Article de méthode

Approches basées sur la spectrométrie de masse pour l’analyse de la structure d’ordre supérieur des protéines

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DOI :

10.3791/64979

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3 mars 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

Dans cet article

Résumé

ARTICLES DISCUTÉS :

Espino, J. A., Jones, L. M. Empreinte protéique des radicaux hydroxyles in vivo pour l’étude des interactions protéiques chez Caenorhabditis elegans. Journal des expériences visualisées. (158), E60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Caractérisation des protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide des protéines dans la cellule. Journal des expériences visualisées. (157), E60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Approches par spectrométrie de masse pour étudier la structure et les interactions des protéines dans les poudres lyophilisées. Journal des expériences visualisées. (98), E52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Une plateforme de spectrométrie de masse par échange d’hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour l’étude des enzymes de biosynthèse peptidique. Journal des expériences visualisées. (159), E61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Marquage covalent avec du diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse. Journal des expériences visualisées. (172), E61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Incubateur à plate-forme avec étage XY mobile : Une nouvelle plate-forme pour la mise en œuvre de l’oxydation photochimique rapide des protéines dans la cellule. Journal des expériences visualisées. (171), E62153 (2021).

Haupt, C. et al. Combinaison de la réticulation chimique et de la spectrométrie de masse de complexes protéiques intacts pour étudier l’architecture d’assemblages de protéines multi-sous-unitaires. Journal des expériences visualisées. (129), E56747 (2017).

Lento, C. et al. Spectrométrie de masse d’échange d’hydrogène-deutérium par ionisation par électronébulisation résolue en temps pour l’étude de la structure et de la dynamique des protéines. Journal des expériences visualisées. (122), E55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Empreinte protéique de radical hydroxyle sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines. Journal des expériences visualisées. (172), E61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Permettre la compensation en temps réel dans les oxydations photochimiques rapides des protéines pour la détermination des changements de topographie des protéines. Journal des expériences visualisées. (163), E61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante. Journal des expériences visualisées. (172), E62672 (2021).

Éditorial

La structure d’ordre supérieur (HOS) est un aspect important de la caractérisation des protéines, car elle est étroitement liée à la fonction des protéines. La spectrométrie de masse (MS) est l’une des principales méthodes d’évaluation de la protéine HOS1. Bien que les approches basées sur la spectrométrie de masse ne soient pas en mesure de résoudre la structure des protéines avec une résolution atomique, elles présentent les avantages d’une résolution spatiale moyenne à élevée, d’une spécificité élevée, de faibles exigences en matière de quantité d’échantillons, d’un débit élevé et de capacités protéomiques.

Les approches d’empreinte protéique basées sur la MS évaluent la HOS de la protéine en analysant la surface accessible au solvant de la protéine, et elles sont généralement associées à différentes approches de marquage chimique. Le marquage réversible, par exemple par échange hydrogène-deutérium (HDX), cible les hydrogènes amides de squelette dans la protéine 1,2. L’étiquetage irréversible utilise soit des produits chimiques qui ciblent des résidus d’acides aminés spécifiques3, soit des radicaux qui marquent une variété de résidus différents avec une vitesse de réaction plus élevée1. La réticulation chimique fait également partie de la catégorie des marqueurs irréversibles, mais sa caractéristique bivalente permet de déterminer les contraintes spatiales entre deux sites réticulés, ce qui offre des informations topologiques uniques 4,5. Toutes ces approches peuvent être combinées pour former une « boîte à outils », faisant de la SEP un outil précieux pour élucider les HOS protéiques.

Nous avons organisé cette collection de méthodes pour présenter les avancées récentes dans le domaine de l’analyse des HOS de protéines basée sur la MS. La première série d’articles présente des approches basées sur HDX. Habibi et Thibodeaux6 décrivent une approche HDX-MS continue et ascendante relativement classique. Avec un échange hydrogène-deutérium (H/D) en solution à plusieurs moments d’échange suivi d’une digestion de la pepsine sur colonne, le niveau d’absorption de deutérium peut être déterminé au niveau peptidique. Lors de la réalisation d’expériences différentielles (c’est-à-dire les états liés ou non liés), les peptides qui montrent une augmentation ou une diminution des niveaux d’absorption de deutérium représentent des zones qui subissent des changements dans HOS. Les auteurs utilisent des synthétases lanthipeptides pour illustrer le flux de travail HDX-MS.

Outre l’approche ascendante, HDX-MS peut également être réalisée de haut en bas, ce qui permet aux analystes d’appliquer différentes stratégies de séparation au niveau des protéines intactes. Chaihu et al.7 utilisent l’électrophorèse capillaire pour séparer différents états protéiques ou protéoformes qui coexistent dans la solution. Les protéines subissent l’échange H/D pendant l’électrophorèse tout en migrant dans le capillaire dans la solution d’électrolyte de fond deutéré, et ceci est suivi d’une analyse MS descendante et de fragmentations en phase gazeuse pour évaluer les niveaux d’absorption de deutérium à la fois au niveau global et au niveau des fragments. Enfin, il existe également deux autres méthodes dans cette collection qui mettent en évidence différentes méthodes d’échange H/D, à savoir l’échange contre la puissance lyophilisée8 et l’échange après ionisation par électronébulisation9.

Le deuxième groupe d’articles porte sur la méthode d’étiquetage irréversible. Parmi eux, l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) utilise des radicaux comme espèces de marquage pour marquer la surface de la protéine 10,11. En pratique, le peroxyde d’hydrogène est photoactivé par un laser pour produire des radicaux hydroxyles, qui servent d’espèces de marquage actives. Misra et Sharp12 présentent une stratégie de dosimétrie radicalaire dans laquelle l’adénine est utilisée comme rapporteur de la concentration radicalaire et un système de dosimétrie radicalaire en ligne est utilisé pour surveiller la réponse de l’adénine. Cela permet de compenser en temps réel les concentrations de radicaux hydroxyles et, par conséquent, de normaliser les conditions de réaction pour fournir une lecture précise. Par la suite, Weinberger et Chea ont collaboré avec le groupe Sharp pour développer une plate-forme FPOP sans laser13. En remplaçant le laser dangereux par une source lumineuse plasma et en combinant cela avec la dosimétrie radicalaire en ligne et un système automatisé de collecte d’échantillons, ils développent et fournissent une solution intégrée aux chercheurs qui doivent caractériser les protéines HOS.

Les trois articles du groupe14, 15 et 16 de Jones explorent la possibilité d’intégrer la FPOP et l’empreinte protéique aux études in vivo. L’avantage de cette approche est sans précédent, car elle permet d’analyser la protéine HOS dans l’environnement natif. L’application réussie de l’empreinte dans les cellules14 et dans Caenorhabditis elegans15 ouvre de nouvelles possibilités pour le suivi de la HOS de l’ensemble du protéome dans son état natif, permettant ainsi une compréhension approfondie de la protéine HOS qui ne peut être obtenue par d’autres outils.

Une autre méthode importante de marquage irréversible utilise des réactifs chimiques qui ciblent des résidus d’acides aminés spécifiques3. Kirsch et al.17 rapportent un flux de travail bien utilisé de l’empreinte protéique par marquage covalent. En utilisant le diéthylpyrocarbonate comme réactif de marquage, les auteurs sondent les changements dans la protéine HOS en marquant quelques types de résidus d’acides aminés à la surface de la protéine. Grâce à des expériences différentielles suivies d’une digestion protéolytique et d’une analyse MS ascendante, le flux de travail permet d’identifier les changements d’accessibilité des solvants, qui sont directement liés aux changements de HOS.

Enfin, la réticulation chimique est une autre approche importante qui utilise des réactifs chimiques bivalents pour marquer les protéines 4,5. Les réticulants chimiques sont utilisés pour réticuler deux protéines qui sont spatialement proches l’une de l’autre et, souvent, forment un complexe structurel. Haupt et al.18 rapportent un protocole dans lequel ils démontrent l’utilisation de réticulants chimiques pour comprendre l’architecture des complexes protéiques. Le complexe protéique réticulé peut être analysé à deux niveaux différents. Grâce à la digestion protéolytique suivie de l’identification de la MS, les dipeptides réticulés révèlent les sites d’interaction du complexe protéique. Lors de l’analyse de l’échantillon réticulé à travers la masse intacte, les informations stœchiométriques sur les sous-unités protéiques du complexe sont facilement disponibles.

En résumé, nous avons assisté à un développement substantiel des outils basés sur la MS pour l’analyse des HOS des protéines au cours des trois dernières décennies. L’empreinte irréversible et réversible associée à l’analyse MS se complètent et, ensemble, elles contribuent de manière significative à la caractérisation des HOS des protéines. Les travaux inclus dans cette collection de méthodes représentent des méthodes de pointe dans le domaine de l’analyse des HOS de protéines basées sur la MS ; ces études constituent une ressource précieuse pour les chercheurs qui tentent d’utiliser des approches fondées sur la SP pour répondre à des questions cruciales. D’un point de vue plus large, l’intégration des données d’empreinte dans les prédictions structurelles est essentielle pour dépasser la limite de la résolution spatiale dans les méthodes basées sur la MS. Il existe des travaux pionniers qui démontrent la faisabilité d’une telle approche19,20. De plus, l’intégration de la plate-forme est également cruciale, car ces approches sont complémentaires les unes des autres et fournissent des informations sous différents angles21,22. Les méthodes rapportées dans ce recueil démontrent la puissance d’une telle intégration, et il y aura un développement continu dans cette direction. Grâce à toutes ces avancées, l’approche basée sur la SEP s’est développée au-delà de la détermination de la masse moléculaire, et une croissance continue sera observée dans ce domaine au cours des prochaines décennies.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

Références

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

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