Article de méthode

Etablissement d’un modèle de syndrome du cordon ombilical central chez la souris C57BL/6J

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DOI :

10.3791/65028

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8 septembre 2023

 ,  , 
1Department of Orthopaedics, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University General Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole actuel simulant le syndrome du cordon ombilical central (SCC) chez la souris a permis d’améliorer la répétabilité et de minimiser les dommages d’exploitation chez les animaux de laboratoire, évitant ainsi de perturber excessivement la structure anatomique. La stratégie de cette étude est avantageuse parce qu’elle permet de mener des recherches sur les mécanismes de blessure en produisant des résultats cohérents.

Résumé

Les modèles animaux du syndrome du cordon ombilical central (SCC) pourraient bénéficier considérablement à la recherche préclinique. Des voies anatomiques identifiables peuvent donner des approches d’exposition peu invasives et réduire les blessures supplémentaires subies par les animaux de laboratoire pendant l’exploitation, ce qui permet de maintenir une morphologie anatomique cohérente et stable pendant les expériences afin de minimiser les différences comportementales et histologiques entre les individus et d’améliorer la reproductibilité des expériences. Dans cette étude, la moelle épinière de niveau C6 a été exposée à l’aide d’une plate-forme coaxiale de lésion de la moelle épinière (SCICP) et combinée à une technique mini-invasive. Avec l’aide d’un stabilisateur vertébral, nous avons fixé les vertèbres et comprimé les moelles épinières de souris C57BL/6J avec des poids de 5 g/mm2 et 10 g/mm2 avec SCICP pour induire différents degrés de lésion de la moelle épinière C6. Conformément à la description précédente du CSC, les résultats révèlent que la lésion dans ce modèle est concentrée dans la matière grise autour de la moelle centrale, ce qui permet d’approfondir les recherches sur le CSC. Enfin, les résultats histologiques sont fournis à titre de référence pour les lecteurs.

Introduction

Ces dernières années, on a assisté à une augmentation constante de l’incidence des lésions de la moelle épinière (LME), avec plus de blessures chez les personnes âgées dues à une tauma1 moins violente. Ces lésions touchent plus fréquemment la colonne cervicale et conduisent plus souvent à un dysfonctionnement neurologique incomplet2.

Au XXIe siècle, le CSC est le type le plus répandu de lésion médullaire incomplète, représentant plus de la moitié de l’ensemble des lésions médullaires. Par rapport à la lésion médullaire incomplète classique, la SCC se caractérise par une atteinte disproportionnée des membres supérieurs par rapport aux membres inférieurs3. Elle se caractérise par une faiblesse prédominante des membres supérieurs avec un dysfonctionnement sensoriel et vésical moins important. On pense que le SCC est causé par une hémorragie et un œdème post-traumatiques de la région centrale ou, comme cela a été récemment proposé, par une dégénérescence wallérienne due à la compression de la moelle épinière dans la sténose du canal rachidien. La prise en charge du CSC ne dispose pas de données probantes de haut niveau, ce qui nécessite une compréhension globale de sa physiopathologie4. Cependant, aucun modèle de CSC n’a été signalé. Des modèles animaux appropriés sont essentiels pour la compréhension de la physiopathologie, qui peut fournir une base de recherche pour les études cliniques et précliniques 5,6,7,8,9,10.

Dans cette étude, un modèle de CSC chez la souris est établi à l’aide d’une plateforme coaxiale pour lésions de la moelle épinière (SCICP) et d’un plan d’opération mini-invasif, ce qui permet d’approfondir les recherches et la compréhension du CSC. La validité du modèle est démontrée au cours du processus de recherche par l’histoologie, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et l’analyse par immunofluorescence.

Protocole

Les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux de laboratoire du Cheeloo College of Medicine de l’Université du Shandong (numéro d’approbation : 22021). Ils ont été effectués conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, révisé en 1996). Toutes les souris utilisées dans cette étude étaient des souris femelles C57BL/6J âgées de 9 à 10 semaines achetées auprès de Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Chine). Au total, 9 souris impliquées dans cette étude ont été également randomisées dans les groupes témoin, léger et sévère. À 7, 28 et 70 jours après la blessure, une souris de chaque groupe a été sacrifiée.

1. Laminectomie C6 et exposition de la moelle épinière

REMARQUE : L’exposition a été réalisée au microscope. Les saignements peuvent être évités en prêtant attention à deux aspects : (i) Tous les vaisseaux sanguins doivent être évités. (ii) Les muscles doivent être séparés aux points d’origine et de terminaison du muscle.

  1. Préparer les instruments chirurgicaux et le SCICP.
    NOTE : La structure du SCICP a été rapportée dans une étude antérieure11. La différence par rapport à l’étude précédente est que le protocole actuel permet d’obtenir une lésion de la moelle épinière par compression. Deux poids différents (10,4 g et 20,8 g) de cette plate-forme peuvent produire une compression de 5 g/mm2 et 10 g/mm2, respectivement (Figure 1). Les étapes d’exposition et de compression de la moelle épinière sont illustrées à la figure 2.
  2. Administrer l’isoflurane à la souris par inhalation à l’aide d’un cône nasal (induction : 3 %-5 %, entretien : 1,5 %-2 %).
  3. Une fois l’anesthésie efficace, explorez un petit renflement sur la ligne médiane derrière le cou des souris, qui est l’apophyse épineuse de la deuxième vertèbre thoracique (T2).
  4. Rasez les poils autour de ce renflement. Désinfectez la peau avec trois applications alternées d’une solution d’iodophore suivie d’antiseptiques cutanés à 75% d’éthanol.
  5. Positionnez la souris à plat ventre sur la table d’opération. Appliquez une pommade pour les yeux pour protéger les yeux.
  6. Posez un coussin de 3 à 4 mm d’épaisseur sous la poitrine pour permettre une courbure arquée de la colonne cervicale, facilitant l’exposition de l’espace inter-lama et une voie respiratoire non obstruée pendant l’opération. Injecter de la buprénorphine comme analgésie préopératoire (0,05-0,1 mg/kg, SQ).
  7. Faire une incision longitudinale de 1 à 1,5 cm avec un scalpel stérile centré sur l’apophyse épineuse de la 2e vertèbre thoracique pour exposer la couche fasciale (Figure 2A).
  8. Retirez une partie du tissu adipeux au-dessus de T2 avec des micro-ciseaux stériles pour trouver l’apophyse épineuse T2.
  9. Séparez les trapèzes bilatéraux et les muscles rhomboïdes de C5-T2 le long de la ligne médiane avec des micro-ciseaux (Figure 2B).
  10. Séparez les muscles de la lame des vertèbres C5-T2 avec des micro-ciseaux et rétractez la couche musculaire sur les côtés avec des micro-écarteurs stériles (Figure 2C).
  11. Coupez les muscles multifides et cervicaux de la colonne vertébrale à la surface des vertèbres.
  12. Localisez T2 en fonction du point le plus élevé des apophyses épineuses. Sonder successivement les apophyses épineuses vers l’extrémité rostrale à partir de T2 pour localiser C6 (Figure 3).
  13. Soulevez la lame C6 à l’aide d’une pince, coupez-la et la moelle épinière est exposée (Figure 2D).

2. Lésion par compression de la moelle épinière cervicale

  1. Fixez les facettes articulaires C6-7 avec le stabilisateur vertébral et verrouillez-le (Figure 2E).
  2. Dirigez l’embout du poids stérile vers la moelle épinière exposée et assurez-vous que le fond plat de l’embout est positionné parallèlement à la surface dorsale de la moelle épinière (Figure 2F).
  3. Ajustez le manchon pour que le poids comprime la moelle épinière. Arrêtez le réglage lorsque le poids maintient une position relative constante avec la moelle épinière (Figure 2G).
    REMARQUE : Ne rendez pas ce processus trop violent ou trop rapide au cas où le poids exercerait une force de contusion sur la moelle épinière.
  4. Retirez le poids et le stabilisateur vertébral après une compression de 5 min.
  5. Observer les altérations de couleur de la moelle épinière après compression au microscope (Figure 2H).
  6. Rincez avec du PBS stérile et utilisez l’aspiration pour nettoyer le site d’opération.
  7. Suturez les muscles et la peau en couches à l’aide d’une suture non résorbable en polypropylène (taille : 6-0).
  8. Désinfectez la zone chirurgicale, placez la souris sur un tampon chaud jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience, puis remettez-la dans la cage à souris.
  9. Injecter de la buprénorphine pour l’analgésie (0,05-0,1 mg/kg, SQ) toutes les 8 à 12 h pendant 3 jours.

3. Analyse histologique

  1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de tribromoéthanol à 1,25 % (0,02 mL/g de poids corporel) aux jours 7, 28 ou 70 après la blessure. Perfuser la souris par voie transcardique avec 60 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 20 mL de paraformaldéhyde à 4 %11.
  2. Transectez la moelle épinière à 0,5 cm du centre de la lésion des deux côtés avec des micro-ciseaux et conservez la section de 1 cm de long.
  3. Immergez la section de moelle épinière préservée dans du saccharose à 30 % à 4 °C pendant 48 h.
  4. Imprégnez les tissus d’OCT, coupez les tissus en sections de 6 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryotome et collectez les sections sur une lame de verre.
  5. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
    1. Rincez les sections de 6 μm avec 1x PBS pendant 5 min 3 fois pour éliminer les résidus d’OCT.
    2. Immergez les coupes dans l’hématoxyline pendant 90 s. Lavez les sections sous l’eau courante pendant 3 min.
    3. Immergez les coupes dans l’éosine pendant 4 min. Faire tremper dans de l’alcool à 95 % pendant 30 s pour éliminer l’excès d’éosine.
    4. Enfin, déshydratez les lames avec de l’alcool (95% d’alcool et 100% d’alcool deux fois, successivement) pendant 30 s et mettez les lames dans un bain de xylène pour les nettoyer pendant 2 min. Ensuite, scellez les sections avec un verre de protection et du gel de résine.
  6. Coloration au bleu de Prusse
    1. Immergez les lames pendant 20 min dans un mélange égal de ferrocyanure de potassium (10 %) et d’acide chlorhydrique (10 %).
    2. Rincez 3 fois à l’eau distillée et contre-colorez pendant 5 min avec Nuclear Fast Red.
    3. Rincez trois fois à l’eau distillée, suivie d’un rinçage à l’alcool à 95 % et de deux rinçages à l’alcool à 100 % pendant 5 min.
    4. Nettoyez les sections de xylène deux fois pendant 3 min chacune, puis scellez avec du gel de résine12.
  7. Coloration par immunofluorescence
    1. Incuber les lames avec les anticorps primaires suivants pendant 1 h à 37 °C : molécule adaptateur de liaison au calcium anti-ionisée de lapin 1 (Iba-1) (1 :500), qui a été régulée à la hausse dans la microglie après une lésion nerveuse ; protéine acide fibrillaire antigliale (GFAP) de souris (1 :300), qui est exprimée en astrocytes dans le système nerveux central ; anti-neurofilament-200 de lapin (NF-200) (1 :2000), qui est exprimé dans le neurofilament.
    2. Incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante (RT) : Alexa Fluor488 chèvre anti-souris et Alexa Fluor594 chèvre anti-lapin (1 :1 000).
    3. Prenez des photos et analysez-les plus en détail à l’aide d’un microscope à fluorescence13.

4. Imagerie par résonance magnétique

  1. Anesthésier la souris 7 jours après la lésion avec une anesthésie à l’isoflurane (1 % à 2 % d’isoflurane, 20 % à 30 % d’O2) administrée à l’aide d’un mini-masque.
  2. Scingraphier la moelle épinière cervicale en orientation sagittale. Utilisez les paramètres suivants pour l’imagerie IRM : séquence d’écho de spin (SE) en multicoupe et entrelacée avec TR/TE = 2500/12 ms, matrice d’acquisition = matrice 256 x 128 sur le champ de vision (FOV) = 12 x 8 mm2, épaisseur de la tranche = 1 mm et nombre d’excitations (NEX) = 2.
    REMARQUE : Maintenez la fréquence respiratoire de la souris à 10-15/min pendant la numérisation pour éliminer les artefacts d’image liés à la respiration14.

Résultats

La coupe sagittale de l’HE suggère que même si la zone endommagée dans la matière grise était plus large dans le groupe sévère, la continuité sur la substance blanche était présente. De plus, la différence de zone de matière grise endommagée entre les groupes sévère et léger confirme le caractère raisonnable du paramètre de groupe dans le protocole (figure 4).

Les coupes coronaires de l’HE montrent que la lésion existe principalement dans la matière grise dans les deux groupes. Dans le groupe sévère, la structure de la substance blanche entourant la matière grise était plus susceptible d’être touchée, mais le contour de la substance blanche était toujours maintenu (Figure 5). L’immunofluorescence NF-200 suggère que même si la substance blanche entourant la matière grise a été affectée dans le groupe sévère, la substance blanche était encore relativement intacte. Ces résultats concordent avec les caractéristiques décrites pour le CSC dans l’étude précédente4 (figure 6).

Aucun globule rouge n’a été trouvé dans les coupes d’HE sagittale 7 jours après la lésion, que ce soit dans le groupe léger ou sévère. La coloration au bleu de Prusse n’a révélé aucune hémosidérose dans le groupe léger, mais dans le groupe sévère. Ces résultats indiquent que l’induction d’une hémorragie peut nécessiter un degré de dommage relativement grave (Figure 7).

L’immunofluorescence a révélé des zones d’expression élevée de GFAP et d’Iba-1 dans les lésions légères et sévères, suggérant une réponse inflammatoire et la formation d’une cicatrice gliale dans la lésion. De plus, le groupe sévère présentait une plus grande surface lésionnelle que le groupe léger (figure 8).

L’IRM est une méthode relativement peu invasive pour observer la moelle épinière. Les résultats suggèrent que dans les groupes légers et sévères, il y a un changement de signal hypointense dans la lésion avec un contour de signal élevé. Le groupe sévère a montré une zone de signal hypointense significativement plus grande (Figure 9). Le signal hypointense suggère un précipité du lysat de réticulocytes dans cette zone, et le signal hyperintense environnant suggère une réponse inflammatoire. Nous avons effectué plusieurs tests comportementaux dans notre étude précédente. Par exemple, le test de force de préhension dans les membres antérieurs révèle une différence significative15.

Poids et manchon pour la configuration du rhéomètre ; Utilisé dans les expériences de mesure de viscosité.
Figure 1 : Le manchon et les poids du SCICP. La surface de l’embout a été conçue pour être de 1,3 mm x 1,6 mm en fonction de la zone exposée de la moelle épinière mesurée après la laminectomie C6. Le poids est recouvert de PTFE, ce qui réduit efficacement la friction entre la paroi intérieure du manchon et le poids. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Séquence de l’intervention chirurgicale, étapes A-H, dissection tissulaire, incision, pinces, dispositif expérimental.
Figure 2 : Exposition et compression de la moelle épinière. (A) Incision longitudinale de la peau ; (B) Séparer les muscles rostralement de l’apophyse épineuse T2 ; (C) Séparez les muscles au-dessus des lames ; (D) laminectomie C6 ; E) Fixation du corps vertébral ; f) Déterminer l’emplacement de la compression ; (G) Compression de la moelle épinière ; (H) Pas de dommages significatifs à la substance blanche au-dessus de la moelle épinière après compression de la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Schéma d’anatomie du squelette montrant la sixième vertèbre cervicale et l’apophyse épineuse T2.
Figure 3 : Anatomie du squelette cervical d’une souris. Le site indiqué par la flèche est l’apophyse épineuse T2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Panneau de diapositives d’histologie, tissus à divers stades de l’infection, légers à sévères, barres d’échelle de 1 mm.
Figure 4 : Les coupes sagittales colorées à l’HE. (A) Coupe sagittale de la moelle épinière cervicale. (B,C) Le groupe sévère présentait des dommages plus graves que le groupe léger, mais les deux se concentraient sur la matière grise autour de la moelle centrale. Les images de 7, 28 et 70 ppp ne suggèrent aucune différence significative dans l’expression de la lésion dans le même groupe de lésions à différentes périodes et que la continuité de la substance blanche dans la moelle épinière supérieure et inférieure est maintenue. Barre d’échelle : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comparaison de l’histologie tissulaire, 28 dpi ; dégénérescence nerveuse légère, légère et sévère ; image au microscope.
Figure 5 : Lésions de la moelle épinière cervicale en coupes coronales colorées à l’explosif épinière. (A-C) La blessure affecte principalement la matière grise entourant le cordon central, comme on le voit dans les panneaux B et C. Le groupe des blessures graves souffre d’une gamme plus étendue de dommages que le groupe des blessures légères, qui sont plus susceptibles d’affecter la substance blanche. Barre d’échelle : 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Microscopie de la moelle épinière, coloration NF-200 ; Sections transversales : témoin, légères, sévères ; Analyse 28 dpi.
Figure 6 : Immunofluorescence coronale NF-200 après une blessure. Réponse NF-200 sans différence significative au niveau de la substance blanche. Barre d’échelle : 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comparaison histologique ; contrôle, lésions tissulaires légères et sévères à 7 dpi ; images de diapositives ; Échelle de 400 μm.
Figure 7 : Coloration au bleu de Prusse. (A-C) L’hémosidérose a été observée dans le groupe sévère, mais pas dans le groupe léger. Barre d’échelle : 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Microscopie d’immunofluorescence montrant l’expression des marqueurs Iba1 et GFAP avec des images fusionnées.
Figure 8 : Immunofluorescence GFAP sagittale et Iba-1 après une lésion. (A-C) Au fur et à mesure que le degré de lésion augmente, la zone de réponse GFAP et Iba-1 augmente. Barre d’échelle : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse IRM de la courbure vertébrale comparant les cas témoins, légers et sévères à 7 dpi.
Figure 9 : IRM sagittale après lésion de la moelle épinière cervicale (images pondérées en T2). La région de la lésion a été observée comme un signal hypointense dans les groupes de blessures légères et graves, avec une zone beaucoup plus large de signal hypointense dans le groupe des blessures graves. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Parmi les nombreux types de lésions de la moelle épinière, le SCC est l’un des typesde lésions les plus susceptibles d’être traités3,4. En raison de l’absence de modèles de recherche en laboratoire, la recherche sur le CSC à partir des années 1950 s’est concentrée sur les études cliniques et les études de dissection cadavérique 3,16,17. La présente étude montre l’utilisation d’outils compatibles et de procédures mini-invasives pour établir le modèle de CSC chez la souris. D’un point de vue technique, cette plate-forme présente une forte opérabilité et une bonne reproductibilité. Étant donné que les résultats de l’expérience démontrent la validité, notre technique pour établir le modèle le plus proche de la norme que les études précédentes ont définie pour CCS4.

Les études antérieures sur les lésions de compression ont principalement utilisé des pinces d’anévrisme, des ballons et des pinces calibrées 9,10,18. De plus, la plupart des blessures sont survenues au niveau de la moelle épinière thoracique18. La moelle épinière au niveau C6 a été choisie comme segment lésé dans cette étude pour étudier les caractéristiques du SCC. Il convient de noter que le taux de survie du modèle CCS est également un facteur essentiel pour assurer la cohérence expérimentale. La présente étude rapporte que la moelle épinière cervicale de la souris est causée par une lésion par compression bilatérale, tandis qu’une lésion traumatique de haut niveau de la moelle épinière, en particulier une lésion bilatérale, pourrait être mortelle pour les animaux de laboratoire si elle est trop grave. Selon El-Bohy, la moelle épinière C4/5 est plus susceptible d’affecter les tractus bulbospinaux descendants et les motoneurones liés aux voies respiratoires, ce qui conduit les animaux de laboratoire à la dépression respiratoire et à la mort 18,19,20,21,22,23., Dans cette étude, les souris présentant différents degrés de compression sur la moelle épinière cervicale C6 ont des caractéristiques de blessure significativement différenciées suggérées par tests histologiques. Bien qu’il y ait eu des différences comportementales et histologiques significatives dans le modèle de clampage de la moelle épinière cervicale de souris rapporté par Forgione, une perturbation des pédicules, des processus articulaires, des lames et même des racines nerveuses était nécessaire pour clamper la moelle épinière avec les pinces modifiées, ce qui a eu une influence significative sur la stabilité des structures cervicales24. Une autre étude sur les lésions cervicales a rapporté l’utilisation de l’apophyse transverse comme site de fixation5. Même si les processus articulaires ont été empêchés d’être endommagés, une dégradation excessive des tissus musculaires pourrait également avoir un impact sur la stabilité de la moelle épinière. Dans la présente étude, seule la 6elame cervicale a été réséquée pour maintenir la stabilité de la moelle épinière cervicale, les articulations articulaires adjacentes ayant été préservées et les lésions musculaires excessives évitées. Dans le même temps, la compression au-dessus de la moelle épinière empêche d’endommager les racines nerveuses.

Les résultats de l’étude suggèrent que la zone de lésion de la moelle épinière cervicale des souris de chaque groupe se trouvait principalement dans la matière grise près de la moelle centrale, qui caractérisait le CCS, avec des différences significatives dans l’étendue de la lésion entre les différents groupes. Notamment, les coupes pathologiques que nous avons montrées peuvent avoir atténué la manifestation de la blessure parce que les échantillons ont été collectés quelques jours après la blessure. L’immunofluorescence (NF-200) a montré moins de dommages aux voies neurales dans la région de la substance blanche de la moelle épinière, ce qui a également confirmé que les dommages dans le CSC étaient principalement concentrés autour de la moelle centrale. Le résultat de l’immunofluorescence a été aggravé par les résultats histologiques antérieurs de la pathologie. Des études antérieures ont montré que le CSC entraîne un œdème près de la moelle centrale, entraînant un hématome et, finalement, un dysfonctionnement de la partie médiale du tractus corticospinal latéral3. L’hémorragie a été signalée comme une composante typique du SCC, mais elle est rarement observée dans les études d’imagerie et d’autopsie ultérieures17. Dans cette étude, les résultats de l’EH à 7 jours après la lésion ont suggéré des signes d’œdème tissulaire dans tous les groupes ; Cependant, aucun globule rouge résiduel n’a été trouvé dans la zone de la blessure. Par conséquent, le bleu de Prusse a été utilisé pour examiner la zone de la blessure à la recherche d’une hémorragie, et les résultats correspondaient à l’hémosidérose observée dans la zone de blessure du groupe de blessures graves à 7 jours après la blessure, alors que le groupe léger ne l’a pas fait. Les images IRM T2 ont montré que les blessures légères et graves avaient des zones de signal faible dans la zone endommagée de la blessure 7 jours après la blessure. indiquant ici le dépôt de lysat de réticulocytes. Ces résultats fournissent une preuve circonstancielle que l’écart entre les résultats précédemment rapportés est probablement dû au fait que le test IRM est potentiellement plus sensible que le test histologique14, en plus de la gravité de la blessure, ce qui peut également influencer la quantité d’hémorragie dans la zone de la blessure. Le GFAP a également été largement exprimé dans la zone endommagée. Dans le même temps, l’expression d’Iba-1 a également été observée dans des zones intactes, suggérant la persistance d’une réponse inflammatoire, cohérente avec les résultats de l’IRM, où un anneau de signal hyperintense autour de la zone de signal hypointense dans la lésion suggère la présence d’une réponse inflammatoire. En fin de compte, d’après les résultats de la présente étude, la zone de lésion dans le modèle s’est concentrée sur la matière grise autour de la moelle centrale, ce qui est généralement cohérent avec les descriptions précédemment rapportées13. Malheureusement, nous n’avons pas effectué d’IRM de manière répétitive chez chaque animal expérimental pour montrer comment le site de la blessure change dynamiquement avec le temps. Les futurs chercheurs pourront l’inclure dans leurs travaux pour mieux étudier le CSC. En outre, l’immunomarquage avec des marqueurs neuronaux comme NeuN, qui définissent la matière grise, peut être inclus dans l’étude.

En conclusion, les caractéristiques des résultats de la pathologie et de l’IRM présentent des similitudes étroites avec celles décrites pour le CSC dans des études antérieures4. Le protocole actuel, qui modélise le CSC, permet d’approfondir la recherche et la compréhension du CSC.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par le projet national de recherche et de développement sur les cellules souches et la transformation (2019YFA0112100) et le programme national des sciences naturelles de Chine (81930070).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4 % solution fixatriceSolarbioP11104 %
Anti-Neurofilament anticorps polypeptide lourdAbcamab8135Taux de dilution (1:2000)
Solution de coloration à l’éosine (soluble dans l’eau)BiosharpBL727B
EthanolFuyu Reagent
Microscope à fluorescenceKEYENCEBZ-X800
Trancheuse CongeléeLeica
GFAP (GA5) Souris mAb  ;Cell Signaling TECHNOLOGY#3670Taux de dilution (1:600)
IgG anti-souris de chèvre (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisherSCIENTIFICA32723TRTaux de dilution (1:1000)
IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Anticorps secondaire anti-souris hautement adsorbé, Alexa Fluor Plus 594 ThermoFisherSCIENTIFICA32740Taux de dilution (1:1000)
Hématoxyline Solution de colorationBiosharpBL702A
SourisJinan Pengyue Animal d’expérimentationSociété  ;C57BL/6J  ;
Appareils de microchirurgie  ;Shandong ULT Biotechnology Co., LtdTous les instruments chirurgicaux sont desciseaux ophtalmiques sur mesure, des pinces à micro-moustiques, des pinces de microchirurgie, des micro-ciseaux
Sérum de mouton normal pour le blocage (solution de travail)Zhong Shan Jin QiaoZLI-9022solution de travail
O.C.T. CompoundSAKURA4583
Solution tamponnée au phosphate (PBS)  ;SolarbioP1020pH 7,2&ndash ; 7.4
Kit de coloration au fer bleu de Prusse (avec éosine)SolarbioG1424
RWD Station d’anesthésie par inhalation de laboratoireRWD Life Science Co., LtdR550
Système d’imagerie microCT in vivo pour petits animauxPerkinElmer  ;Quantum GX2
Plate-forme coaxiale pour lésions de la moelle épinièreShandong ULT Biotechnology Co., LtdSur mesure (norme de Feng)https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~
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dbacbba& sf=qq_sm& is_share=
1& shopAutoEnter=1& share_cmpt
=native_wechat& is_silence_auth=1
Microscope chirurgical  ;Zumax  ; Compagnie Médicale, Ltéezumax, OMS2355
Tris Saline+Tween tamponné (TBST)SolarbioT1082Taux de dilution (1:19)
XylèneFuyu Réactif

Références

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