Développement d’un traceur PET de peptide D marqué au gallium 68pour l’imagerie de l’expression programmée du ligand 1 de la mort

Summary

Cette étude a développé une méthode non invasive et en temps réel pour évaluer la distribution du ligand de mort programmée 1 dans l’ensemble du corps, basée sur l’imagerie tomographique par émission de positons de l’antagoniste du D-dodécapeptide [⁶⁸Ga]. Cette technique présente des avantages par rapport à l’immunohistochimie conventionnelle et améliore l’efficacité de l’identification des patients appropriés qui bénéficieront d’un traitement par blocage des points de contrôle immunitaires.

Abstract

Le développement d’une thérapie par blocage des points de contrôle immunitaires basée sur la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) et le ligand de mort programmée 1 (-L1) a révolutionné les thérapies contre le cancer au cours des dernières années. Cependant, seule une fraction des patients répond aux inhibiteurs de-1/-L1, en raison de l’expression hétérogène de-L1 dans les cellules tumorales. Cette hétérogénéité présente un défi dans la détection précise des cellules tumorales par l’approche couramment utilisée par l’immunohistochimie (IHC). Cette situation nécessite de meilleures méthodes pour stratifier les patients qui bénéficieront d’un traitement par blocage des points de contrôle immunitaires, afin d’améliorer l’efficacité du traitement. La tomographie par émission de positons (TEP) permet de visualiser en temps réel l’expression de-L1 dans l’ensemble du corps de manière non invasive. Par conséquent, il est nécessaire de développer des traceurs radiomarqués pour détecter la distribution de-L1 dans les tumeurs grâce à l’imagerie TEP.

Par rapport à leurs homologues L, les peptides dextrorotiques (D) ont des propriétés telles que la résistance protéolytique et des demi-vies métaboliques remarquablement prolongées. Cette étude a conçu une nouvelle méthode pour détecter l’expression de-L1 basée sur l’imagerie TEP de ⁶⁸peptides D ciblés par-L1 marqués au Ga, un antagoniste du D-dodécapeptide (DPA), chez des souris porteuses de tumeurs. Les résultats ont montré que le [⁶⁸Ga]DPA peut se lier spécifiquement aux tumeurs surexprimant-L1 in vivo, et ont montré une stabilité favorable ainsi qu’une excellente capacité d’imagerie, ce qui suggère que le [⁶⁸Ga]DPA-PET est une approche prometteuse pour l’évaluation du statut-L1 dans les tumeurs.

Introduction

La découverte des protéines de point de contrôle immunitaire a été une percée dans le traitement des tumeurs et a conduit à des avancées majeures dans le développement de la thérapie de blocage des points de contrôle immunitaires¹. La protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) et le ligand de mort programmée 1 (-L1) sont des cibles médicamenteuses potentielles avec plusieurs anticorps approuvés par la Food and Drug Administration (FDA). -1 est exprimé par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs, telles que les lymphocytes T CD4⁺, CD8⁺ et les lymphocytes T régulateurs. -L1 est l’un des ligands-1, qui est surexpr....

Protocol

Les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine de Nanjing ou par les Instituts nationaux des sciences et technologies quantiques. Les expériences sur les souris ont été strictement réalisées dans le strict respect des directives institutionnelles du Comité pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Synthèse peptidique

1. Gonfler 100 mg de résine de 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA) (capacité de charge de 0,37 mmol/g) dans 1 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) pendant 30 min sous un léger bouillonnement de N₂.

Results

[⁶⁸Ga]Radiomarquage et stabilité de l’APD
Le peptide modèle, le DPA, est un antagoniste efficace de-L1. DOTA-DPA a été obtenu avec une pureté de >95% et un rendement de 68%. La masse de DOTA-DPA est observée expérimentalement à 1 073,3 ([M+2H]²⁺). ⁶⁸ ansLe gallium est considéré comme un radionucléide approprié pour marquer les peptides pour l’imagerie TEP, et a donc été choisi pour cette étude. Pour radiomarquer le DPA avec ^68<.......

Discussion

Les étapes critiques décrites dans cette méthode comprennent le marquage efficace de ⁶⁸Ga en DPA et le choix d’une fenêtre de temps appropriée pour l’imagerie TEP, qui doit correspondre parfaitement au schéma pharmacodynamique de DPA dans la tumeur.

Contrairement à l’IHC, l’imagerie TEP permet de détecter en temps réel l’expression de-L1 dans l’ensemble du corps de manière non invasive, ce qui permet de visualiser chaque zone positive d’une tumeur hétérogène .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA)	Merck	60239-18-1	68Ga  ; Kit de chélation
3,3-diaminobenzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D7304-1SET	Immunohistochimie
anticorps monoclonal anti--L1	Wuhan Proteintech	17952-1-ap	Immunohistochimie : anticorps primaire
BMS202	Selleck	1675203-84-5	Dosage de liaison compétitive : inhibiteur
BSA Merck		V900933	Immunofluorescent : bloquant  ;
DAPI	Merck	D9542	Immunofluorescent : coloration du noyau
Dichlorométhane (DCM)	Merck	34856	Solvant
DIPEA	Merck	3439	Couplage peptidique
EDC· ; HCl	Merck	E6383	Activation de DOTA
FBS	Gibco	10099	Culture cellulaire : supplément
FITC-conjugué anti-human IgG Fc Antibody	Biolegend	409310	Immunofluorescent : anticorps secondaire
FITC-conjugué anti-L1	anticorps Biolegend	393606	Cytométrie en flux : anticorps direct
HCTU	Energy Chemical	E070004-25g	Couplage peptidique
HRP résistant anti-lapin de chèvre	Servicebio	GB23303	Immunohistochimie : anticorps secondaire
Hydroxysuccinimide (NHS)	Merck	130672	Activation de DOTA
MeCN	Merck		PHR1551 Solvant
Morpholine	Merck	8.06127	Fmoc- deprotection
NMP	Merck	8.06072	Solevent
Paraformaldéhyde	Merck	30525-89-4	Fixation des tissus
PBS	Gibco	10010023	Culture cellulaire : tampon
Pénicilline-streptomycine  ;	Gibco	10378016	Culture cellulaire : complément
tube RIA	PolyLab	P10301A	Comme récipient d’échantillon de tissu
RPMI-1640 milieu	Gibco	11875093	Culture cellulaire : milieu basique
Acétate de sodium	Merck	1.06264	Sel pour tampon
Trypsine-EDTA	Gibco	25200056	Culture cellulaire : agent de dissociation
U87MG lignée cellulaire	Procell Life Science & Technology Co	CL-0238	Cell model
Equipment
68Ge/68Ga	generator Isotope Technologies Munich, ITM	Sans objet	Génération de [68Ga]
Compteur Autogamma	Perkin Elmer  ;	Wizard2	Détection de la radioactivité
Microscopie confocale à fluorescence	Keyence		Observation des résultats d’immunofluorescence
Cytomètre en flux	Becton Dickinson, BD	LSRII	Surveillance des cellules positives-L1
Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)	SHIMAZU	LC-20AT  ;	Purification du peptide DPA
Scanner TEP	Siemens Medical Solutions	Inveon MultiModality System	Imagerie TEP
Microscopie optique	Nikon ;	Eclipse E100	Observation des résultats d’immunohistochimie
Synthétiseur peptidique en phase solide	Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold	LOT#11101	Synthèse de DPA-DOTA peptide
Software
ASIPro	Siemens Medical Solutions	Non applicable	Analyse des résultats PET-CT
FlowJo	Becton Dickinson, BD	FlowJo 7.6.1	Analyse des résultats du cytomètre en flux
Inveon Acquisition Workplace (IAW)	Siemens Medical Solutions	Sans objet	Gestion de la machine TEP
Prism	Graphpad	Prism 8.0	Analyse des données  ;