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Purification du complexe de récolte de lumière I-Light à partir de tissus végétaux

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DOI :

10.3791/65037

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3 février 2023

 , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Center for Applied Structural Discovery, Arizona State University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement du Photosystème I (PSI) - Complexe de récolte de la lumière I (LHCI) à partir des tissus végétaux. Le PSI, avec le PSII, est responsable de la conversion de la lumière en énergie chimique chez les photoautotrophes oxygénés et a une efficacité quantique de ~1, ce qui en fait une cible pour l’étude du transfert d’énergie induit par la lumière.

Résumé

Cette méthode est utilisée pour isoler le photosystème I (PSI) ainsi que le complexe de collecte de lumière I (LHCI), son antenne native, des plantes. PSI-LHCI est un grand complexe protéique membranaire coordonnant des centaines de facteurs de collecte de lumière et de transport d’électrons, et constitue le système de collecte de lumière le plus efficace trouvé dans la nature. Les photons absorbés par les quatre protéines de l’antenne LHCA qui composent LHCI sont transférés par interaction excitonique au centre de réaction du PSI et sont utilisés pour faciliter la séparation des charges induite par la lumière à travers la membrane thylakoïde, fournissant ainsi un pouvoir réducteur et de l’énergie pour la fixation du carbone chez les organismes photoautotrophes. L’efficacité quantique élevée du PSI fait de ce complexe un excellent modèle pour étudier le transfert d’énergie induit par la lumière. Dans ce protocole, les tissus végétaux sont homogénéisés mécaniquement et les chloroplastes sont séparés des débris cellulaires en vrac par filtration et centrifugation. Les chloroplastes isolés sont ensuite lysés osmotiquement, et les membranes thylakoïdes sont récupérées par centrifugation et solubilisées à l’aide du détergent n-dodécyl-bêta-maltoside. Le matériel solubilisé est chargé sur une colonne d’échange d’anions pour recueillir la plupart des complexes contenant de la chlorophylle. Les plus gros complexes sont précipités de la solution, remis en suspension dans un petit volume et chargés sur des gradients de saccharose pour séparer les principaux complexes contenant de la chlorophylle. Les fractions de gradient de saccharose qui en résultent sont caractérisées afin d’identifier la bande d’intérêt contenant le PSI-LHCI. Ce protocole est très similaire au protocole utilisé dans la cristallisation des PSI-LHCI des plantes avec quelques simplifications et s’appuie sur des méthodes développées au fil des ans dans le laboratoire de Nathan Nelson.

Introduction

La photosynthèse oxygénée est l’une des réactions chimiques les plus importantes sur notre planète. La conversion de la lumière en énergie chimique se produit dans les centres de réaction de deux photosystèmes, le photosystème I (PSI) et le photosystème II (PSII)1 (Figure 1A). Le PSI est un grand complexe pigmentaire-protéine multisous-unitaire hautement conservé qui a évolué il y a plus de 3,5 milliards d’années 2,3. Ce complexe, qui contient environ 100 molécules de chlorophylle et environ 20 caroténoïdes, facilite le transfert d’électrons à travers la membrane thylakoïde, de la plastocyanine à la ferrédoxine, agissant comme l’accepteur terminal d’électrons de la chaîne de transport d’électrons photosynthétiques 1,4,5 (Figure 1B, C). Chez les plantes, cette séparation de charge induite par la lumière est le résultat de l’énergie lumineuse transférée à la fois des pigments de l’antenne du noyau du PSI et des pigments de l’antenne périphérique du complexe de collecte de la lumière I (LHCI) au centre de réaction du PSI (Figure 1D). LHCI est un complexe d’antennes spécifique du PSI au sein de la membrane thylakoïde composé de quatre protéines d’antenne LHCAde liaison à la chlorophylle A/B 6,7.

figure-introduction-1
Figure 1 : La chaîne de transport d’électrons photosynthétiques et la structure globale du complexe PSI-LHCI. (A) La chaîne de transport d’électrons photosynthétiques contient quatre principaux complexes photosynthétiques liés à une membrane et trois porteurs d’électrons solubles. Le flux d’électrons (flèches rouges) à travers la chaîne de transport et le pompage de protons (flèches noires) dans la lumière sont utilisés pour créer un pouvoir réducteur (NADPH) et produire de l’ATP pour la fixation du carbone 37,38,39,40. Créé avec Biorender.com. (B) La structure de la plante PSI-LHCI du côté luménal. PsaA et PsaB sont les plus grandes sous-unités du PSI et constituent le cœur du complexe. LHCI est le complexe d’antennes collectrices de lumière associé au PSI et est composé de quatre antennes, LHCA1-4. (C) Le complexe PSI-LHCI coordonne plus de 150 ligands. On voit ici les chlorophylles (vert), les caroténoïdes (rose), les quinones (violet), les lipides (orange) et les grappes FeS du centre de réaction en jaune/orange. (D) Le centre réactionnel du PSI est divisé en deux branches (A et B), à partir de P700, le centre de réaction une paire spéciale de chlorophylle, allant en deux chlorophylles accessoires (A-1A/B) suivies d’une autre paire de chlorophylles (A0A/B). Ces chlorophylles sont suivies d’une phylloquinone (A1A/B ou QA/B dans certaines publications) dans chaque branche avant de se rejoindre au niveau du cluster fer-soufre Fx suivi de deux autres clusters, FA et FB, coordonnés par la sous-unité PsaC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La première isolation de PSI sur des plantes en 1966 a mis en lumière les différences de teneur en pigments collecteurs de lumière entre le PSI et le PSII, montrant que le PSI était fortement enrichi en β-carotène par rapport au PSII et que les cytochromes f et b6 (qui font partie des complexes du cytochrome b6f) ne sont pas étroitement liés au PSI mais faiblement associés à l’intérieur de la membrane thylakoïde8. Neuf ans plus tard, avec la dénaturation partielle du PSI isolé par traitement SDS, il a été démontré que la dissociation des petites sous-unités PSI atténuait la photoréduction NADP+ par le PSI, tandis que le signal P700 et la plupart des chlorophylles restaient dans la particule PSI de grand poids moléculaire restante, identifiant la nécessité de certaines des petites sous-unités du PSI pour la fonction biologique complète et l’emplacement du centre de réaction PSI9. Les recherches sur l’association entre le cœur du PSI et le LHCI ont été publiées pour la première fois au début des années 1980, lorsque des isolements d’espèces PSI de différentes tailles contenant des rapports différents de chlorophylle A à P700 ont été observés, suggérant l’association du PSI avec un système d’antenne périphérique contenant de la chlorophylle 10,11,12,13. Cependant, ce n’est qu’en 2003 que la première structure cristalline de la plante PSI a été publiée14. La structure cristalline du PSI-LHCI de la plante a mis en évidence la conservation remarquable entre le noyau PSI des plantes et les cyanobactéries et a fourni la première image de la disposition de la chlorophylle dans le noyau PSI de la plante et l’antenne LHCI, approfondissant ainsi la compréhension des voies de transfert d’énergie au sein du complexe PSI-LHCI14 de la plante. Au cours de la dernière décennie, d’autres structures PSI-LHCI ont été déterminées, ajoutant des détails de niveaux atomiques à la description structurelle du super-complexe15, 16, 17, 18, 19.

Le PSI a non seulement une efficacité quantique proche de un, mais possède le potentiel de réduction le plus négatif de la nature20,21. Une compréhension complète du PSI-LHCI et de ses propriétés est essentielle pour comprendre le transfert d’énergie induit par la lumière et appliquer des solutions bio-inspirées aux futures technologies de collecte de la lumière. Pour mieux comprendre comment le PSI-LHCI et ses nombreuses sous-unités peuvent réaliser une conversion d’énergie aussi efficace, les complexes isolés pour l’étude doivent être actifs et entiers. Ce protocole permet la purification en douceur du complexe dans cet état actif22,23.

Dans cette méthode, les tissus végétaux sont perturbés mécaniquement et les chloroplastes contenant la chaîne de transport d’électrons photosynthétiques sont isolés par centrifugation. Les membranes thylakoïdes sont séparées après la lyse hypotonique du chloroplaste et sont ensuite solubilisées à l’aide du détergent n-dodécyl-bêta-maltoside (β-DDM). Les complexes membranaires solubilisés contenant de la chlorophylle sont séparés par chromatographie échangeuse d’anions, et le PSI-LHCI est séparé par centrifugation par gradient de saccharose. Après retrait du gradient et après caractérisation par spectroscopie et par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), le complexe peut être préparé pour d’autres expériences. Cette procédure est utilisée pour purifier le complexe PSI-LHCI des plantes sans utiliser d’étiquettes d’affinité. Avec des modifications mineures, il peut être adapté pour des préparations du complexe à partir d’autres organismes, stabiliser des complexes PSI alternatifs ou d’autres complexes de la chaîne de transport d’électrons photosynthétiques. Des protocoles similaires ont été utilisés pour obtenir un complexe PSI adapté à l’analyse structurelle à haute résolution 23,24,25,26,27,28,29,30.

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Protocole

1. Préparation des membranes thylakoïdes à partir de feuilles d’épinards

  1. Travaillez sur de la glace et évitez l’exposition à la lumière dans la mesure du possible dans cette préparation. Un environnement peu éclairé est suffisant si des concentrations élevées de chlorophylle sont maintenues, et on prend soin de garder les échantillons couverts autant que possible. Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 4 °C, sauf indication contraire.
  2. Retirez les tiges des feuilles d’épinards (500 g) à l’aide de ciseaux, pressez doucement les feuilles dans un mélangeur et recouvrez complètement de saccharose glacé, de tricine, de tampon NaCl (STN) (tableau 1). Homogénéiser les tissus végétaux dans le tampon STN pendant 10 s deux fois (total 20 s), en laissant 10 s entre les impulsions pour éviter la surchauffe à l’aide du réglage d’impulsion.
    REMARQUE : Un rapport typique entre le tampon et les feuilles est de 1 L de tampon STN pour 500 g de feuilles d’épinards.
  3. Filtrez les débris cellulaires à travers huit couches d’étamine en fixant les couches d’étamine sur un grand bécher réfrigéré ou un autre récipient et en versant le mélange mélangé à travers le chiffon. Utilisez une tige de verre ou une cuillère pour remuer les débris cellulaires dans le filtre afin de permettre au lysat de s’écouler.
  4. Chloroplastes granulaires du lysat cellulaire par centrifugation à 1000 x g pendant 9 min. Remettre les chloroplastes en suspension dans 1 L de tampon hypotonique (tableau 1). Pour remettre les chloroplastes en suspension, utilisez une pipette ou une pastille de chloroplaste tourbillonnante dans un tampon et transférez-la dans un broyeur de tissus ou un homogénéisateur similaire de taille appropriée.
    REMARQUE : L’exposition à une solution hypotonique et la remise en suspension dans un broyeur de tissus lysent les chloroplastes.
  5. Centrifuger pendant 2 min à 500 x g pour éliminer l’amidon (recueilli sous forme de pastille blanche). Remettez doucement en suspension toute matière verte qui s’est réinjectée dans le surnageant à l’aide d’une pipette ou d’un petit pinceau, tout en évitant autant que possible la remise en suspension de l’amidon. Centrifuger la solution à 12 000 x g pendant 10 min pour granuler les membranes thylakoïdes.
  6. À l’aide d’une pipette ou d’un petit pinceau, remettre en suspension les membranes granulées en quantités minimales de tampon à haute teneur en sel (tableau 1), juste assez pour remettre les membranes en suspension et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur comme à l’étape 1.4. Centrifugeuse à 8000 x g pendant 10 min.
  7. Remettre en suspension comme précédemment dans des quantités minimales de tampon STN2 (tableau 1), juste assez pour remettre en suspension les membranes et mesurer la teneur en chlorophylle à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Déterminer la concentration de chlorophylle en diluant l’échantillon à 1/1000 dans une solution d’acétone à 80 % et en utilisant la méthode de Porra et al.31.
  8. Ajustez à la concentration de chlorophylle souhaitée, généralement 3 mg/mL, en ajoutant uniformément le tampon STN2 et l’aliquote dans deux ou trois tubes à centrifuger. Le rendement attendu pour 500 g de feuilles est d’environ 200 mg de chlorophylle, mais des variations en fonction de l’état du matériel de départ sont attendues. Congeler à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la solubilisation membranaire. Les membranes congelées à ce stade sont stables pendant au moins 6 mois.

2. Solubilisation membranaire

  1. Solubiliser les membranes thylakoïdes avec du β-DDM. Ajoutez suffisamment de détergent à partir d’un stock de β-DDM à 10 % pour obtenir un rapport β-DDM/chlorophylle de 6:1. Incuber sur glace pendant 30 min. Mélangez doucement toutes les 5 à 10 minutes en retournant lentement le tube plusieurs fois.
  2. Centrifuger à 120 000 x g pendant 30 min à l’aide d’une ultracentrifugeuse pour éliminer les matériaux insolubles. Jetez la pastille et conservez le surnageant pour les étapes suivantes.

3. Élution à l’aide d’une colonne de diéthylaminoéthyle (DEAE)

  1. Préparer la colonne d’échange d’anions en utilisant un volume de lit de 1,5 mL pour 1 mg de chlorophylle totale dans l’échantillon solubilisé. Préparez la colonne et faites-la fonctionner à 4 °C. Versez la résine dans une colonne fixée sur un support d’anneau. Laissez la résine se déposer tout en ajoutant de l’eau ou un tampon à faible teneur en sel pour éviter que la colonne ne s’assèche. Assurez-vous que la colonne est exempte de bulles et que le haut est plat et de niveau.
  2. Lavez la colonne à l’aide de deux volumes de colonne (CV) de tampon à faible teneur en sel (tableau 1) et chargez le surnageant de l’étape 2.2 sur la colonne. Laissez le surnageant s’enfoncer complètement dans la colonne avant de continuer.
  3. Laver la colonne dans un CV de tampon à faible teneur en sel.
  4. Éluer à l’aide d’un gradient linéaire de NaCl avec les tampons de colonne à faible teneur en sel et à colonne de sel élevé (5-250 mM de NaCl ; Tableau 1) dans un volume total de six CV (c.-à-d. si le volume du lit de la colonne est de 30 mL, utilisez 90 mL de tampon à faible teneur en sel et 90 mL de tampon à haute teneur en sel).
    1. Remplissez deux béchers avec les tampons à faible teneur en sel et à haute teneur en sel. Tout en faisant couler un tampon à faible teneur en sel dans la colonne, créez un pont salin entre les tampons à haute teneur en sel et à faible teneur en sel à l’aide d’un tube rempli d’eau pour les mélanger progressivement. Utilisez une barre d’agitation pour vous assurer que le tampon à haute teneur en sel qui se déplace dans le tampon à faible teneur en sel est mélangé avant d’être versé dans la colonne. Cela garantit que le gradient NaCl est linéaire. Commencez à collecter des fractions.
  5. Prélever des fractions de 4 mL (pour une expérience typique commençant avec environ 35 mg de chlorophylle) et combiner les fractions vert foncé éluées autour du dernier tiers du gradient (figure 2A).

4. Précipitation du polyéthylène glycol (PEG)

  1. Aux fractions de chlorophylle combinées, ajoutez lentement de l’PEG6000 jusqu’à une concentration finale de 8 %. La concentration de PEG peut varier un peu ; si les précipitations ne sont pas observées après avoir atteint 8 %, augmentez la concentration de PEG par tranches de 2 % jusqu’à ce que les précipitations soient observées (la solution deviendra trouble).
  2. Centrifugeuse à 3 214 x g pendant 5 min. Jeter complètement le surnageant ; l’élimination complète de tous les résidus de PEG est essentielle pour obtenir une bonne solubilisation à l’étape suivante. Remettre le précipité vert en suspension dans 2 à 5 mL de tampon de remise en suspension après colonne (tableau 1).
  3. Pour vérifier que les thylakoïdes ont été complètement lavés du PEG, essorez une petite aliquote de la matière remise en suspension dans une centrifugeuse de paillasse à 18 407 x g à 4 °C pendant 5 minutes pour vous assurer que la matière est soluble. Un petit précipité vert est acceptable à ce stade, mais la plupart, sinon la totalité, de la chlorophylle doit rester dans la solution. Conservez la fraction soluble.

5. Préparation des gradients de saccharose

  1. Préparez des gradients discontinus de 10 % à 30 % de saccharose en cinq couches (10 %, 15 %, 20 %, 25 % et 30 %) avec un tampon de gradient de saccharose (tableau 1). Assemblez les gradients de saccharose en superposant soigneusement les fractions de saccharose dans un tube à centrifuger polyallomère, en commençant par la couche de 30 % et en terminant par la couche de 10 %. Ajustez le volume de chaque couche de manière à ce qu’il y ait suffisamment d’espace libre en haut du tube pour charger le volume d’échantillon souhaité.
  2. Chargez des échantillons de la matière soluble à partir de l’étape 4.2 dans des gradients de saccharose. Chargez suffisamment d’échantillon pour obtenir 170 μg de chlorophylle dans un tube et 420 μg de chlorophylle dans un autre pour obtenir des gradients à différentes concentrations afin d’évaluer l’homogénéité de chaque bande (figure 3A).
    REMARQUE : La quantité d’échantillon ajoutée est arbitraire, mais une fourchette d’environ 150 à 500 μg de chlorophylle est généralement appropriée.
  3. Centrifuger les gradients à 100 000 x g pendant 16 h pour séparer les différents complexes à l’intérieur de l’échantillon.

6. Élimination des fractions de saccharose et de la précipitation du PEG

  1. Après la centrifugation, retirez les gradients du rotor et prenez des photos des tubes à l’aide d’un appareil photo numérique ou d’un téléphone portable. Isolez les fractions en perçant les tubes au fond avec une aiguille, puis en égouttant lentement le contenu. Collectez les différentes fractions contenant de la chlorophylle dans des tubes à centrifuger.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être aliquotes et congelés pour une analyse ultérieure si vous le souhaitez.
  2. Pour certaines applications, l’élimination du saccharose est souhaitable. Pour éliminer le saccharose, utilisez une deuxième étape de précipitation PEG (ou filtration sur gel). Ajuster la concentration de NaCl dans la fraction PSI-LHCI à 120 mM et ajouter PEG6000 à une concentration finale de 10 %.
  3. Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de paillasse à 18 407 x g à 4 °C pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille verte dans 30 mM de Tricine-NaOH pH 8,0, 50 mM de NaCl et 0,05 % de β-DDM.
  4. Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de paillasse à 18 407 x g à 4 °C pendant 5 min pour s’assurer que tout le matériau reste en solution.

7. Mesure de la teneur en P700 du PSI

REMARQUE : Cette méthode peut être utilisée pour doser rapidement le PSI.

  1. Diluer les échantillons à une DO680 de 1-1,5 et incuber dans l’obscurité avec 10 mM d’acide ascorbique pendant 1 h pour réduire complètement le P700.
  2. Mesurez le spectre d’absorption de l’échantillon à l’aide d’un spectromètre UV-Vis. Mesurez l’absorbance de seulement 650 nm à 750 nm avec un intervalle de données de 0,50 nm et une vitesse de balayage de 60 nm/min pour le dosage du contenu P700.
  3. Exposez l’échantillon à une lumière vive (350 μmols photons/m2/s) et mesurez à nouveau le spectre pendant l’exposition.
  4. Soustrayez le spectre sombre du spectre lumineux pour observer le blanchiment de P700 à environ 702 nm chez les plantes.
  5. Déterminer la teneur en P700 en utilisant l’absorption à 700 nm et un coefficient d’extinction de 64/mM/cm, comme décrit dans Hiyama et Ke 32,33,34.
  6. Mesurer la quantité totale de chlorophylle (chlorophylle A et chlorophylle B) à l’aide de la méthode décrite dans Porra et al.31. Utilisez ces concentrations pour déterminer le rapport chlorophylle/P700.

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Résultats

Ce protocole est utilisé pour isoler et caractériser le PSI-LHCI actif dans les tissus végétaux pendant trois jours. Le PSI-LHCI est purifié en isolant d’abord les membranes des thylakoïdes des plantes, qui sont ensuite solubilisées avec du β-DDM. Les rendements typiques de l’étape de préparation membranaire sont de 200 mg de chlorophylle à partir de 500 g de feuilles. Cela peut varier en fonction du matériau initial utilisé.

Les deuxième et troisième jours de l’expérience utilisent la chromat...

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Discussion

Grâce à ce protocole, le complexe PSI-LHCI des tissus végétaux peut être purifié à l’état actif. Les feuilles d’épinards ont été utilisées ici, mais ces méthodes peuvent être appliquées à des préparations à partir de diverses plantes23,40. Dans tous les cas, des précautions doivent être prises lors de l’exécution de ce protocole pour protéger le complexe des dommages. Cette préparation doit être effectuée dans l’obscurité ou sous...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Y.M. remercie la National Science Foundation pour leur soutien dans le cadre du prix n° 2034021 et du département de l’Énergie des États-Unis, le Bureau des sciences, le Bureau des sciences énergétiques fondamentales, la Division des sciences chimiques, des géosciences et des biosciences dans le cadre du prix n° 100. DE-SC0022956. C.G. est soutenu par la National Science Foundation dans le cadre du prix n° 00036806.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube Falcon de 15 mlVWR62406-200Utilisé pour le stockage des thylakoïdes
Bio rad Econo-Column 1,5 X 30 cmbiorad7374153
Étamine grade 50, 100 % cotonArkwright LLCB07D1FZZMBFrom Amazon Tiges de
verreMillipore SigmaBR135825Toute tige similaire suffira
Mélangeurvitamix à profil bas de 64 ozVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Tubes de centrifugation polyallomères à couvercle ouvertSeton Scientific5030
Optima XE Ultracentrifugebeckman socA94471
Polyéthylène glycol 6 000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Broyeur de tissus, 30 ml.WHEATON358049
SucroseSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman soc331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
&beta ;-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002Stocké en stock à -20 ° ; L

Références

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Purification du PSI LHCImembranes thylako des v g talesisolation des chloroplastesgradient de saccharosechange d anionscomplexe prot ique membranairetransport d lectronscomplexes de chlorophylle
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