcellulaire des protéines et à suivre les organites d’intérêt à l’aide de l’imagerie en accéléré. Une limite du protocole est que la plupart des constructions utilisées dans le protocole ne peuvent pas être utilisées pour marquer les organites d’autres espèces. Pour différents types de cellules eucaryotes, les modèles spécifiques aux organites des protéines fluorescentes devraient encore être validés par immunomarquage par anticorps.
Un test d’absorption d’anticorps a d’abord été mis au point pour le marquage en direct spécifique de la signalisation endosomale Notch/Delta dans les précurseurs des organes sensoriels de la drosophile notum6. En raison de la nature sensible au dosage de la signalisation Notch/Delta, l’expression d’une construction rapporteure à l’intérieur des cellules n’est pas adaptée à la visualisation de la signalisation Notch/Delta in vivo, car une copie supplémentaire du gène fusionné au rapporteur interromprait la signalisation normale et, par conséquent, le destin cellulaire. Dans le protocole de Zhao et Guo7, les auteurs appliquent le test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie du trafic endosomal Notch/Delta dans les progéniteurs de la glie radiale du cerveau du poisson-zèbreen développement 7. Dans le protocole, après avoir micro-injecté l’anticorps conjugué anti-DeltaD-Atto647N avec précision dans le ventricule postérieur embryonnaire à 24 hpf (heures après la fécondation), l’ensemble du processus de trafic endosomal est enregistré à l’aide de l’anticorps anti-DeltaD-Atto647N internalisé tout au long de la mitose des progéniteurs de la glie radiale. Dans l’étude, il a été constaté que le test d’absorption des anticorps n’interférait pas avec la signalisation Notch/Delta. Ce protocole peut être utilisé pour visualiser d’autres signaux ligands-récepteurs membranaires, à condition qu’un anticorps contre le domaine extracellulaire de la protéine d’intérêt soit disponible.
Les développements récents de la microscopie à expansion (ExM), qui consiste à élargir physiquement l’échantillon dans un hydrogel gonflant, ont permis d’utiliser des microscopes confocaux conventionnels pour l’imagerie à super-résolution. Depuis son invention, ExM a été testé avec de nombreux types d’échantillons biologiques8. L’un des principaux défis de l’ExM est la perte de signal fluorescent pendant les étapes de polymérisation et de digestion. La fonction ExM de rétention d’étiquette, récemment développée, a résolu le problème des ancrages trifonctionnels9. Dans le protocole de Park et al.10, les auteurs décrivent comment effectuer la rétention d’étiquette ExM (LR-ExM) avec un ensemble d’ancres trifonctionnelles10. Le protocole améliore l’imagerie par microscopie à expansion non seulement en empêchant la perte de signal, mais aussi en favorisant un marquage à haute efficacité avec des balises SNAP ou CLIP. Dans leur étude, les auteurs ont réussi à démontrer le LR-ExM multicolore pour une variété de structures subcellulaires et ont obtenu une résolution monomoléculaire en combinant le LR-ExM avec la microscopie de reconstruction optique stochastique à super-résolution (STORM).
Avec le développement rapide de la microscopie à super-résolution et l’avènement de nouvelles techniques de marquage fluorescent, nous pouvons nous attendre à de nouvelles améliorations dans les méthodes et les protocoles de visualisation des organites intracellulaires à une résolution sans précédent. Ces efforts sont sur le point d’apporter de nouvelles percées dans la compréhension de la dynamique et des fonctions des organites intracellulaires.