Implantation d’un réseau d’électrocorticographie molle sous-durale (ECoG) et enregistrement cortical à long terme chez les miniporcs

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour l’évaluation à long terme de la performance et de la sécurité des réseaux d’électrodes sous-durales souples dans un modèle mini-porc, décrivant la méthode et les outils chirurgicaux, l’imagerie par résonance magnétique postopératoire, l’électrophysiologie du cortex auditif, les propriétés électrochimiques de l’implant et l’immunochimie post-mortem.

Résumé

Les déficiences et les maladies neurologiques peuvent être diagnostiquées ou traitées à l’aide de puces d’électrocorticographie (ECoG). Dans l’épilepsie résistante aux médicaments, ceux-ci aident à délimiter la région épileptique à réséquer. Dans des applications à long terme telles que les interfaces cerveau-ordinateur, ces électrodes épicorticales sont utilisées pour enregistrer l’intention de mouvement du cerveau, pour contrôler les membres robotiques des patients paralysés. Cependant, les grilles d’électrodes rigides actuelles ne répondent pas au besoin d’enregistrements cérébraux à haute résolution et de biointégration à long terme. Récemment, des réseaux d’électrodes conformables ont été proposés pour obtenir une stabilité à long terme de l’implant avec des performances élevées. Cependant, des études précliniques pour ces nouvelles technologies d’implants sont nécessaires pour valider leur fonctionnalité à long terme et leur profil d’innocuité pour leur application aux patients humains. Dans ce contexte, les modèles porcins sont couramment utilisés dans le développement de dispositifs médicaux en raison de la grande taille de leurs organes et de la facilité de manipulation des animaux. Cependant, seules quelques applications cérébrales sont décrites dans la littérature, principalement en raison des limitations chirurgicales et de l’intégration du système d’implant sur un animal vivant.

Nous présentons ici la méthode d’implantation à long terme (6 mois) et l’évaluation des puces ECoG souples dans le modèle minipig. L’étude présente d’abord le système d’implants, composé d’un réseau d’électrodes microfabriquées souples intégré à un port transdermique polymère compatible avec l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui abrite des connecteurs d’instrumentation pour les enregistrements d’électrophysiologie. Ensuite, l’étude décrit l’intervention chirurgicale, de l’implantation sous-durale à la récupération de l’animal. Nous nous concentrons sur le cortex auditif comme exemple de zone cible où les potentiels évoqués sont induits par la stimulation acoustique. Nous décrivons enfin une séquence d’acquisition de données qui comprend l’IRM de l’ensemble du cerveau, la caractérisation électrochimique de l’implant, l’électrophysiologie peropératoire et en mouvement libre, et la coloration immunohistochimique des cerveaux extraits.

Ce modèle peut être utilisé pour étudier l’innocuité et la fonction d’une nouvelle conception de prothèses corticales ; Étude préclinique obligatoire pour envisager une transposition chez l’homme.

Introduction

Les déficiences et les maladies neurologiques peuvent être diagnostiquées ou traitées à l’aide de puces d’électrocorticographie (ECoG). Ces grilles d’électrodes sont implantées à la surface du cerveau et permettent d’enregistrer ou de stimuler le cortex humain¹. Dans le cas de l’épilepsie résistante aux médicaments, par exemple, ils aident à délimiter la région épileptique pour réséquer². Dans des applications à long terme telles que les interfaces cerveau-ordinateur, ces électrodes épicorticales sont utilisées pour enregistrer l’intention de mouvement du cerveau, pour contrôler les membres robotiques des patients paralysés³. Cependant, les grilles d’électrodes actuelles sont fabriquées à partir de blocs métalliques rigides intégrés dans des substrats polymères rigides et ne répondent pas au besoin d’enregistrements cérébraux à haute résolution et de biointégration sous-durale à long terme (>30 jours). Au lieu de cela, ils créent des réactions tissulaires locales qui conduisent à l’encapsulation fibreuse du dispositif implanté, entraînant une moins bonne performance au fil du temps. Récemment, des réseaux d’électrodes flexibles ou extensibles utilisant des substrats polymères minces fabriqués par des techniques de microfabrication ont été proposés pour obtenir des performances élevées dans les implantations à long terme en limitant la réaction tissulaire ^4,5. Cependant, des études précliniques pour ces nouvelles technologies d’implants sont nécessaires pour valider leur fonctionnalité et leur profil d’innocuité à long terme, afin d’envisager une application aux patients humains. Dans ce contexte, les modèles de mini-porc et de porc sont couramment utilisés dans le développement de dispositifs dans d’autres contextes médicaux (par exemple, les systèmes cardiovasculaire, squelettique ou gastrique) en raison de la grande taille de leurs organes et de la facilité avec laquelle ils manipulent les animaux ^6,7,8. Cependant, seules quelques applications ciblant le cerveau pour la neurophysiologie sont décrites dans la littérature, principalement en raison des limites de l’approche chirurgicale et de l’intégration du système d’implant sur un animal vivant 9,10,11,12. Ceux-ci ne sont souvent pas compatibles avec l’implantation chronique chez des animaux vivants, car ils nécessiteraient, par exemple, le développement de matériel complexe tel que l’électronique embarquée implantable. De plus, ils n’étudient pas l’influence du système d’implant sur le tissu cible, ce qui est crucial pour l’aspect biosécurité dans les études translationnelles. Le modèle porcin est proche de l’anatomie humaine en termes de structure corticale, d’os du crâne et d’épaisseur de peau¹³. De plus, leur capacité à apprendre des tâches comportementales en fait un modèle puissant pour étudier les stratégies de rééducation fonctionnelle ou les perceptions sensorielles¹⁴.

L’application de nouvelles technologies et thérapies à l’homme nécessite une évaluation de l’innocuité et de l’efficacité, comme l’exigent les autorités médicales compétentes. Ceux-ci sont généralement décrits dans les documents techniques et les normes¹⁵, mais ils ne nécessitent que la réussite de ces tests et n’étudient pas l’effet réel de l’implantation du dispositif ou la collecte d’autres données utiles parallèlement à l’étude de sécurité. Pour une étude complète de biosécurité et de performance sur le cerveau, nous présentons ici une collection longitudinale et systématique de données d’imagerie cérébrale, de mesures électrophysiologiques, d’évaluation des propriétés électrochimiques des électrodes implantées et d’histologie post-mortem dans un modèle porcin. Pour y parvenir, plusieurs aspects doivent être pris en compte, afin de créer un modèle expérimental complet : (i) un accès chirurgical mini-invasif pour l’implantation du dispositif ainsi qu’un orifice transdermique mécaniquement stable pour se connecter aux électrodes, (ii) un paradigme d’enregistrement électrophysiologique robuste qui sert de sortie de performance pour les électrodes implantées à la fois sous anesthésie et dans des conditions de mouvement libre, (iii) l’imagerie in vivo (tomodensitométrie [TDM] et/ou imagerie par résonance magnétique [IRM]) à différents moments pour suivre l’évolution du cerveau et de l’implant, ainsi que la compatibilité du système implanté avec l’équipement d’imagerie, et (iv) un pipeline de préparation tissulaire pour extraire le cerveau pour analyse histologique.

Ici, nous rendons compte de la méthode d’implantation à long terme (6 mois) et de l’évaluation des puces ECoG souples dans le modèle mini-porc (représenté schématiquement sur la figure 1). Les réseaux d’électrodes souples ont été présentés dans nos rapports précédents et sont fabriqués à partir de fines membranes de silicone intégrant des couches minces d’or élastiques utilisées comme pistes électriques^16,17. Le contact avec le tissu se fait par un mélange de nanoparticules de platine noyées dans une matrice de silicone pour une interface électrochimique douce et efficace avec le tissu cérébral¹⁸. Les implants sont reliés par un câble flexible creusé sous un tunnel sous-jacent à travers le crâne et la peau jusqu’à un port transdermique qui abrite les connecteurs sur la tête de l’animal. La taille et la forme de l’implant peuvent être personnalisées en fonction de la cible et des besoins de l’étude. Les bandelettes d’électrodes actuelles de cette étude reflètent la taille réelle des bandelettes cliniques. Des bandelettes et des grilles sous-durales cliniquement disponibles ont été utilisées comme comparateurs en utilisant la même approche. L’orifice transdermique polymère compatible avec l’IRM est placé sur le crâne à l’aide d’un système de repose-pieds qui l’ancre fermement au crâne. Ici, nous décrivons en détail l’intervention chirurgicale, de l’implantation sous-durale des deux hémisphères à la récupération de l’animal. Nous nous concentrons sur le cortex auditif comme zone cible d’exemple, où les potentiels évoqués sont induits par une stimulation acoustique à la fois dans des conditions anesthésiées et en mouvement libre. À différents moments, le cerveau de l’animal est imagé en IRM (ou TDM pour les électrodes cliniques) sous anesthésie et les propriétés électrochimiques des électrodes sont mesurées. Des méthodes de caractérisation des électrodes sont utilisées pour suivre l’évolution de l’implant et de l’interface électrode-tissu (voir Schiavone et ^al.19 pour plus de détails). Il s’agit notamment de la chronoampérométrie pour sonder les capacités de stimulation du contact de l’électrode, de la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) qui peut indiquer l’évolution des composants résistifs et capacitifs de l’électrode, et des mesures de résistance intercanal pour sonder les défaillances d’encapsulation hermétique. Enfin, nous avons développé un pipeline d’extraction tissulaire permettant de perfuser le cerveau après l’euthanasie, de l’explanter avec les électrodes en place, de le sectionner et d’effectuer une analyse histologique à l’aide de différents marqueurs d’inflammation. Dans l’ensemble, cette méthode permettra des études précliniques avec une collecte de données multimodale robuste pour l’application clinique future de nouvelles technologies et thérapies sur le cerveau.

Protocole

Les procédures chirurgicales et comportementales ont été approuvées par le comité d’éthique local conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par les autorités vétérinaires locales (canton de Genève) et fédérales (suisses) avec le numéro d’autorisation GE11120A. Des miniporcs femelles de Göttingen (n = 7) âgés de 2 à 6 mois (5 à 8 kg) ont été utilisés dans cette étude.

1. Planification préopératoire

1. Caractérisation in vitro du système d’implants souples
   1. Chronoampérométrie : Enregistrez la chute de tension lors de l’injection d’une évolution d’impulsion de courant biphasique (c’est-à-dire le transitoire de tension [VT]) à l’aide d’un oscilloscope connecté en parallèle à un générateur d’impulsions. Connectez le générateur d’impulsions de manière séquentielle à chaque électrode et à un compteur de platine en solution saline (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] 1x). Reportez-vous à l’étape 3.1 pour les paramètres.
   2. Spectrogramme d’impédance électrochimique : Mesurez l’impédance électrochimique à différentes fréquences à l’aide d’un potentiomètre. Connectez le potentiomètre séquentiellement à chaque électrode à l’aide du compteur de platine et d’une électrode de référence Ag/AgCl en solution saline (PBS 1x). Reportez-vous à l’étape 3.2 pour les paramètres.
   3. Résistance intercanal : à l’état sec, mesurez la résistance au courant continu (CC) entre les canaux adjacents à l’aide d’un multimètre portatif.
   4. Sélection de l’implant : Après les trois mesures citées ci-dessus, sélectionnez l’implant avec les critères suivants : impédance à 1 kHz en dessous de 100 kΩ et pas de résistance intercanal en dessous de 1 MΩ.
2. Stérilisation
   1. Stérilisation des implants : Placez les implants sélectionnés individuellement dans des sacs de stérilisation avec un marqueur de stérilisation et scellez-les. Utilisez un double emballage pour assurer la stérilité pendant la chirurgie.
      REMARQUE : Dans ce cas, la stérilisation au peroxyde d’hydrogène (H 2 O₂) est utilisée en raison du cycle court et de la basse température (55 °C). Les alternatives sont la stérilisation à l’oxyde d’éthylène gazeux (ETO) ou à l’autoclave, mais la compatibilité avec le système d’implant doit être assurée.
   2. Stérilisation des instruments : Placez les instruments nettoyés dans des sacs de stérilisation doubles ou des boîtes à instruments stériles avec des marqueurs de stérilisation. La stérilisation en autoclave est la plus courante pour les instruments, mais H 2 O₂ou ETO sont des alternatives possibles.

2. Implantation chirurgicale de puces ECoG souples

1. Anesthésie
   1. Prémédication : Isolez l’animal et faites-le jeûner toute la nuit. Injecter un mélange de midazolam à 0,75 mg/kg, d’atropine à 0,25 μg/kg et d’haldol à 0,1 mg/kg par voie intradermique, et attendre que l’animal soit sous sédatif. Pesez l’animal avant de continuer.
   2. Mise en place d’une sonde intraveineuse (IV) :
      1. Placez l’animal sur la table d’opération sur un coussin chauffant. Induire l’anesthésie en plaçant un masque facial sur l’animal, en utilisant du sévoflurane à 3 % à 3,5 %.
      2. Placez des sondes d’électrocardiogramme sur l’abdomen, un capteur de saturation sanguine sur la queue et un capteur de température dans la narine.
      3. Placez une sonde intraveineuse sur une veine de l’oreille et confirmez l’accès au sang à l’aide d’une seringue remplie de solution saline. Assurez-vous que les yeux sont maintenus hydratés en utilisant une pommade.
   3. Intubation : Injecter un bolus d’atracurium à 0,5 mg/kg, de kétamine à 1 mg/kg et de fentanyl à 1-2 μg/kg. Placez l’animal sur le dos pour l’intubation. Insérez un tube de 4,5 mm.
   4. Médicaments : Après l’intubation, arrêter l’anesthésie au sévoflurane et installer une perfusion de propofol à 10 mg/kg/h, de fentanyl à 2 μg/kg/h, d’atracurium à 0,2-0,5 mg/kg/h et de solution saline à 4-7 mg/kg/h. Commencez une perfusion de mannitol à raison de 1 g/kg/h pour réduire le gonflement du cerveau pendant la chirurgie.
      REMARQUE : Un régime d’analgésie multimodale peut être utilisé si recommandé par le comité local d’éthique animale.
2. Radiographie préopératoire
   1. Placez l’animal sur son abdomen en position de sphinx. Retirez temporairement tout objet métallique à proximité du cerveau et du crâne de l’animal (p. ex., plomb de température dans la narine).
   2. Acquérir une radiographie axiale et sagittale avec un contraste de l’os. Placez un objet métallique de dimensions connues dans le champ d’acquisition sagittale pour servir d’échelle afin de mesurer l’épaisseur du crâne à l’avant et à l’arrière du cerveau.
   3. Identifiez l’emplacement des sinus frontaux (visibles par des vides sous le crâne) et marquez l’emplacement le plus postérieur sur la tête de l’animal à l’aide d’un marqueur permanent. Cela indiquera le point le plus éloigné où une craniotomie ou la pose d’une vis peut être effectuée dans l’approche chirurgicale décrite ci-dessous.
3. Champ aseptique et préparation de la peau : Rasez toute la surface de la tête au-delà du champ chirurgical. À l’aide d’un tampon stérile, frottez soigneusement la tête avec de la bétadine. Ensuite, placez des champs stériles sur la table d’instrumentation et sur l’animal pour ne révéler que la fenêtre chirurgicale. Enfin, frottez à nouveau la tête avec un tampon stérile à base de bétadine.
4. Craniotomie et durotomie
   1. Coupe de la peau : Inciser la peau avec un couteau scalpel le long de la ligne médiane. Séparez le muscle et le périoste (25 mm latéralement du bregma des deux côtés et 40 mm avant et postérieur au bregma) de l’os à l’aide d’une râpe et placez des écarteurs pour obtenir un accès optimal pour un perçage ultérieur.
   2. Mesures et marquage : Identifiez le bregma et le lambda et marquez-les à l’aide d’un stylo chirurgical stérile (Figure 2A, B). À l’aide d’une règle stérile, définissez le contour du lambeau osseux centré autour de la cible d’implantation sur les deux hémisphères. Dans ce cas précis, le cortex auditif a été choisi, avec des coordonnées -5 mm à -15 mm à partir de bregma et -4 mm à -20 mm latéralement. Ensuite, ajustez la craniotomie à la taille de l’implant et aux repères anatomiques, en limitant la taille de l’ouverture.
   3. Craniotomie:
      1. À l’aide d’une perceuse à os munie d’une mèche à coupe ronde, percez le contour de la craniotomie, en tenant compte de l’épaisseur du crâne mesurée à l’étape 2.2. Irriguer l’emplacement de forage avec une solution saline pour éviter la surchauffe de l’os.
      2. Percez soigneusement le contour de manière homogène jusqu’à ce qu’il atteigne la dure-mère. À la première percée, terminez de percer le contour jusqu’à ce qu’il soit suffisamment aminci pour presque percer. Ensuite, utilisez une spatule plate (soit sur le côté de la ligne médiane, soit sur le côté latéral) pour détacher le lambeau osseux en un seul morceau, en utilisant le bord de la craniotomie comme levier. Si vous rencontrez trop de résistance, continuez à amincir l’os.
      3. Placez le morceau d’os dans une solution saline stérile.
      4. Une fois le lambeau osseux retiré, ébréchez soigneusement le bord de la craniotomie, à l’aide d’un Kerison pour éviter que le bord osseux tranchant ne coupe la dure-mère.
      5. Si un saignement excessif est observé sur la dure-mère ou l’os, utilisez de la mousse de gel ou de la cire d’os, respectivement. Placez une compresse humide (tampon standard dans une solution saline stérile) dans la craniotomie et répétez cette étape sur l’autre hémisphère (Figure 2B).
   4. Durotomie :
      1. À l’aide de l’aiguille d’un kit de suture 6-0, percez et soulevez soigneusement la dure-mère à l’extrémité antérieure ou postérieure de la craniotomie à mi-chemin entre le côté médial et latéral et créez le début d’une incision avec le couteau à couteau.
      2. Ensuite, à l’aide d’une petite spatule plate insérée dans l’espace sous-dural agissant comme une base de coupe pour protéger le cortex, créez une fente antéropostérieure dans la dure-mère en avançant simultanément avec les deux outils. Assurez-vous que la fente est légèrement plus grande que la largeur de l’implant (Figure 2C). Si un saignement ou des dommages se produisent à cette étape, couvrez-le de mousse de gel et attendez qu’il s’arrête.
         REMARQUE : La trajectoire de la fente doit être adaptée si de gros vaisseaux sanguins sont présents dans la dure-mère pour éviter les saignements.
5. Implantation
   1. Insertion de l’appareil :
      1. Irriguez l’implant (figure supplémentaire 1A) avec du sérum physiologique des deux côtés afin qu’il glisse plus facilement dans l’espace sous-dural. Placez l’implant au-dessus de la fente de la dure-mère et, à l’aide d’une petite pince, insérez le dispositif sous-duralement en le faisant glisser séquentiellement sur chaque bord.
      2. Tenez soigneusement l’extrémité du piédestal de l’appareil et avancez avec l’implant afin de ne pas créer de tension gênant l’insertion. Lorsque le bord du connecteur est situé au-dessus de la fente, arrêtez l’insertion.
   2. Fixez l’implant : Pour fixer l’implant en place, placez un pont en titane sur le câble après le bord de la craniotomie ou dans les ailes d’ancrage et fixez-le avec une ou deux vis en titane à l’aide du tournevis approprié (Figure 2D).
   3. Mise en place au sol : Retirez délicatement 1 cm de l’isolant des fils de terre et insérez-le par voie péridurale à l’extrémité postérieure de la craniotomie (ou à tout endroit péridural éloigné du cortex d’intérêt ou des gros vaisseaux sanguins) (fil de la figure 2E)
   4. Répétez les étapes 2.4.4. et 2.5.1.-2.5.3 sur l’hémisphère controlatéral.
   5. Radiographie peropératoire pour confirmer la mise en place :
      1. Placez un tampon humide (tampon standard dans une solution saline stérile) sur l’emplacement de la chirurgie pour garder les tissus hydratés. Ensuite, placez un champ chirurgical stérile pour couvrir la tête de l’animal.
      2. Prenez des radiographies planes (axiales et sagittales) pour vous assurer que les implants sont bien placés et ne sont pas pliés, en utilisant les marqueurs radiographiques comme indicateurs. Si ce n’est pas le cas, retirez le champ et explantez l’appareil pour l’insérer à nouveau (suivez à nouveau les étapes 2.4.4 et 2.5.1.-2.5.3).
   6. Fermeture de la dure-mère : Suturez soigneusement la dure-mère autour du câble de l’implant à l’aide d’une suture résorbable 3-0 et d’un petit porte-aiguille. Rapprochez les deux bords de la dure-mère autant que possible sans déchirer la fine membrane avec le fil de suture (Figure 2D, E).
   7. Mise en place du lambeau osseux : Fixez un pont en titane sur la partie antérieure et postérieure de chaque lambeau osseux à l’aide d’une vis en titane. Attention à bien planifier le positionnement des Ti-bridges par rapport au placement des pieds de repose-pieds dans les étapes suivantes. Vissez l’extrémité des bridges en titane sur le crâne (Figure 2F, G).
6. Placement du piédestal et du repose-pieds
   1. Positionnement : Dans cette configuration, le repose-pieds comporte six pieds avec deux trous de vis chacun (figure supplémentaire 1B). Prévoyez le placement du repose-pieds sur le crâne pour optimiser l’emplacement des vis (évitez de les placer en bordure de la craniotomie ou dans le muscle temporal). Sautez les trous dans les pieds s’ils ne peuvent pas être vissés.
   2. Fixation de la plaque de pied : Vissez les vis en titane de la plaque de base jusqu’à ce qu’elle soit fermement en place (voir Figure 2H).
   3. Placement du piédestal : Retirez les ponts en titane sur les câbles de connexion et retournez le piédestal pour atterrir sur le repose-pieds. Vissez le piédestal sur le repose-pieds. Vérifiez que le piédestal est bien en place (Figure 2I).
7. Suture et fermeture
   1. Nettoyage de la plaie : Nettoyez l’espace sous-cutané de tout os ou autre débris en rinçant avec une solution saline. Découpez un peu de peau autour des bords du piédestal pour créer un bord arrondi suivant le cylindre.
   2. Sutures sous-cutanées : Retirez les écarteurs et repliez les lambeaux de peau ensemble. Créez des sutures sous-cutanées avec un fil de suture non résorbable 4-0, espacé de 3 mm à l’aide de sutures interrompues simples ou de sutures continues simples. Commencez par vous éloigner du piédestal, en vous déplaçant vers lui des deux côtés de l’incision.
   3. Sutures dermiques : Suturez la peau à l’aide d’un fil de suture non résorbable 6-0, avec des sutures espacées de 5 mm. Commencez par vous éloigner du piédestal, en vous déplaçant vers lui des deux côtés de l’incision. Veillez à obtenir une bonne apposition tissulaire entre les deux lambeaux de peau et près du bord du piédestal pour éviter un vide (Figure 2J).
   4. Pansement : Nettoyez à nouveau la zone de la plaie avec un tampon stérile et de la bétadine. Appliquez un pansement stérile auto-adhésif sur la plaie.
8. Mesures in vivo : Pour les mesures in vivo, suivez les sections 3, 4 et 5.
9. Réveil : Une fois que toutes les mesures ont été effectuées, retirez l’animal de tous les anesthésiques mais gardez-le sous ventilation. Pour l’analgésie, appliquer un patch de buprénorphine (25 mg/h) pendant 24 h. Placez l’animal sur un coussin chauffant recouvert de rideaux pour accélérer le réveil. Lorsque la respiration spontanée est rétablie, extubez l’animal et mettez-le sous un masque à oxygène jusqu’à ce qu’il reprenne conscience (ce qui peut prendre de 1 à 4 h).
10. Soins postopératoires de l’animal : Pendant 5 jours, gardez l’animal sous étroite surveillance. Donnez une dose de céphalexine à 75 mg deux fois par jour avec de la nourriture, séparée des autres animaux. Effectuez une désinfection quotidienne de la plaie en appliquant de grandes quantités de bétadine avec des tampons stériles imbibés (il est préférable de le faire pendant la tétée).
    REMARQUE : Soins de longue durée et hébergement : L’animal opéré est maintenu isolé pendant 24 h. Il est remis dans son groupe social d’origine si l’animal est assez bien pour interagir socialement avec ses congénères. L’observation quotidienne du piédestal et de l’ouverture de la peau doit être effectuée pour suivre l’intégration de l’appareil sur la tête. Le cas échéant, nettoyez l’emplacement autour du piédestal avec de grandes quantités de bétadine.

3. Caractérisation in vivo de l’implant souple

1. Chronoampérométrie : Enregistrez la chute de tension lors de l’injection d’une évolution d’impulsion de courant biphasique (c’est-à-dire le VT) à l’aide d’un oscilloscope connecté en parallèle à un générateur d’impulsions. Connectez le générateur d’impulsions séquentiellement à chaque électrode et au fil de terre. Effectuez l’impulsion de stimulation à 100 μA avec une largeur d’impulsion de 300 μs à 100 Hz.
2. Spectroscopie d’impédance électrochimique : Mesurez l’impédance électrochimique à différentes fréquences à l’aide d’un potentiomètre. Connectez le générateur d’impulsions séquentiellement à chaque électrode, en utilisant le fil de terre comme contre-électrode et comme terre. Réglez la tension d’excitation à 200 mV et la plage de fréquences de 1 Hz à 1 MHz, avec trois points par décade.
3. Mesures de court-circuit entre canaux : mesurez la résistance CC entre les canaux adjacents à l’aide d’un multimètre portatif. In vivo, la résistance CC intercanal n’est mesurée que pour vérifier qu’aucun déficit inférieur à 1 kΩ n’apparaît, indiquant une défaillance totale de l’encapsulation.

4. Enregistrement électrophysiologique

1. Activité spontanée : Branchez le système d’enregistrement sans fil à travers le piédestal et enregistrez l’activité de base pendant 2 à 3 minutes. Ces enregistrements serviront de contrôle pour analyser les potentiels évoqués auditifs.
2. Potentiels évoqués auditifs : En plus du système sans fil, insérez des haut-parleurs dans un champ fermé dans les oreilles des animaux. Stimulation acoustique en rafale à différentes fréquences (allant de 200 à 20 000 Hz) à un niveau de pression acoustique (SPL) d’environ 70 dB sur 120 répétitions. Ensuite, faites la moyenne des enregistrements et alignez-les sur la période de stimulus pour l’analyse.
3. Potentiels évoqués sensoriels : Placez les aiguilles dans le museau à trois positions différentes. Evoquer les potentiels sensoriels en stimulant le museau pendant ~30 s avec le générateur d’impulsions à différentes amplitudes pour obtenir les courbes de recrutement.

5. Imagerie in vivo

1. Transport de l’animal : Garder l’animal sous anesthésie au propofol, comme décrit à l’étape 2.1. Utilisez un chariot de transport qui abrite un ventilateur, un pousse-seringue et un moniteur de signes vitaux pour transporter l’animal de la salle d’opération aux installations d’imagerie et vice-versa.
2. Tomodensitométrie : Placez l’animal sur la table du scanner et retirez tout objet métallique autour de la tête (p. ex., le capteur de température). Acquisition d’une tomodensitométrie à la plus petite résolution (0,4 mm d’épaisseur de tranche) à l’aide de l’acquisition isométrique avec sélection automatique du courant et de la tension pour le contraste osseux.
3. Imagerie par résonance magnétique : Retirez tout l’équipement contenant du métal de l’animal (utilisez des sondes intraveineuses compatibles avec l’IRM et un tube d’intubation). Maintenir l’animal ventilé et anesthésié sous sévoflurane à 3 % à 3,5 %, à l’aide d’un ventilateur situé à l’extérieur de la chambre d’IRM et relié à l’animal par un long tube. Avant la première séquence, injecter un bolus de fentanyl à raison de 1 à 2 μg/kg. Utilisez trois séquences isométriques à la plus petite résolution : séquences pondérées en T1, T2 et en écho de spin turbo (TSE) (paramètres indiqués dans le fichier supplémentaire 1).

6. Enregistrement en mouvement libre

1. Suivez la même procédure que celle décrite à la rubrique 4 pour l’enregistrement des signaux d’éveil du cerveau. Branchez la tête sans fil en tenant l’animal dans les bras de l’expérimentateur ou en le nourrissant avec des friandises pour le distraire. Fournir la stimulation acoustique à l’aide de haut-parleurs externes placés à proximité de l’animal.

7. Perfusion et préparation des tissus

1. FACULTATIF : Si l’animal n’est pas déjà sous anesthésie, suivez l’étape 2.1 pour le protocole d’anesthésie.
2. Insertion d’un cathéter dans l’artère carotide pour la perfusion (Figure supplémentaire 2)
   1. Dissection de l’artère carotide et de la veine jugulaire : Coupez la gorge au niveau de la ligne médiane à l’aide d’un cautériseur/coupe-bordure. Coupez d’abord la peau, puis le muscle en suivant la ligne blanche du milieu (pas de vaisseaux en dessous) (figure supplémentaire 2A).
   2. Ouvrez davantage, en utilisant les doigts pour faire de l’espace autour de la trachée et sous le muscle. Recherchez l’artère carotide (battante et rosâtre) ; Le nerf vagal est parfois aussi autour (blanc), et la veine jugulaire peut être en dessous ou sur le côté (rouge). Placez les épandeurs (voir la figure supplémentaire 2B).
   3. Commencez la dissection de l’artère carotide à l’aide d’une pince fine et de ciseaux ronds. Utilisez des ciseaux pour ouvrir le tissu conjonctif. S’il n’y a pas de vaisseaux sanguins, coupez ; s’il y a des vaisseaux sanguins, cautériser et aller de l’avant (figures supplémentaires 2C, D). Lorsqu’il est suffisamment disséqué, utilisez une pince pour passer sous l’artère carotide afin qu’elle soit complètement isolée (figure supplémentaire 2E).
   4. Répétez la même opération avec la veine jugulaire (Figure supplémentaire 2F).
   5. Lorsque les deux vaisseaux sont complètement disséqués et isolés, placez du fil de suture autour d’eux. Ne les fermez pas encore. Deux sutures autour de la carotide, l’une à la base (suture 1 côté cœur pour la perfusion cérébrale) et l’autre côté (suture 2), sont représentées à la figure supplémentaire 2G.
   6. Placez une suture autour de la veine jugulaire (suture 3), non fermée ; Marquez les fils avec du ruban adhésif pour sectionner la veine plus tard.
   7. Fermez très fermement la suture 1, sinon elle saignera (Figure supplémentaire 2H). Faites trois nœuds. Placez une pince sur le fil pour mettre du poids et créer une tension dans l’artère carotide.
   8. Clamper l’artère carotide à l’aide d’une pince vasculaire du côté opposé de la dissection de l’artère carotide (côté cerveau pour la perfusion cérébrale ; Figure 2I supplémentaire). La suture 2 est au milieu, pas encore fermée.
   9. Utilisez une pince noire pour attraper et tirer l’artère carotide. À l’aide de ciseaux fins, sectionner la moitié de l’artère carotide près de la base de la dissection (près de la suture 1, côté cœur ; voir la figure supplémentaire 2J). Assurez-vous que la section est aussi propre que possible et qu’elle atteint le navire lui-même, et pas seulement la « gaine » ; sinon, le cathéter ne passera pas. Insérez le cathéter comme indiqué à la figure supplémentaire 2K.
   10. Rincez et remplissez le cathéter, d’abord avec du PBS, afin qu’il n’y ait plus d’air dans le cathéter (encadré supplémentaire de la figure 2K ).
   11. Fermez la suture 2 assez fermement pour qu’elle ne disparaisse pas, mais pas trop pour que le cathéter puisse encore bouger un peu (figure supplémentaire 2L). Ensuite, retirez la pince du vaisseau, terminez l’insertion du cathéter aussi loin que possible et finalisez la fermeture de la suture 2 (fermez fermement).
   12. Si vous le souhaitez, utilisez des fils de suture à la suture 1 pour fixer la base du cathéter à la peau à la sortie de la plaie comme mesure de sécurité supplémentaire. Ensuite, transférez l’animal dans la zone de perfusion et branchez-le sur le PBS/héparine. Lorsque la perfusion commence, prélevez la suture 3 et coupez la veine jugulaire
3. Euthanasie : Administrer du pentobarbital (90 mg/kg) par voie intraveineuse et rincer la ligne avec une solution saline pour s’assurer que la dose complète est administrée avec succès.
4. Perfusion : À l’aide d’une pompe à perfusion (200 ml/min), brancher le cathéter carotidien dans du PBS/héparine (1 L pour un porc de 15 kg), puis dans du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA) (5 L pour un porc de 15 kg). Lorsque la perfusion commence, tirez sur la suture 3 et coupez la veine jugulaire.
5. Prélèvement de tissus
   1. Décapitation : Lorsque la perfusion est terminée, détachez la tête de l’animal du corps à l’aide d’un scalpel, en coupant la peau et les muscles et en insérant la lame entre la première et la deuxième vertèbre.
   2. Postfixation : Plonger la tête dans 4% de PFA dans du PBS pendant encore 48 h à 4 °C, puis transférer dans du PBS avant l’extraction du cerveau.
   3. Extraction du cerveau et de l’implant :
      1. Retirez la peau à l’aide d’un scalpel et commencez à couper soigneusement l’os à l’aide d’un rongeur en commençant par les premières vertèbres, en suivant la moelle épinière jusqu’au cervelet. Une fois le cervelet exposé, retirez soigneusement les os temporaux et exposez les lobes pariétaux et frontaux.
      2. À ce stade, vissez le piédestal du repose-pieds et coupez les pieds du repose-pieds avec une pince. Retirez l’os près de l’entrée du câble dans le crâne pour libérer le système d’implant de l’os, sans retirer les implants de la sortie de la dure-mère.
      3. Si les câbles de l’implant sont enfoncés dans l’os, coupez le câble le plus près possible de la sortie. Une fois que la surface du cerveau est suffisamment exposée, coupez soigneusement la dure-mère en suivant la ligne médiane à l’aide de petits ciseaux.
      4. Libérez les câbles de l’implant de la sortie de la dure-mère. Prenez des photos de la mise en place de l’implant sur le cerveau. Ensuite, utilisez une petite cuillère pour détacher le cerveau des nerfs crâniens en dessous. Extrayez soigneusement le cerveau. Retirez les implants du cerveau.
   4. Postfixation du cerveau : En fonction de la qualité de la perfusion, postfixer à nouveau le cerveau extrait pendant 24 h dans du PFA à 4 % dans du PBS à 4 °C. Conserver dans 0,1 M PBS à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau soit coupé.
   5. Coupe cérébrale : Séparez les deux hémisphères à l’aide d’une lame de rasoir. Ensuite, coupez le cerveau orthogonalement en quatre morceaux différents. Coupez la zone implantée en deux pour obtenir deux blocs contenant la zone implantée et une zone témoin. Rangez les deux autres blocs si vous avez besoin de plus de diapositives de contrôle.
   6. Cryoprotection et congélation du cerveau : Transférer les blocs cérébraux dans une solution contenant d’abord 15 % de saccharose, puis 30 % de saccharose à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau plonge et atteigne l’équilibre. Ensuite, congelez le tissu dans de l’isopentane à -55 °C dans un système de congélation de tissus.

8. Histologie

1. Coupe de tissus
   1. Cryostat : Placez le cerveau congelé dans un cryostat et coupez-le jusqu’à ce que des sections complètes soient atteintes. Ensuite, coupez le cerveau en sections de 40 μm et plongez-les par groupes de trois dans du PBS de 0,1 M dans des plaques de puits. Notez soigneusement l’ordre des plaques.
   2. Sélection des sections : Sélectionnez les sections en fonction de la zone à analyser (région implantée ou zone de contrôle). Retirez les sections séquentiellement des plaques de puits, en utilisant une brosse fine pour les inspecter pour vérifier qu’elles ne sont pas endommagées. Placez-les dans de nouvelles plaques de puits remplies de 0,1 M de PBS pour une coloration supplémentaire.
2. Immunohistochimie
   1. Préparation : Incuber les coupes dans du Triton X/PBS à 0,3 % pendant 15 min, puis dans de l’albumine sérique bovine (BSA)/PBS à 3 % pendant 1 h à température ambiante (RT).
   2. Anticorps primaires : Incuber les tissus avec des anticorps primaires pendant 48 h à la RT (anti-GFAP, rat, dilué à 1/300 ; anti-Iba1, lapin, dilué à 1/400 ; anti-NeuN, cobaye, dilué à 1/1 000 ; le tout dans 1 % BSA/PBS). Recouvrez les plaques du puits de papier d’aluminium.
   3. Lavage : Lavez les puits avec 0,1 M PBS trois fois pendant 5 min.
   4. Anticorps secondaires : Incuber les tissus avec des anticorps secondaires pendant 2 h à RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555 ; tous dilués à 1/400 dans 1 % BSA/PBS).
   5. DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) : Incuber les tissus avec du DAPI pendant 15 min (1/1 000 dans 1 % de BSA/PBS).
   6. Lavage : Lavez les puits avec 0,1 M PBS cinq fois pendant 15 min.
   7. Montage : Montez les diapositives à l’aide d’un support de montage et d’une lamelle. Conservez les lames dans l’obscurité au réfrigérateur à 4 °C.
3. Imagerie
   1. Imagerie de lames entières : Imagez les lames à un grossissement de 10x (valeur de la distance de travail objective = 3 100 μm) à l’aide d’un microscope scanner de lames à trois longueurs d’onde différentes (640 nm, 560 nm, 485 nm). Toutes les informations sur la puissance et le gain se trouvent dans le fichier supplémentaire 2.
   2. Imagerie microscopique : Imagez la région d’intérêt à un grossissement de 20x (apochromat 20x/0,8 M27) à l’aide d’un microscope confocal à quatre longueurs d’onde (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Toutes les informations sur la puissance et le gain se trouvent dans le fichier supplémentaire 3.

Résultats

Afin de confirmer l’emplacement (Figure 3A) et la fonctionnalité des dispositifs, des enregistrements électrophysiologiques sont effectués en peropératoire après la mise en place du piédestal. Le signal de base est d’abord acquis sur 2 min sans stimuli pour contrôler l’activité basale. Deuxièmement, l’animal est stimulé acoustiquement par une rafale de tonalité à différentes fréquences (500-20 000 Hz), et les données brutes sont moyennées sur la période de stimulus pour cartographier les potentiels évoqués auditifs à travers le réseau (par exemple, à 800 Hz par rapport à la ligne de base ; Graphique 3B). Les données présentées ici ne sont pas traitées, mais si trop de bruit est présent, des filtres coupe-bande et passe-bande peuvent être appliqués. Les sources typiques de bruit dans la salle d’opération comprennent les coussins chauffants, les perceuses bouchées et les aspirateurs ou les cautériseurs (entre autres) qui doivent être retirés avant l’acquisition. Dans les enregistrements éveillés, les grands mouvements musculaires autour de la tête, tels que la mastication, doivent être évités pour des ensembles de données plus propres.

Ce protocole a été appliqué à chaque point de temps d’enregistrement, et les signaux d’un seul canal ont pu être comparés au fil du temps. Un exemple est illustré à la figure 3C, qui montre la robustesse et l’évolution de la réponse. La capacité d’enregistrement de chaque contact au cours de l’expérience peut être évaluée en calculant l’écart-type du signal de référence à chaque point temporel (Figure 3D). Dans cette étude, le rapport signal/bruit a diminué et s’est stabilisé entre le jour 0 et le jour 6, malgré une certaine variabilité due à la durée limitée de la période d’enregistrement (c.-à-d. 2 min). Cela peut être corrélé davantage aux impédances d’électrode.

L’imagerie in vivo est réalisée en postopératoire pour évaluer l’état du cerveau et le positionnement de l’implant. Dans la première itération du protocole, aucune radiographie peropératoire n’a été réalisée, ce qui a donné lieu à un dispositif plié, comme le montre la figure 4A sur une séquence d’IRM pondérée en T1 (voir en plus la figure 4B). Aucun changement de comportement n’a été observé chez l’animal, mais au fil du temps, cela a entraîné une encapsulation fibreuse autour du dispositif en raison de la compression macroscopique du cerveau autour de l’emplacement de l’implant (Figure 4C). Après cette expérience, la radiographie peropératoire a été introduite, comme le montre la figure 4D, où les marqueurs radio-opaques (barres noires visibles sur l’implant dans la figure 4D en médaillon) sont bien positionnés. La surface du cerveau est alors intacte, comme on peut l’observer sur l’IRM postopératoire de la figure 4E. Dans l’ensemble, avec ce système d’implants et de piédestals, l’imagerie du cerveau entier est possible. Différentes séquences dans les plans coronaux permettent de voir les structures anatomiques (Figure 4F,G ; séquences d’IRM T1 et T2) ou la présence de liquide et de sang autour de l’implant (Figure 4H ; séquence d’IRM pondérée en fonction de l’EST). Le système de piédestal ne crée presque pas d’artefacts, à l’exception de quelques petits vides noirs contrastés autour des vis en titane (voir la figure 4G). De plus, les électrodes cliniques sont utilisées comme comparateurs dans cette étude, mais ne peuvent pas être imagées à l’IRM en raison de problèmes de chauffage et de sécurité. Par conséquent, des tomodensitogrammes sont acquis sur ces animaux, comme le montre la figure 4I. Les électrodes sont clairement visibles et le système de piédestal n’influence pas la qualité de l’image.

Après la période d’implantation, l’animal est perfusé et le cerveau extrait. Dans cette étude, l’analyse de la réponse inflammatoire est effectuée sur chaque hémisphère indépendamment. Couper le cerveau en deux est plus facile pour la préparation des tissus avant la section, et présente l’avantage que les sections peuvent être montées sur des lames de microscopie standard. Un exemple d’échantillon de cerveau est présenté avant (figure 5A) et après (figure 5B) de découpe en blocs. Le contour de l’implant est clairement visible et a créé une petite bosse dans le cerveau. En coupant dans des plans parallèles, le tissu est alors déjà aligné sur le cryostat, et les sections peuvent facilement être coupées sans perte de tissu pour le rognage (Figure 5C). Après la coloration, toute la coupe de tissu est imagée (Figure 5D), où par exemple, la couche de neurones est clairement visible en détail (voir marqueur NeuN). Des coupes entières sont fragiles et peuvent parfois entraîner une perte de tissu (voir le bas de la figure 5D), mais la zone d’intérêt est intacte. En y regardant de plus près, grâce à l’imagerie par microscopie confocale à 40x, les cellules sont clairement définies et permettent d’étudier finement les marqueurs inflammatoires, par exemple (Figure 5E). D’autres analyses quantitatives peuvent être effectuées pour comparer l’inflammation entre les hémisphères témoins et implantés. La figure 6 montre la caractérisation électrochimique des électrodes implantées. La spectroscopie d’impédance électrochimique in vitro du réseau d’électrodes molles avec module d’impédance et phase est illustrée à la figure 6A et le module d’impédance à 1 kHz sur 6 mois d’implantation est illustré à la figure 6B.

Figure 1 : Schéma de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Implantation mini-invasive d’ECoG soft sur le cerveau. (A) Accès chirurgical au crâne, avec indication de bregma. (B) Craniotomie bilatérale avec dure-mère visible. (C) Durotomie par fente sur le premier hémisphère. (D) Implantation sous-durale de l’ECoG mou et de la fermeture de la dure-mère. (E) Durotomie par fente sur le deuxième hémisphère. Fixation du lambeau osseux sur le premier hémisphère à l’aide de ponts en titane. (F) Implantation d’ECoG mou sur le deuxième hémisphère et la fermeture de la dure-mère. (G) Fixation du lambeau osseux sur le deuxième hémisphère. (H) Positionnement de la plaque plantaire sur le crâne. (I) Fixation du piédestal sur le repose-pieds. (J) Fermeture de la peau autour de la base du piédestal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Enregistrement des potentiels évoqués auditifs. (A) Schéma de placement de l’électrode à la surface du lobe temporal. (B) Cartographie représentative de l’activité de base (traces grises) et des potentiels évoqués auditifs en réponse à une stimulation en rafale de 800 Hz (trace violette). Chaque moyenne correspond à un canal sur le réseau ECoG logiciel. La moyenne est déclenchée sur le signal d’entrée analogique de la stimulation sonore. Les périodes de stimulation acoustique « ON » et « OFF » sont notées sur un canal en bas à gauche. (C) Évolution dans le temps (jour 0, mois 2 et mois 5) d’une réponse d’un seul canal après un stimulus acoustique, par rapport au signal de base lorsqu’aucun stimulus n’est présenté (gris). La moyenne est déclenchée sur le signal d’entrée analogique de la stimulation sonore. Les périodes de stimulation « ON » et « OFF » sont notées en bas. Le potentiel évoqué de la stimulation « ON » est marqué par des flèches. (D) Écart-type par canal (points colorés) par point temporel de l’enregistrement de référence. Les valeurs médianes sont représentées en bleu gras. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Imagerie in vivo du cerveau et des électrodes implantées. (A) IRM postopératoire pondérée en T1 dans le plan coronal. Une flèche indique un implant plié. (B) Partie agrandie de A, où le pliage de l’implant crée une bosse dans le cerveau. (C) IRM pondérée en T1 à 1 mois d’implantation, montrant une compression du cerveau due à l’encapsulation fibreuse du cerveau au même endroit que C. (D) Radiographie peropératoire du plan vérifiant la mise en place de l’implant et l’absence de pliage, comme observé par la mise en place du marqueur radio-opaque. En médaillon : Photographie de l’implant avec marqueur radio-opaque visible. (E) IRM postopératoire pondérée en T1 dans le plan coronaire avec mise en place optimale de l’implant. (F) IRM pondérée en T1 à 1 mois d’implantation. (G) IRM pondérée en T2 à 1 mois d’implantation. Une flèche montre l’artefact d’imagerie des vis en titane qui maintiennent le repose-pieds en place sur le crâne. (H) IRM pondérée en EST à 1 mois d’implantation. (I) TDM de l’animal implanté avec les électrodes cliniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse histologique du cerveau après implantation à long terme. (A) Photographie d’un hémisphère gauche cérébral explanté et perfusé. (B) Cerveau perfusé coupé en blocs avant l’étape de congélation. (C) Image de l’installation de la section du bloc entier sur le cryostat ; L’ensemble des « blocs prédécoupés » peut être sectionné. (D) Imagerie immunomarquante de l’hémisphère entier (scanner de lames, objectif 20x) et (E) zoom sur les premières couches du cortex (imagerie confocale, objectif 40x) montrant les cellules gliales, les astrocytes et les neurones. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Caractérisation électrochimique des électrodes implantées. (A) Spectroscopie d’impédance électrochimique in vitro du réseau d’électrodes souples (petites lignes grises pour chaque canal, la moyenne en rouge) avec module d’impédance (en haut) et phase (en bas). (B) Evolution du module d’impédance à 1 kHz sur 6 mois d’implantation (moyenne en bleu ; les lignes grises sont les canaux individuels ; la mesure in vitro est donnée comme référence en rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Piédestal compatible avec l’IRM. (A) Système de connexion transdermique compatible avec l’IRM chronique (piédestal) pour accéder au réseau d’électrodes souples. (B) Piédestal avec électrodes montées sur le repose-pieds pour l’ancrage du crâne. Médaillon : Détails du repose-pieds. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 supplémentaire : Accès chirurgical pour une perfusion optimale du cerveau. (A) Coupure cutanée et accès à l’emplacement de l’artère carotide et de la veine jugulaire. (B) Dissection du tissu autour des vaisseaux sanguins. (C,D) Identification et dissection du tissu autour de l’artère carotide et de la veine jugulaire. (E) Isolement de l’artère carotide du tissu sous-jacent. (F) Isolement de la veine jugulaire du tissu sous-jacent. (G) Mise en place du fil de suture autour de l’artère carotide (suture 1 et suture 2) et de la veine jugulaire (suture 3). (H) Fermeture de la suture 3 à la base de l’artère carotide (côté cœur) pour éviter les saignements lors de l’ouverture du vaisseau. (I) Clampage de l’artère carotide du côté opposé à H. (J) Section de l’artère carotide. (K) Cathéter inséré dans l’ouverture de J. Encart : Cathéter amorcé avec solution saline évacuée d’une seringue à l’extrémité du cathéter. (L) Fermeture de la suture 2 pour maintenir le cathéter en place et le long de l’artère. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Paramètres pour les séquences d’IRM T1- (pages 1-2), T2- (pages (3-4) et pondérées en EST (pages 5-6), respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Métadonnées pour le scanner de lames pour l’imagerie de lames entières de tranches de cerveau colorées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Métadonnées pour l’imagerie confocale d’une coupe agrandie de coupes de cerveau colorées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous présentons ici une méthode d’implantation et d’évaluation à long terme des puces ECoG souples. Dans cette étude, nous avons conçu une approche chirurgicale cohérente et mini-invasive pour l’implantation bilatérale de grilles d’électrodes fonctionnelles sur les lobes temporaux (ici, ciblant le cortex auditif). Nous avons d’abord évalué la fonctionnalité de la grille en enregistrant avec succès les potentiels évoqués au cours de l’étude (6 mois) et en suivant les propriétés électrochimiques des électrodes (voir Figure 6). Dans un second temps, nous avons évalué la biosécurité des grilles, in vivo en utilisant l’IRM et en établissant un système entièrement compatible avec l’IRM, et post-mortem en concevant un protocole de prélèvement tissulaire et d’immunomarquage.

Pour minimiser le caractère invasif, nous avons optimisé la taille de la fenêtre de craniotomie. Afin d’atteindre le cortex auditif situé sur le lobe temporal et d’éviter de réséquer le muscle temporal, nous avons mis au point une technique permettant de glisser l’implant sous la dure-mère. Cette technique permet de réduire drastiquement la surface du cerveau exposé tout en atteignant des cibles éloignées. Bien que ce type d’implantation puisse sembler aveugle, la mise en place de marqueurs radio-opaques sur les dispositifs visualisés dans la radiographie du plan peropératoire permet de vérifier le positionnement et de s’assurer que la matrice n’est pas repliée sous la dure-mère. Le glissement sous-dural s’est avéré sûr dans la plupart des répétitions que nous avons effectuées. De plus, la durotomie dans une approche en fente minimise le gonflement du cerveau pendant la période d’ouverture de la craniotomie et facilite la fermeture autour de l’implant sans nécessiter de matériel supplémentaire tel qu’une dure-mère artificielle, ce qui pourrait biaiser la réponse inflammatoire. Enfin, la force de cette approche chirurgicale est sa capacité à être transposée à différentes régions corticales. Jouer avec les coordonnées, la position de la craniotomie et la taille de l’appareil, qui peuvent toutes être ajustées, permet à cette méthode de cibler la majeure partie de la zone du cortex.

La méthode chirurgicale présentée ici, ainsi que l’évaluation fonctionnelle et l’étude de la biointégration au fil du temps, ne se limitent pas à la technologie des électrodes souples utilisée dans le présent rapport. D’autres électrodes sous-durales en cours de développement pour la traduction humaine pourraient être évaluées avec le même protocole. La force de cette méthode repose sur le fait que la plupart des pièces, telles que le câble et le piédestal, sont modulaires, personnalisables et peuvent être adaptées à l’appareil spécifique testé. De plus, des sondes intracorticales ou pénétrantes profondes peuvent également être utilisées à la place ou en combinaison avec les électrodes sous-durales, car cela ne nécessite qu’un ajustement de la géométrie de la craniotomie et de la durotomie. Les résultats à long terme peuvent ensuite être comparés à leurs homologues cliniques, comme nous l’avons fait ici.

L’une des principales limites de la méthode présentée est la présence de sinus crâniens chez les miniporcs, qui se développent au cours de la première année¹². À cet égard, les aspects importants à prendre en compte sont l’âge d’implantation et la taille de l’animal. La réalisation d’une craniotomie dans le crâne de l’adulte brise l’intégrité des sinus et entraîne un risque élevé d’infection majeure dans les contextes chroniques. De tels sinus sont visibles dans le plan de la radiographie et de la tomodensitométrie préopératoires. D’autre part, effectuer une implantation chronique trop tôt, chez un animal trop petit, n’est pas non plus optimal lorsque le crâne subit une croissance et un remodelage massifs. Nous avons émis l’hypothèse que ces « mouvements du crâne » post-opératoires pourraient faire bouger et plier l’implant, ce qui est finalement préjudiciable à l’expérience. Nous avons constaté ici que les miniporcs de Göttingen, âgés d’environ 5-6 mois (et 8 kg) au moment de l’implantation, devraient donner les meilleurs résultats.

Pour évaluer les performances de l’ECoG implanté pour les enregistrements électrophysiologiques, nous avons mis en place un protocole rapide d’enregistrement du potentiel évoqué auditif (AEP) qui peut être utilisé chez les animaux en mouvement libre et sous sédation. Il consiste à présenter une série d’éclats sonores acoustiques à des fréquences spécifiques pendant quelques minutes. L’avantage d’un tel protocole est qu’il peut être adapté à la durée d’enregistrement disponible en réduisant le nombre de fréquences sondées. L’un des défis lors de l’enregistrement des signaux corticaux sous anesthésie est que le niveau de conscience de l’animal doit être pris en compte lors de l’analyse et de la comparaison des données.

Le protocole de perfusion a été ajusté au fil du temps par l’observation de la qualité du cerveau extrait. En effet, nous avons trouvé plus facile de cathétériser l’artère carotide uniquement, et non la veine jugulaire. Dans un premier temps, la littérature présente des méthodes où la veine jugulaire est cathétérisée pour drainer les déchets²⁰. En pratique, cela limite le flux sortant du cerveau et conduit à une moins bonne extraction du sang et à une qualité globale de la perfusion. En coupant la veine jugulaire et en laissant le liquide s’échapper dans un grand récipient où l’animal repose, l’efficacité de la perfusion augmente.

Nous avons mis au point une méthode robuste de préparation des tissus qui fonctionne avec les anticorps couramment utilisés pour le traçage de l’inflammation. Nous avons séparé les deux hémisphères pour des raisons pratiques, car la moitié du cerveau du porc tient sur des lames de microscope standard et est donc compatible avec la plupart des équipements d’imagerie disponibles dans les laboratoires d’histologie. En coupant le cerveau en blocs, l’accès direct à la zone d’intérêt est rendu possible sans qu’il soit nécessaire de couper davantage l’ensemble du cerveau ou de couper de vastes parties du tissu. Les coupes de cerveau à 40 μm peuvent être regroupées dans des plaques de puits standard et colorées de manière flottante sans changements majeurs de protocole dus aux immunomarquages d’autres espèces. L’immunomarquage complet du cerveau pourrait également être envisagé en utilisant, par exemple, les méthodes CLARITY²¹.

Dans l’ensemble, ce protocole, qui couvre la conception personnalisée de l’implant jusqu’à l’implantation, le suivi de la fonctionnalité et l’évaluation de la biosécurité, est robuste et cohérent. Nous avons démontré ici sa faisabilité pour étudier le système auditif, mais il peut être transposé pour tester d’autres fonctions physiologiques. De plus, la force de notre méthode réside dans le fait qu’elle n’est pas réservée aux mini-cochons, mais entièrement transposable à d’autres espèces telles que les moutons, les chèvres ou les primates non humains. Dans une certaine mesure, il peut également être facilement adapté aux rats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Foret à os	BBraun	Elan 4 avec  ; GA861 pièce à main
Foret à os	BBraun	Neurocutter GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
Cathéter	Venisystems	Abbocath 14G
Microscope confocal	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Insert haut-parleurs	Etymotic	Etymotic ER2 Insert Écouteurs
Multimètre	Fluke Fluke	1700
Oscilloscope	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
perfusion	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	Référence 600
Anticorps primaire Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Anticorps primaire Anti-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Lapin, 019-19741
Anticorps primaire Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Générateur d’impulsions		AM Systems Modèle 2100 Stimulateur d’impulsions
la tête	multicanaux	W2100-HS32
Système d’enregistrement	Systèmes multicanaux	W2100
Tournevis	Medtronic	Poignée : 001201, Arbre : 8001205
Anticorps secondaire 488	Thermofischer	Chèvre anti-Rat IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 488, # A-11006
Anticorps secondaire 555	Thermofischer	Chèvre anti-cochon d’Inde IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorsion croisée élevée, Alexa Fluor 555, # A-21435
Anticorps secondaire 647	Thermofischer	IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 647, # A-21245
Scanner de diapositives	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Couteau Stab Fine	Science Tools	10316-14
Fil de suture dermique	Ethicon	Vicryl 2-0
Fil de suture dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0  ;
Fil de suture pour cathéter	Ethicon	Vycril 3-0 sans aiguille
Fil de suture pour le levage de la dure-mère	Ethicon	Prolene 6-0 avec aiguille BV-1
Fil de suture sous-cutané	Ethicon	Vicryl 4-0
Pont en titane	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Découpez la taille souhaitée
Vis en titane	Medtronic	9001635, 9001640
système à rayons X	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm