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Historiquement, les scientifiques se sont fortement appuyés sur des études animales pour déterminer si un produit médical (c’est-à-dire un médicament ou un dispositif médical) est sûr avant de le tester sur des humains. Bien que l’expérimentation animale soit encore justifiée dans de nombreuses situations, il est hautement souhaitable de trouver des alternatives. Avec les progrès récents de la science et de l’ingénierie, le développement d’alternatives à l’expérimentation animale est plus réalisable que jamais. Le regain d’intérêt pour le développement de méthodes alternatives humaines in vitro pour l’évaluation de la sécurité cardiaque est au moins en partie attribuable aux progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Les cellules cardiaques humaines peuvent être générées en laboratoire à l’aide d’un simple échantillon de sang ou de peau d’un patient, ce qui permet d’obtenir des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC-CM) adaptés à des tests robustes à haut débit. Les progrès de la bio-ingénierie tissulaire 3D, des technologies de réseaux de microélectrodes, de l’imagerie de cellules vivantes et d’autres technologies ont également joué un rôle déterminant dans le développement des protocoles inclus dans cette collection.
Le protocole de Gerges et al.1 applique une méthode optique non invasive (MyoBLAZER) pour évaluer les modifications de la contractilité dans les cardiomyocytes ventriculaires primaires humains adultes. Les cellules sont rythmées électriquement et l’analyse d’images mesure le raccourcissement du sarcomère sur plusieurs cellules en parallèle. Cette méthode permet de collecter des courbes concentration-réponse toutes les 30 minutes par composé et par dispositif, et fournit des données sur la relation structure-activité. Cette méthode optique non invasive permet de préserver la physiologie et la pharmacologie des cardiomyocytes humains adultes lors du dépistage à haut débit. De plus, l’utilisation de cardiomyocytes humains adultes peut fournir un élément translationnel essentiel à la prédiction de la contractilité.
La méthodologie de Lickiss et al.2 présente une technologie hybride de contractilité et d’impédance/potentiel de champ extracellulaire (EFP), ajoutant des caractéristiques significatives de pro-maturation à une plate-forme standard de 96 puits en utilisant un substrat de culture cellulaire souple et flexible à base de silicium. L’approche s’est avérée fructueuse en rétablissant la réponse inotrope positive physiologique à l’isoprotérénol dans les hiPSC-CM sains disponibles dans le commerce, qui est sciemment absente dans la culture standard (substrat rigide) sans avoir besoin d’un système 3D. Le système hybride permet de mesurer directement la force de contraction (mN/mm2), la vitesse de battement, ainsi que la densité et l’intégrité de la monocouche cellulaire. Il relève également les défis d’un système 3D traditionnel (c’est-à-dire un faible débit, des besoins de formation considérables), réduisant le temps et les coûts nécessaires à la réalisation du test.
La collection comprend également les travaux de Feaster et al.3, qui font la démonstration d’une méthode in vitro, à haut débit et non invasive pour évaluer la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque (CCM) dans des cardiomyocytes de cellules souches humaines en 2D plaqués sur un matelas Matrigel flexible, à l’aide de la microscopie vidéo sans sonde. Les auteurs mettent en évidence les effets aigus de la CCM sur les propriétés contractiles des hiPSC-CM sains et malades. Cet outil offre une méthode peu coûteuse pour comprendre l’innocuité ou l’efficacité des CCM, et pourrait réduire la dépendance aux études animales et aider à la prise de décision réglementaire des dispositifs médicaux d’électrophysiologie cardiaque.
Le protocole affiné de Schaefer et al.4 décrit une nouvelle extension du système standard de réseau de microélectrodes (MEA) qui enregistre normalement le potentiel de champ extracellulaire dans les hiPSC-CM, permettant des enregistrements de potentiel d’action intracellulaire en ouvrant les membranes cellulaires avec des impulsions de faisceau laser nanosecondes. Ce dispositif comprend non seulement les avantages standard de la MEA (c’est-à-dire la surveillance de la propagation du signal, les expériences aiguës et chroniques), mais permet également d’obtenir un aperçu de la forme du potentiel d’action intracellulaire sans utiliser de fortes impulsions de champ électrique pour l’électroporation des cellules.
Le protocole de Berry et al.5 décrit une nouvelle plate-forme qui permet la fabrication reproductible de tissus musculaires modifiés en 3D (EMT) pour des mesures directes de la force de contractilité. L’instrument peut détecter les changements de force de contractilité du micronewton, ce qui en fait un outil puissant pour le criblage de composés dépendant de la dose. La contractilité dans les tissus cardiaques à base d’hiPSC, ainsi que dans les tissus musculaires squelettiques, peut être enregistrée dans jusqu’à 24 tissus simultanément, et les données peuvent être analysées longitudinalement pendant des semaines ou des mois. Par conséquent, les chercheurs n’ont besoin que d’un minimum de compétences ou de formation supplémentaires.
Enfin, la publication de Zhao et al.6 décrit une gamme de tests fonctionnels (potentiel de champ extracellulaire, potentiel d’action, contractilité et calcium) optimisés pour une utilisation avec des cardiomyocytes qui peuvent être générés en interne par les laboratoires utilisateurs. Cela peut être fait à l’aide de protocoles de différenciation précédemment publiés et d’iPSC disponibles auprès de la biobanque de l’Institut cardiovasculaire de l’Université de Stanford (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), fournissant une large gamme de cellules « malades » et de cellules témoins. Il s’agit d’un ensemble complet de méthodes pour les principaux enregistrements de contractilité cardiaque et d’électrophysiologie, y compris des approches standard (patch clamp, réseaux de microélectrodes, sondes de fluorescence sensibles au calcium et mesures de contractilité basées sur vidéo).
En conclusion, si la collection actuelle de méthodes n’a pas la prétention d’être complète (et ne cesse de s’enrichir), il s’agit déjà d’un ensemble relativement complet de méthodes illustrant de nombreux défis actuels en matière de contractilité et d’enregistrements électrophysiologiques dans les cardiomyocytes humains. Il comprend des protocoles pour les cardiomyocytes humains primaires1, les hiPSC-CM disponibles dans le commerce dérivés de donneurs sains 2,3,4, ainsi que des protocoles optimisés pour les cellules portant une signature de cardiopathie congénitale 3,6. Ces méthodes couvrent diverses conditions de culture cellulaire, des cellules uniques pour les expériences de patch clamp6, aux monocouches conventionnelles hiPSC-CM 2D sur des substrats rigides 1,4, aux monocouches de cardiomyocytes 2D sur des substrats souples et flexibles 2,3, et enfin, aux tissus cardiaques modifiés en 3D5. Les méthodes incluses utilisent différentes approches pour l’enregistrement des paramètres physiologiques cardiaques les plus pertinents, tels que la contractilité (mesurée soit indirectement avec des tests vidéo 1,3,6, soit directement avec une force contractile 2,5), le potentiel d’action (dans une cellule unique à l’aide du patchclamp 6, un substitut des potentiels de champ extracellulaire avec un MEA 4,6, ou en utilisant une nouvelle approche pour porer les cellules afin d’enregistrer des enregistrements de potentiel d’action similaires à ceux du système MEAstandard 4), et des transitoires calciques (à l’aide de sondes sensibles au calcium6). Prises ensemble, ces méthodes fournissent non seulement des protocoles détaillés qui peuvent être reproduits dans d’autres laboratoires, mais illustrent également certains des défis posés par les méthodes cardiaques humaines in vitro, tels que : l’immaturité hiPSC-CM, en particulier lors de l’utilisation d’une culture 2D standard sur un substrat rigide ; effets indésirables des sondes fluorescentes sensibles au voltage ou au calcium ; faible débit des enregistrements de potentiel d’action conventionnels ; difficultés d’interprétation des enregistrements de durée de potentiel de trame standard ; et l’absence de tests pour l’évaluation des instruments médicaux (p. ex., par rapport aux médicaments). Il est inspirant de voir combien de laboratoires travaillent à l’amélioration de ces méthodes, ce qui conduira inévitablement à une large adaptation de ces méthodes à l’avenir.