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Avant même que le prix Nobel 2017 ne soit décerné pour la cryo-microscopie électronique (cryoEM) de molécules biologiques, le domaine suscitait de l’enthousiasme. La révolution de la résolution était bien amorcée et la biologie structurale se tournait vers la cryoEM comme méthode de caractérisation se rapprochant de l’étalon-or de la cristallographie aux rayons X1. Au début, le domaine de la cryoEM englobait principalement les données générées par les microscopes électroniques à transmission cryogénique (cryoMET). Aujourd’hui, à mesure que les microscopes, les instruments de préparation d’échantillons et les méthodes de préparation d’échantillons ont progressé, les types de données générées sont devenus plus diversifiés. La CryoEM n’est plus réservée à la caractérisation des protéines par cryoTEM. Le domaine s’est développé et comprend désormais des données générées par des microscopes électroniques à cryo-balayage et des faisceaux d’ions focalisés (cryoSEM/FIB). L’impact se fait sentir plus largement dans de multiples disciplines, y compris la recherche en imagerie sur les molécules, les cellules, les tissus et les matériaux synthétiques tels que les hydrogels.
Les progrès des capacités d’imagerie ont été une force motrice dans le développement de la cryoEM. Les améliorations apportées aux caméras, aux détecteurs et au traitement d’image ont ouvert la voie à l’imagerie avec moins d’énergie, ce qui permet aux échantillons biologiques délicats de survivre au processus d’imagerie. Dans les MET, l’exposition à faible dose de faisceau s’est traduite par l’application de la tomographie dans laquelle un seul échantillon est imagé à plusieurs reprises sous plusieurs angles pour générer une reconstruction 3D 2,3. Les progrès réalisés dans le domaine des MEB/FIB ont également permis d’améliorer la résolution tout en utilisant moins d’énergie. Il est important de noter que cela a conduit à l’amélioration de l’imagerie des échantillons non conducteurs, ce qui se traduit par une meilleure imagerie volumique dans les MEB/FIB 4,5. Ces améliorations ont fait progresser l’imagerie par microscopie électronique biologique, mais elles ont particulièrement amélioré la cryoimagerie, où les échantillons sont délicats et ne contiennent aucun métal lourd supplémentaire pour améliorer le contraste.
Les capacités d’imagerie ont progressé, tout comme les instruments de préparation d’échantillons. Dans la préparation d’échantillons cryoEM, la première étape est la vitrification réussie des échantillons. Les échantillons hydratés sont congelés pour former de la glace amorphe, évitant ainsi les dommages causés par la formation de cristaux de glace. Les principales stratégies sont la congélation en plongée dans l’éthane liquide pour les molécules et les petites cellules ou la congélation à haute pression (HPF) pour les échantillons plus grands jusqu’à quelques centaines de microns d’épaisseur. Les progrès de la technologie de congélation plongeante permettent une meilleure capture des molécules dans toutes les orientations en réduisant l’auto-assemblage le long de l’interface air/eau6. De plus, les progrès de la technologie HPF permettent la stimulation lumineuse et électrique des échantillons quelquesinstants avant leur congélation7. Plus récemment, une nouvelle technologie HPF a été mise au point qui peut s’interfacer avec un microscope à fluorescence, permettant un court délai (<2 s) entre l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes et la congélation HPF8.
Les avancées ci-dessus ont dynamisé le domaine de la cryoEM et inspiré le développement de nouvelles méthodes. Il y a également eu un redynamisation des techniques établies. Ici, nous présentons une collection de méthodes axées sur l’avancement de la cryoEM dans le but de diffuser ces stratégies dans le domaine de la recherche en pleine expansion.
Bien que l’amélioration des capacités d’imagerie et des instruments de préparation des échantillons ait été un moteur majeur des progrès dans le domaine de la cryoEM, un obstacle majeur à cette recherche continue d’être la préparation pratique des échantillons. Truong et al.9 présentent une méthode qui tire parti de la formation de monocouches lipidiques à l’interface air/eau. Une couche lipidique se forme sur la grille TEM et agit comme un échafaudage pour les protéines membranaires d’intérêt. Pour les échantillons à membrane multilamellaire ou empilée, Johnson et al.10 présentent une stratégie pour « décoller » les couches excédentaires, en laissant une seule couche sur la grille qui convient à l’imagerie TEM. Dans un autre article, Chang et al.11 reconnaissent que certaines protéines dépendent de la température et que la structure pertinente est observée à des températures élevées. Ils décrivent une méthode modifiée de congélation en plongée qui permet d’appliquer des échantillons sur la grille à des températures élevées tout en obtenant de la glace vitreuse après congélation en plongée. Pour contrôler davantage le processus de préparation des grilles cryogéniques, Kang et al.12 présentent une méthode à haut débit pour produire des puces à micromotifs pour les grilles TEM dans lesquelles les pores ont une profondeur contrôlable. Cette méthode peut fournir une autre variable pour contrôler l’épaisseur de la glace amorphe pendant la préparation de la grille.
La corrélation de plusieurs modalités d’imagerie est percutante. Bieber et al.13 décrivent un flux de travail cryogénique dans lequel une grille congelée est imagée dans un microscope à cryofluorescence pour localiser une région fluorescente d’intérêt. La grille est ensuite transférée dans un cryoSEM/FIB, où des repères sont utilisés pour aligner l’image de fluorescence avec l’image MEB, permettant ainsi à la région fluorescente d’être ciblée pour le broyage FIB. La région cible est amincie à quelques centaines de nanomètres, puis la grille est transférée à un cryoTEM pour la tomographie à l’emplacement cible aminci. DiCecco et al.14 démontrent une corrélation entre le TEM liquide et le cryoTEM, se rapprochant ainsi de l’objectif de coupler les données de cryoTEM à haute résolution avec les données TEM des molécules en mouvement dynamique.
L’acquisition automatisée de grands ensembles de données est également un domaine d’intérêt. Le temps précieux consacré à l’instrument doit être maximisé, et l’automatisation est une étape clé. Kumar et al.15 décrivent la configuration clic par clic d’un logiciel d’acquisition de données automatisé pour l’imagerie cryoTEM.
Au fur et à mesure que le domaine de la cryoEM continue de se développer, de nouvelles avancées seront observées dans la préparation des échantillons, et l’impact de la cryoEM se fera sentir largement dans un plus grand nombre de disciplines. Certaines avancées impliqueront non pas de nouvelles techniques, mais le renforcement de techniques existantes. Les techniques seront plus rapides, plus faciles et plus robustes, avec un débit plus élevé. À mesure que l’automatisation augmente la production de données, les principaux domaines de développement seront l’analyse d’images et le traitement des données. De plus, l’IA jouera un rôle important. Il faut s’attendre à une réduction des coûts d’instrumentation et de l’encombrement, ce qui permettra à cette technologie de devenir plus largement accessible, même si ces développements pourraient être plus lents à se concrétiser.