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Systèmes d’expression acellulaire : méthodes de production et d’utilisation

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DOI :

10.3791/65014

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28 juillet 2023

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

Dans cet article

Résumé

ARTICLES DISCUTÉS :

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. Système acellulaire OnePot PURE. Journal des expériences visualisées. (172), doi :10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Des cellules à la synthèse des protéines acellulaires en 24 heures à l’aide du flux de travail d’autoinduction acellulaire. Journal des expériences visualisées. (173), doi :10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Production rapide, abordable et simple de lysat acellulaire bactérien. Journal des expériences visualisées. (176), doi :10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de matrices minimales et linéaires pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes acellulaires. Journal des expériences visualisées. (172), doi :10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Caractérisation rapide des parties génétiques avec des systèmes acellulaires. Journal des expériences visualisées. (174), doi :10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Une boîte à outils de transcription-traduction de streptomyces à haut rendement pour la biologie synthétique et les applications de produits naturels. Journal des expériences visualisées. (175), doi :10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Chromatographie liquide couplée à l’indice de réfraction ou à la détection spectrométrique de masse pour le profilage des métabolites dans les systèmes acellulaires à base de lysat. Journal des expériences visualisées. (175), doi :10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches. Journal des expériences visualisées. (176), doi :10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Étude de conception à la mise en œuvre pour le développement et la validation par le patient de diagnostics sur papier. Journal des expériences visualisées. (184), doi :10.3791/63223 (2022).

Éditorial

Les systèmes d’expression acellulaire (CFE) sont une suite d’outils qui reconstituent les processus cellulaires clés de transcription, de traduction et de métabolisme en dehors des limites de la cellule1. Ces méthodes ont rapidement gagné en popularité en offrant une expérimentation simplifiée via l’élimination des membranes cellulaires et une complexité réduite grâce à l’élimination de l’ADN génomique et de la complexité correspondante des interactions entre une construction génétique et l’hôte. Les systèmes CFE sont maintenant utilisés pour la recherche fondamentale, la détection, la biofabrication et l’éducation. Cette collection de méthodes présente neuf exemples de nouvelles façons de produire et d’utiliser des systèmes acellulaires.

Trois des méthodes visent à rendre la production de systèmes acellulaires plus accessible. Grasemann et al. décrivent une façon plus simple de fabriquer le système PURE, un système CFE qui reconstitue tous les composants nécessaires à la transcription et à la traduction, plutôt que d’utiliser des lysats cellulaires2. Au lieu d’exprimer et de purifier chacun des 36 composants protéiques, les auteurs regroupent les souches d’expression, offrant la production d’un système PURE fonctionnel en une semaine. Smith et al. proposent un processus simplifié pour la production de systèmes CFE à base de lysat à l’aide d’une approche de culture rationalisée qui réduit le flux de travail total à 24 h, réalisable pendant les heures normales de travail3. Cooper et al. décrivent une méthode utilisant une souche modifiée d’E. coli qui permet la lyse cellulaire par congélation-décongélation, éliminant ainsi le besoin de l’équipement spécialisé requis par d’autres méthodes4. Toutes ces méthodes contribuent à une tendance des efforts visant à rendre la production de systèmes acellulaires accessible par des laboratoires disposant de moins d’infrastructures et d’expertise dans les protocoles traditionnels complexes. Avec la disponibilité de kits commerciaux concurrents, de plus en plus de laboratoires peuvent explorer les avantages des systèmes CFE avec peu de risques. Grâce à des méthodes telles que celles présentées ici, ces laboratoires peuvent ensuite choisir de fabriquer leurs propres systèmes CFE adaptés à leurs besoins sans investir énormément en équipement ou en temps.

Deux méthodes mettent l’accent sur les avantages de l’expérimentation rapide et à haut débit qu’offrent les systèmes CFE. Dopp et al. présentent une méthode pour amplifier les matrices d’ADN linéaires pour le criblage rapide des constructions génétiques5. Grâce à leur approche, les conceptions génétiques peuvent être commandées auprès d’entreprises de synthèse d’ADN, puis amplifiées et criblées dans les 24 heures. McManus et al. décrivent une approche similaire dans laquelle un gène rapporteur est amplifié avec différentes amorces codant pour différents composants régulateurs6. Le faible coût des oligonucléotides associé aux systèmes CFE permet un criblage rapide et rentable de composants tels que les promoteurs. Les deux méthodes mettent en évidence le potentiel des systèmes CFE pour l’expérimentation rapide, réduisant les délais de conception et de test d’un concept de plusieurs semaines à des jours, voire des heures.

Les trois méthodes suivantes fournissent des outils pour des utilisations spécialisées des systèmes CFE. Toh et al. proposent une méthode pour créer des systèmes CFE à partir de Streptomyces venezuelae7. La majorité des protocoles CFE sont basés sur E. coli, y compris toutes les autres méthodes de cette collection. Cette nouvelle méthode pour S. venezuelae apporte les avantages des systèmes CFE à un organisme d’intérêt général pour la production de produits naturels. Dinglasan et al. proposent un moyen de mesurer les concentrations de métabolites dans les réactions acellulaires8. De telles mesures sont essentielles pour des applications en ingénierie métabolique acellulaire, où le métabolisme intact des systèmes CFE est utilisé pour produire des produits non protéiques d’intérêt. Troisièmement, Drachuk et al. présentent la microencapsulation de l’ADN pour l’ajout aux réactions CFE9. Cette approche est représentative d’un ensemble de techniques qui permettent de réintroduire rationnellement les avantages de la compartimentation dans les systèmes CFE après l’élimination des membranes naturelles lors de la fabrication des systèmes CFE. Chacune de ces méthodes diversifie la gamme d’applications auxquelles les systèmes CFE peuvent être appliqués.

Enfin, Jaenes et al. décrivent des méthodes de diagnostic du virus Zika en situation réelle basées sur les systèmes CFE10. Les tests et l’instrumentation sont peu coûteux par rapport aux technologies concurrentes telles que la PCR, et les auteurs ont testé avec succès leurs diagnostics en utilisant des échantillons de patients dans plusieurs pays. Ce travail est un excellent exemple d’applications de détection au point de besoin, qui est peut-être le domaine où les systèmes CFE sont sur le point d’avoir l’impact le plus immédiat dans le monde réel.

En tant que collection, ces méthodes capturent un ensemble représentatif des principaux domaines de recherche actifs dans les systèmes CFE ces dernières années. Les méthodes qui améliorent la production des systèmes CFE et permettent l’expérimentation à haut débit sont bien représentées, et des exemples des nombreuses utilisations plus spécifiques des systèmes CFE sont présents. D’autres domaines d’intérêt comprennent la production de protéines complexes pour des applications médicales, l’incorporation d’acides aminés non canoniques, l’optimisation pour le stockage à long terme et le développement de cellules artificielles. Nous prévoyons que l’adoption des systèmes CFE continuera de s’accélérer compte tenu de la réduction des barrières à l’entrée, du potentiel d’expérimentation rapide et d’un plus large éventail de capacités, le tout rendu possible par des méthodes telles que celles présentées dans cette collection. Les défis restants dépendent de l’espace d’application. Pour la biofabrication, la réduction des coûts à grande échelle en passant à des substrats moins chers et un meilleur recyclage sera essentielle. Pour la détection, un travail important s’appuyant sur l’exemple de Jaenes et al. est nécessaire pour démontrer des performances robustes dans diverses applications au point de besoin. D’une manière générale, le domaine doit continuer à affiner les techniques de base tout en élargissant le répertoire de ce qui peut être fait avec les systèmes CFE.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le programme de recherche appliquée pour l’avancement des priorités en S&T du Bureau du secrétaire à la Défense d’avoir soutenu la collaboration qui a mené à cette collection.

Références

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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Mots-clés

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

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