Article de méthode

Dissection de souris du système nerveux central et périphérique entier

DOI :

10.3791/64974

⸱

24 février 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Functional Genomics, Université de Sherbrooke, 2Department of Dermatology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Department of Pathology, Université de Sherbrooke, 4Centre de Recherche du Centre Hospitalier de Universitaire de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 5Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 6UTSW Comprehensive Neurofibromatosis Clinic, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 7Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour compléter la dissection des systèmes nerveux central et périphérique de souris. Les tissus disséqués sont analysés plus en détail dans des applications en aval, telles que la prise de photos grossières ou l’histologie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modèles animaux représentent le cheval de bataille du domaine des neurosciences. Malgré cela, il n’existe toujours pas aujourd’hui de protocole étape par étape pour disséquer un système nerveux complet de rongeur, ni de schéma complet le représentant qui soit disponible gratuitement. Seules des méthodes pour prélever le cerveau, la moelle épinière, un ganglion spécifique de la racine dorsale et le nerf sciatique (séparément) sont disponibles. Ici, nous fournissons des images détaillées et un schéma du système nerveux murin central et périphérique. Plus important encore, nous décrivons une procédure robuste pour effectuer sa dissection. L’étape de pré-dissection de 30 minutes permet d’isoler le système nerveux intact à l’intérieur de la vertèbre avec des muscles exempts de viscères et de peau. Une dissection de 2 à 4 heures est suivie sous un microscope de micro-dissection pour exposer la moelle épinière et les nerfs thoraciques, et enfin décoller tout le système nerveux central et périphérique de la carcasse. Ce protocole représente une avancée significative dans l’étude de l’anatomie et de la physiopathologie du système nerveux à l’échelle mondiale. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale disséqués d’un modèle de souris de neurofibromatose de type I peuvent être traités davantage pour l’histologie afin de démêler les changements dans la progression tumorale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif global de cette méthode est d’isoler le système nerveux central et périphérique d’une souris en un seul morceau. Il n’existe actuellement aucun protocole permettant de disséquer l’ensemble du système nerveux d’un rongeur pour l’étudier au niveau mondial. Les neuroscientifiques utilisent généralement le nerf sciatique comme substitut de tout nerf périphérique1, et lesganglions L3 à L5 2 comme substitut de tout ganglion. En utilisant ces méthodes, il est impossible de conclure si les résultats sont spécifiques au nerf/ganglion particulier. Comme on sait qu’au moins certaines pathologies nerveuses n’affectent pas tous les nerfs et ganglions de la même manière 3,4,5, il faut développer une technique pour permettre l’isolement de l’ensemble du système nerveux des rongeurs afin de l’étudier globalement.

Au fil des ans, nous avons développé et affiné une méthode pour disséquer l’ensemble des systèmes nerveux central et périphérique de la souris. La première étape consiste essentiellement en une dissection grossière des souris en préparation des étapes de micro-dissection sous le microscope de dissection. Dans les étapes 2 à 4, la moelle épinière et les nerfs thoraciques sont exposés, le cerveau est disséqué et toute la moelle épinière et les nerfs périphériques sont décollés de la carcasse.

Cette méthode est puissante lorsqu’elle est couplée à l’imagerie ou à l’histologie pour documenter tout changement macroscopique ou microscopique 6,7,8,9. Les neuroscientifiques intéressés à étudier le changement global ou à mener des expériences non fondées sur des hypothèses devraient utiliser cette méthode pour étudier le système nerveux global.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux de l’Université de Sherbrooke, une institution certifiée par le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Préparation à la micro-dissection (pré-dissection)

  1. Effectuez une anesthésie avec 5 % d’isoflurane, suivie d’une euthanasie avec 2 % d’isoflurane et 10 psi de CO2 jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signes vitaux.
    REMARQUE : N’effectuez pas de luxation cervicale, car cela endommage la moelle épinière et les ganglions cervicaux.
  2. Placez la souris euthanasiée vers le haut (vue antérieure) sur un tampon de dissection et vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %.
  3. Ensuite, épinglez les membres supérieurs et inférieurs, à l’aide de quatre broches de petit diamètre pour maintenir la souris en position pendant la dissection.
  4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, ouvrez la peau du bas-ventre à la gorge.
  5. Décollez la peau pour exposer les organes internes et utilisez des broches supplémentaires pour maintenir la peau de chaque côté tout en exposant la cavité abdominale.
  6. Ouvrez la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
  7. À l’aide d’une paire de pinces anatomiques standard, saisissez l’œsophage et la trachée et coupez juste au-dessus de la pince.
  8. Ensuite, commencez à décoller tous les organes internes dans une approche crânienne à caudale. Pour ce faire, coupez le diaphragme le long de la colonne vertébrale pour retirer tous les organes internes en un seul morceau.
  9. Détachez la souris et rincez le sang de souris supplémentaire de la cavité abdominale dans un évier.
  10. Placez la souris face cachée (vue postérieure). Épinglez les membres supérieurs et inférieurs, à l’aide de quatre goupilles pour maintenir la souris en position pendant la dissection.
  11. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, décollez la peau de la tête vers les membres postérieurs.
  12. Exposez le nerf sciatique gauche (membre inférieur).
    1. Coupez les muscles de la partie inférieure du membre inférieur gauche.
    2. Localisez et exposez le nerf sciatique en retirant le muscle qui l’entoure.
    3. Coupez soigneusement le nerf sciatique au niveau de la ramification des nerfs sural, tibial et péronier, et épargnez les vaisseaux sanguins.
    4. Continuez à isoler le nerf sciatique à l’aide d’une pince anatomique standard et de ciseaux de Bonn extra fins, jusqu’à ce qu’il devienne parallèle à la colonne vertébrale, en laissant un nerf libre d’environ 2 cm.
    5. Insérez les ciseaux chirurgicaux parallèlement à la moelle épinière et coupez la hanche.
    6. Disloquez la hanche en écartant le sacrum et le fémur à l’aide des doigts.
      REMARQUE : Au cours de ce processus, il est nécessaire de s’arrêter fréquemment pour tirer doucement le nerf sciatique à l’aide d’une pince pour éviter de perturber.
    7. À la fin, arrachez délicatement le membre postérieur de la carcasse de la souris, en laissant un nerf sciatique d’environ 4 cm de long.
      REMARQUE : Au cours de ce processus, localisez le nerf L2 et retirez-le du membre postérieur pour éviter d’endommager le L2. Répétez l’étape 1.12 pour le côté droit.
  13. Exposez les nerfs brachiaux (membres supérieurs).
    1. Manipulez la carcasse de la souris dans les mains, plutôt que sur une surface plane (tampon de dissection).
    2. Localisez le plexus brachial gauche en séparant la graisse et les muscles de l’aisselle gauche.
    3. Une fois localisé, coupez les principales ramifications du plexus brachial (radialement, axillaire, supra-scapulaire) et leurs sous-ramifications autour du cubitus avec des ciseaux de Bonn extra fins, en laissant des nerfs libres d’environ 1,5 cm. Décollez doucement le plexus du membre supérieur gauche.
    4. Luxation du membre supérieur gauche ; Assurez-vous qu’il est sans nerfs. Répétez l’étape 1.13 pour le côté droit.
  14. Exposez le cerveau.
    1. Maintenant, placez la souris face vers le haut (vue antérieure)
    2. Insérez une lame des ciseaux Bonn extra fins dans la bouche et coupez la mandibule dans la gorge.
    3. Retirez la mandibule en coupant davantage des joues vers la gorge.
    4. Ensuite, coupez l’os du crâne en passant d’une oreille à l’autre.
      REMARQUE : Veillez à ne pas aller trop profondément et à endommager le cerveau.
    5. Coupez et retirez le palais et les os du nez pour ouvrir le crâne.
    6. Coupez la vertèbre C1 à la base du crâne, libérant le cervelet et le début de la moelle épinière.
    7. Enfin, coupez le crâne transversalement jusqu’à l’œil et retirez les morceaux du crâne pour exposer le cerveau.
      REMARQUE : Gardez le cerveau dans sa cavité jusqu’à ce que les nerfs soient décollés.
  15. Retirez tout excès de graisse ou de muscles de la carcasse. Placez la carcasse dans du formol à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante (RT), suivie de brefs lavages salins tamponnés au phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’odeur fixatrice, et passez à l’étape suivante.
    REMARQUE : Si le système nerveux est disséqué dans les 2 prochaines semaines, conservez-le à 4 °C dans du PBS. Sinon, conservez-le indéfiniment dans du formol à 10 %. Utilisez toujours une cagoule chimique lorsque vous manipulez le formol.

2. Exposition de la moelle épinière

  1. Pour exposer la moelle épinière, utilisez une approche crânienne-caudale. Pour retirer chaque vertèbre et leur couche musculaire au-dessus, coupez aux positions dix heures et deux heures sur le côté ventral, à l’aide de ciseaux à ressort Vannas. Ébrécher la vertèbre à l’aide d’une mini-pince Dumont. Continuez ce processus à travers les vertèbres cervicales et thoraciques.
  2. Pour la section lombaire, coupez l’apophyse transversale de chaque côté de la vertèbre. Ensuite, coupez aux positions deux heures et dix heures en insérant la lame d’une paire de ciseaux à ressort Vannas dans le canal vertébral. Retirez les tissus en faisant attention aux nerfs qui sont parfois collés aux os.
  3. Procédez de la même manière pour la partie caudale.

3. Exposition du nerf thoracique

  1. Placez la carcasse sous le microscope de dissection pour visualiser la face antérieure.
  2. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas, coupez le long de chaque côte (du sternum aux membres inférieurs) pour exposer les nerfs périphériques.
  3. Ensuite, coupez la vertèbre des deux côtés (latéralement) du ganglion pour exposer le ganglion.

4. Décollement des nerfs périphériques

  1. Pour décoller la moelle épinière et déloger davantage les nerfs périphériques, utilisez la mini-pince Dumont pour rouler doucement la moelle épinière et retirer les nerfs un par un, en commençant par la partie caudale de la moelle épinière.
    REMARQUE : Avant de décoller, une fixation supplémentaire peut être effectuée dans du formol à 10 % pendant 15 min à RT, suivie de brefs lavages 1x PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’odeur de fixateur, comme effectué à l’étape 1.15.
  2. Pour la partie thoracique, tirez le nerf à un angle de 90° (perpendiculaire à la moelle épinière).
  3. Pour le plexus brachial, coupez la vertèbre à côté du nerf, pour faire de la place au nerf.
    REMARQUE : Le plexus brachial ne peut pas être passé sous la vertèbre, comme dans la région thoracique.
  4. Retirez les muscles en excès pour dégager les nerfs.
  5. Conserver dans du PBS à 4 °C jusqu’à un total de 2 semaines, ou indéfiniment dans du formol à 10 % à RT.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les rongeurs ont joué un rôle déterminant dans notre compréhension de la biologie du système nerveux et de la physiopathologie10. Curieusement, aucune méthode ne présente la dissection complète du système nerveux central et périphérique d’un rongeur pour évaluer l’anatomie et la variation pathologique dans un modèle en temps réel 1,2,11. La figure 1 présente un aperçu des éta...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour éviter que les muscles et les nerfs ne se dessèchent, la carcasse doit être trempée dans du PBS toutes les 10 minutes. Lors de la luxation des membres inférieurs (étape 1.12.6), il est important de toujours avoir le plexus du nerf sciatique et la L2 en vue pour éviter de l’endommager/déchirer. Lors de la dissection du cerveau (étape 1.14.4), il est essentiel d’éviter d’aller trop loin pour ne pas endommager le cerveau. Lors de la dissection des ganglions de la racine dorsale et des ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JPB est un chercheur boursier FRSQ J1 et récipiendaire du Early Investigator Research Award du département de la Défense des États-Unis. LQL est titulaire d’un prix de carrière pour les scientifiques médicaux du Burroughs Wellcome Fund et de la chaire Thomas L. Shields, M.D. en dermatologie.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mini-pince DumontFine Science Tools#11200-10
Ciseaux de Bonn supplémentairesFine Science Tools#14084-08
Formalin 10 %Fischer Scientific#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
Pince anatomique standardFine Science Tools#91100-12
Ciseaux chirurgicauxFine Science Tools#140001-12
Ciseaux à ressort VannasKent Scientific#INS600124

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Dissection du syst me nerveuxsyst me nerveux centraldissection de sourisisolation de la moelle pini reganglion spinaldissection du nerf sciatiquemicroscope de microdissectionmod le murin de neurofibromatoseanatomie du syst me nerveux
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes