Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Summary

Ce protocole fournit des instructions pour déclencher et surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules vivantes.

Abstract

Les cellules de mammifères peuvent retourner les peroxysomes par pexophagie médiée par Stub1. La voie permet potentiellement le contrôle cellulaire de la quantité et de la qualité des peroxysomes. Au cours de ce processus, la protéine de choc thermique 70 et l’ubiquitine E3 ligase, Stub1, se transloquent sur les peroxysomes pour être retournés pour initier la pexophagie. L’activité de la ligase Stub1 permet l’accumulation d’ubiquitine et d’autres modules liés à l’autophagie sur des peroxysomes ciblés. L’élévation des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la lumière peroxysomale peut activer la pexophagie médiée par Stub1. On peut donc utiliser la génération de ROS assistée par colorant pour déclencher et surveiller cette voie. Cet article décrit les procédures d’utilisation de deux classes de colorants, les protéines fluorescentes et les fluorophores synthétiques, pour initier la pexophagie dans les cultures de cellules de mammifères. Ces protocoles basés sur la génération de ROS assistés par colorant peuvent non seulement être utilisés pour cibler tous les peroxysomes au sein d’une population cellulaire à l’échelle mondiale, mais peuvent également permettre la manipulation de peroxysomes individuels dans des cellules individuelles. Nous décrivons également comment la pexophagie médiée par Stub1 peut être suivie à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.

Introduction

Les peroxysomes sont des organites à membrane unique présents dans la plupart des cellules eucaryotes. Les peroxysomes sont un compartiment métabolique essentiel pour effectuer la bêta-oxydation des acides gras à très longue chaîne, le catabolisme purique, et la synthèse des phospholipides éthers et des acides biliaires¹. L’acétyl-CoA dérivé du peroxysome contrôle l’homéostasie lipidique en régulant la signalisation centrale dans le métabolisme². Par conséquent, il n’est pas surprenant que des fonctions peroxysomiques compromises soient impliquées dans diverses maladies, notamment les troubles neuro....

Protocol

1. Préparation de cellules exprimant des protéines diKillerRed ou auto-marquantes (SLP) dans la lumière du peroxysome

1. Ensemencez les cellules désirées sur des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. Pour l’expérience ici, ensemencer 2 x 10⁵ cellules SHSY5Y humaines dans 840 μL de milieu de culture (DMEM/F-12 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine) ou 6 x 10⁴ cellules NIH3T3 de souris dans 840 μL de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin et 1% de pénicilline/streptomycine) sur une boîte de culture de 35 mm avec un micropuits en verre de 20 mm de diamètre.

Results

Le schéma d’induction de la pexophagie médiée par Stub1 illustré ici tire parti de la génération de ROS assistée par colorant dans la lumière du peroxysome. Cette opération nécessite des intensités lumineuses minimales. Les peroxysomes contenant des protéines fluorescentes ou des colorants peuvent donc être éclairés à l’aide de microscopes confocaux standard à balayage laser. L’éclairage focal conduit à une production instantanée et localisée de ROS dans les peroxysomes individuels, comme indiqué par le rapporteur fluore.......

Discussion

Ce protocole détaille comment déclencher la pexophagie médiée par Stub1 dans les cultures cellulaires en élevant les niveaux de ROS peroxysomaux avec de la lumière. Comme le protocole repose sur la génération de ROS assistée par colorant, il faut s’assurer d’une expression suffisante de la coloration du ligand SLP marqué par diKillerRed-VKSKL ou colorant dans les cellules d’intérêt. Étant donné que différents types de cellules ou de cellules de différents antécédents génétiques peuvent abriter des peroxysomes aux proprié.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boîte de culture de 35 mm avec un micropuits en verre de 20 mm de diamètre  ;	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm à fond de verre
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
sérum bovin	ThermoFisher Scientific	16170060
Incubateur de culture cellulaire	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		réalisé en ajoutant le dimère tandem KillerRed avec PTS1(VKSKL)
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Mélange de milieux et de nutriments modifiés Dulbecco’s F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	L’épine dorsale de l’EGFP-C1 a été utilisée pour le clonage de EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Gène Hsp70 (HSPA1A) : PCR amplifié à partir de l’ADNc HeLa et cloné en EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		généré par insertion du gène SQSTM1 humain (par amplification PCR de l’ADNc de la cellule HeLa) dans EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		généré par insertion du gène Stub1 de souris (par amplification par PCR de l’ADNc total du rein de souris) dans EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
sérum fœtal bovin	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligand  ;	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 ajouté et cloné dans le squelette EGFP-C1
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Microscope confocal inversé  ;	Olympus	FV3000RS	microscope Ex 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, avec un incubateur à chambre TOKAI HIT et l’embout de parabole UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ;	ThermoFisher Scientific	11668	réactif de transfection
NIH3T3 cellule	ATCC	CRL-1658
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	milieu sérique réduit
pénicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplifiée à partir d’ADNc HeLa et clonée intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		généré par l’ajout d’eroGFP (tiré du plasmide Addgene 20131) avec la séquence d’acides aminés VKSKL, et cloné dans la cellule EGFP-C1
SHSY5Y	ATCC	CRL-2266	adhérente