Utilisation de réactifs de référence pour confirmer la robustesse des tests de libération de cytokines pour la prédiction de l’innocuité des anticorps monoclonaux

Résumé

L’utilisation de réactifs de référence pour les tests de libération de cytokines permet d’obtenir des profils d’innocuité in vitro plus reproductibles et standardisés des anticorps monoclonaux immunothérapeutiques. Nous décrivons ici comment les tests de libération de cytokines peuvent être utilisés avec un panel de réactifs de référence pour prédire l’innocuité de certains anticorps monoclonaux thérapeutiques.

Résumé

Les nouveaux médicaments à base d’anticorps immunostimulants conçus pour stimuler directement des cellules immunitaires spécifiques ou améliorer indirectement la réponse immunitaire en bloquant ou en activant un régulateur endogène du système immunitaire ont le potentiel de provoquer des effets indésirables graves liés au système immunitaire, tels que le syndrome de libération de cytokines (SRC). Il est donc crucial d’évaluer le profil d’innocuité de ces médicaments à l’aide d’une combinaison d’expériences in vivo et in vitro avant la première administration chez l’homme. Les tests de libération de cytokines (CRA), où le traitement à base d’anticorps proposé est co-cultivé avec des cellules immunitaires humaines (telles que les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), le sang total ou autre) et où la quantité de cytokines inflammatoires produite est mesurée, sont essentiels pour l’identification des dangers. Cependant, différents laboratoires utilisant des anticorps de contrôle différents peuvent menacer l’harmonisation des ARC, et les contrôles cliniquement pertinents (tels que les TGN1412) peuvent être difficiles à trouver, ce qui peut conduire à des résultats moins précis ou fiables ou à des données difficiles à comparer entre les laboratoires. L’inclusion de contrôles positifs et négatifs dans une ARC peut garantir l’exactitude et la fiabilité des résultats. Le National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) a produit un panel de contrôles d’anticorps lyophilisés destinés à être utilisés dans diverses plateformes de l’ARC afin d’harmoniser les résultats entre divers laboratoires et méthodes d’essai. Un ensemble de trois anticorps de contrôle positif différents comprend l’anti-CD52, l’anti-CD3 et le superagoniste (SA) anti-CD28, qui sont connus pour induire un CRS dose-dépendant chez les patients. Chaque anticorps est doté d’un anticorps de contrôle négatif isotype apparié. Il a déjà été démontré que ce panel de réactifs de référence présente une bonne reproductibilité entre les laboratoires et constitue des contrôles appropriés pour augmenter la confiance et la robustesse des données de sécurité provenant de diverses plateformes CRA.

Introduction

La libération induite de cytokines peut être un effet anticipé et souhaité de certains anticorps monoclonaux immunomodulateurs (mAbs). Cependant, la libération inattendue de cytokines pro-inflammatoires peut entraîner un syndrome de libération de cytokines (SRC) chez les patients caractérisé par de la fièvre, de la fatigue et même une défaillance de plusieurs organes¹. Il est donc crucial que les nouveaux anticorps monoclonaux immunostimulants soient testés in vitro pour déterminer leur potentiel à provoquer un SRC en mesurant la libération de cytokines dans un test de libération de cytokines (CRA).

TGN1412 s’agit d’un anticorps monoclonal qui a été développé comme traitement potentiel de la leucémie lymphoïde chronique à cellules B en agissant comme un superagoniste CD28 (CD28SA), capable d’activer les lymphocytes T en réticulant le récepteur co-stimulateur CD28². En 2006, six volontaires en bonne santé à qui l’on a administré de l’TGN1412 dans un essai clinique ont présenté des effets secondaires graves, y compris le SRC, dans les heures qui ont suivi l’administration du médicament¹. Cela a conduit à l’arrêt de l’essai et à TGN1412 retrait du développement. D’autres anticorps connus pour provoquer un effet secondaire du SRC comprennent l’anticorps anti-CD52, Campath-1H³, et l’anticorps monoclonal anti-CD3, Muromonab (OKT3)⁴. Compte tenu de leur capacité à induire un CRS dose-dépendant chez les patients, TGN1412, OKT3 et Campath-1H sont des anticorps de contrôle positif appropriés pour générer des résultats robustes et fiables à partir d’un CRA. Pourtant, ces anticorps de contrôle n’étaient pas facilement disponibles auparavant en raison de leur coût élevé ou de leur disponibilité limitée.

Cependant, un panel de référence lyophilisé remanufacturé de ces trois anticorps ^5,6,7 ainsi que des contrôles négatifs isotypiques appariés a récemment été mis à disposition par le National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Il a déjà été démontré que ce panel de réactifs de référence présente une bonne reproductibilité^{interlaboratoire8} et constitue donc un contrôle approprié pour accroître la confiance et la robustesse des données de sécurité provenant de diverses plateformes CRA. Ainsi, la raison d’être de l’utilisation de ce protocole avec ces réactifs est d’améliorer l’harmonisation des ARC, avec l’avantage que ces réactifs ont été validés dans une étude collaborative internationale⁸.

Nous décrivons ici la meilleure façon d’utiliser ce panel de réactifs de référence dans une CRA PBMC en phase solide (SP) et une CRA en phase aqueuse (AQ) dans le sang total (WB) pour prédire la CRS induite par des anticorps. Ces deux formats d’ARC sont complémentaires en raison du mode de présentation des anticorps (indirect pour la phase solide versus direct pour la phase aqueuse) et du fait qu’ils ciblent différents groupes de cellules répondeuses. Le même protocole peut être adapté pour une utilisation avec du sang total dilué (dWB) ou avec des co-cultures endothéliales : PBMC.

Protocole

Le protocole suivant suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche du NIBSC. Conformément aux règlements et aux lignes directrices applicables, obtenir le consentement éclairé écrit d’un donneur sain ou de patients. Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes de préparation du protocole dans un capot de culture cellulaire à flux laminaire. Voir la table des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et équipements.

1. Préparation de plaques revêtues avec mAb pour le dosage en phase solide (SP)

1. Reconstituer le contenu des ampoules de réactif de référence avec 1 mL d’eau distillée stérile. Attendez 5 à 10 minutes pour la réhydratation avant de mélanger la solution d’anticorps et de la transférer dans un tube stérile bouché.
2. Après reconstitution dans 1 mL d’eau, la concentration stocke des anticorps recombinants suivants sera de 200 μg/mL : anti-CD3 (15/162), anti-CD52 (15/178), contrôle de l’isotype IgG1K (15/198) pour l’anti-CD52, contrôle de l’isotype IgG2a (15/218) pour l’anti CD3, contrôle de l’isotype IgG4 (15/232) pour l’anti-CD28SA.
3. Après reconstitution dans 1 mL d’eau, la concentration de stock d’anti-CD28SA (15/144) sera de 100 μg/mL. Pour un stockage à court terme jusqu’à 7 jours, transférez le matériel reconstitué dans un tube stérile bouché à 4 °C.
4. Diluer les anticorps reconstitués et tester les anticorps à 10 μg/mL dans du PBS stérile et enrober les puits d’une plaque de microtitration stérile en polypropylène à fond en U non traitée par TC à 96 puits avec 100 μL de solution d’anticorps diluée (1 μg/puits) et incuber toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser des plaques de polypropylène pour l’adsorption des protéines, car celles-ci ont été utilisées lors de la validation des réactifs standard⁹.

2. Préparation des PBMC

1. Prélever un minimum de 30 ml de sang total périphérique (WB) dans des tubes héparinisés/contenant de l’héparine et retourner plusieurs fois pour s’assurer d’un bon mélange avec l’héparine sodique.
2. Transvaser 15 mL de WB dans un tube séparé pour être utilisé plus tard dans la préparation du dosage du sang total en phase aqueuse (étape 3.1)
3. Diluez les 15 ml restants de sang dans un rapport de volume de 1:1 avec du PBS ou un milieu RPMI-1640 sans sérum et superposez doucement le sang dilué sur 15 ml de milieu à gradient de densité (p. ex., lymphoprep, Ficoll-Hypaque) dans un tube de 50 ml.
4. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 20 min à température ambiante dans un rotor pivotant sans frein et avec une accélération réduite pour séparer le sang en ses différents composants.
5. Après centrifugation, le gradient de densité se séparera sous la forme d’une couche supérieure de plasma suivie d’une fine couche de couche leucocytaire contenant des PBMC et d’une couche inférieure contenant des globules rouges (GR) et des granulocytes polymorphonucléaires, y compris les neutrophiles et les éosinophiles. Récoltez soigneusement les PBMC en insérant une pipette directement à travers la couche supérieure de plasma jusqu’aux PBMC. Vous pouvez également retirer la couche supérieure avant de prélever les cellules.
6. Remettre doucement la couche leucocytaire en suspension dans 10 mL de PBS ou de milieu RPMI-1640 sans sérum. Centrifugez à nouveau le tube à 500 x g pendant 10 min pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et jetez-le.
7. Répétez l’étape de lavage 2.6. et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de RPMI avec 10 % de FCS (RPMI-1640 complet, cRPMI)
8. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre¹⁰.
9. Ajuster les PBMC à une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL dans le cRPMI.

3. Préparation du test de libération de cytokines dans le sang total (WB) en phase aqueuse (AQ)

1. Ajoutez 190 μL de WB dans les puits d’une plaque de polystyrène à fond en U de 96 puits. Si ce n’est pas déjà fait à 100 μg/mL, prédiluer tous les anticorps de traitement et les réactifs de référence à 100 μg/mL dans du PBS.
2. Ajoutez 10 μL d’anticorps dilués à 190 μL de WB pour obtenir une concentration finale d’anticorps de 5 μg/mL d’anticorps dans 95 % de WB.
3. Incuber la plaque pendant 48 h dans un incubateur humidifié à 37 °C.

4. Préparation du test de libération de cytokines PBMC en phase solide (SP)

1. À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez et jetez la solution d’anticorps des plaques revêtues (décrite à l’étape 1), remplissez un réservoir de réactif avec du PBS et lavez la plaque 3 fois avec 200 μL de PBS pour éliminer les anticorps monoclonaux non liés.
2. Ajouter 200 μL de suspension cellulaire de l’étape 2.8 dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 48 h dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % CO₂.

5. Collecte de surnageant ou de plasma

1. Après une incubation de 48 h avec des anticorps de contrôle et d’essai, centrifuger les plaques à 400 x g pendant 5 min et recueillir le milieu conditionné à la cellule ou le plasma, en prenant soin de ne pas perturber la pastille cellulaire. Congelez le surnageant ou le plasma recueilli à -20 °C.
   REMARQUE : Assurez-vous de ne pas déranger la pastille de globule rouge lors de la collecte du plasma.

6. Quantification des cytokines dans le surnageant ou le plasma

1. À l’aide du surnageant ou du plasma recueilli, effectuer une analyse des cytokines des concentrations d’IFN-γ, d’IL-2, de TNF-α et d’IL-6 en utilisant l’option multiplex privilégiée. Un exemple de méthode d’analyse multiplexe des cytokines à l’aide d’un test de billes cytométriques a déjà été publié¹¹.
   REMARQUE : Veuillez vous référer à la table des matériaux pour le kit multiplex qui a été utilisé dans la génération des résultats représentatifs.

Résultats

Les résultats de l’essai SP devraient démontrer une libération d’IL-2, d’IFN-γ, d’IL-6 et de TNF-α¹² dans la gamme pg/mL de tous les anticorps témoins positifs à 48 h et devraient être statistiquement significativement plus importantes que celles des témoins isotypes appariés. Nos résultats représentatifs démontrent que les anticorps de contrôle positif, αCD28, αCD3 et αCD28SA, induisent des niveaux significativement élevés d’IFN-γ, d’IL-6 et de TNF-α par rapport aux contrôles d’isotypes appariés, lorsqu’ils sont analysés dans le test PBMC SP (Figure 1). Ce test est également caractérisé par un changement élevé de la libération d’IL-2 lors de la stimulation avec αCD28SA par rapport à son isotype apparié (859,0). Alors que αCD3 et αCD52, tout en induisant l’expression de l’IL-2, entraînent des changements de pliage plus faibles que αCD28SA (6,2 et 3,3 pour αCD3 et αCD52, respectivement, figure 2).

Dans le test WB AQ (Figure 3), le niveau de cytokines détectables est nettement inférieur à celui du test PBMC SP, mais est caractérisé par une plus grande sensibilité à la stimulation par l’anticorps αCD52 (Figure 2 et Figure 3) avec des changements moyens de pliage de l’IL-2, de l’IFN-γ et de l’IL-6 supérieurs à 100.

Anticorps d’essai pour lequel on pourrait s’attendre à ce qu’une première dose future chez l’homme n’entraîne pas d’augmentation significative imprévue de la libération de cytokines par rapport aux témoins d’isotypes pertinents. Cependant, plutôt que d’arrêter le développement d’un nouvel anticorps monoplasmique thérapeutique, un résultat positif dans une ARC devrait être considéré comme faisant partie de la gestion des risques et des avantages¹³. Lors de l’élaboration d’une nouvelle plateforme ARC, le test doit être répété en utilisant un ensemble différent de donateurs pour assurer la reproductibilité de la plateforme. Il faut également tenir compte de la variabilité de la réponse entre les donateurs¹⁴, c’est pourquoi une expérience bien alimentée est recommandée¹⁵. Afin de comprendre l’étendue des réponses et d’obtenir une représentation complète de la variabilité qui pourrait être observée dans les réponses des donneurs, le test devrait idéalement être effectué avec plusieurs donneurs individuels en plus de tester le thérapeutique dans des expériences répétées.

Figure 1 : Libération de cytokines à partir de l’expérience PBMC-SP. Résultats représentatifs de la libération d’IFN-γ, d’IL-2, d’IL-6 et de TNF-α obtenus à partir de tests de libération de cytokines PBMC-SP (3 expériences indépendantes contenant chacune 5 à 8 donneurs par expérience ; n = 8, n = 10, n = 5 [de haut en bas]) après 48 h lors de l’utilisation d’anticorps réactifs de référence. Abréviations : PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique ; SP = phase solide ; IFN-γ = interféron-gamma ; IL-2 = interleukine 2 ; IL-6 = interleukine 6 ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Augmentation du changement de pli des cytokines à partir des expériences PBMC-SP et WB-AQ. Changement de pli de l’IFN-γ, de l’IL-2, de l’IL-6 et du TNF-α libération de réactifs de référence d’anticorps inducteurs de CRS par rapport à leurs isotypes témoins appariés, obtenus à partir d’essais de libération de cytokines PBMC-SP et WB-AQ après 48 h. Abréviations : PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique ; SP = phase solide ; WB = sang total ; AQ = aqueux (phase) ; IFN-γ = interféron-gamma ; IL-2 = interleukine 2 ; IL-6 = interleukine 6 ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha ; CRS = syndrome de libération de cytokines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Libération de cytokines à partir de l’expérience WB-AQ. Résultats représentatifs de la libération d’IFN-γ, d’IL-2, d’IL-6 et de TNF-α obtenus à partir d’essais de libération de cytokines WB-AQ (3 expériences indépendantes contenant chacune 5 à 8 donneurs par expérience ; n = 8, n = 10, n = 5 [de haut en bas]) après 48 h lors de l’utilisation d’anticorps réactifs de référence. Abréviations : WB = sang total ; AQ = aqueux (phase) ; IFN-γ = interféron-gamma ; IL-2 = interleukine 2 ; IL-6 = interleukine 6 ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale alpha. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

On décrit ici des méthodes de mesure de la libération de cytokines à partir de PBMC et de WB après stimulation médiée par des anticorps à partir d’une plaque recouverte d’anticorps ou avec des anticorps en solution, à l’aide d’un panel de réactifs de référence pour les contrôles positifs et négatifs. Chacun de ces tests a ses propres forces et faiblesses. Les dosages PBMC et WB sont complémentaires puisque la proportion de diverses cellules immunitaires telles que les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes est différente dans les deux matrices expérimentales utilisées pour les ARC. Il est intéressant d’observer que, bien qu’un test WB puisse mieux représenter la condition in vivo par opposition à la monoculture PBMC, la première plateforme est moins prédictive du risque de CRS médié par les lymphocytes T à partir de TGN1412 et OKT3¹⁵ ; résultat de la glycophorine A sur les globules rouges inhibant l’expansion des lymphocytes T médiée par l’IL-2¹⁶. Néanmoins, la prédiction du risque de CRS à partir de l’anti-CD52 reste intacte dans la WB CRA, en raison de la présence de neutrophiles (perdus lors des méthodes conventionnelles de gradient de densité décrites à l’étape 2, utilisées pour l’isolement PBMC).

Le format de l’ARC (présentation SP ou AQ) est essentiel pour la détection d’un mécanisme spécifique de CRS. Par exemple, la présentation en phase aqueuse de l’AcM aux lymphocytes humains^17,18, utilisée lors des tests d’innocuité précliniques in vitro de TGN1412 n’a pas permis d’identifier le risque de SRC probablement dû à l’absence de regroupement et d’engagement localisés des récepteurs cellulaires¹⁹ et à l’activation conséquente des lymphocytes T médiée par l’anticorps en phase aqueuse. En fait, le SRC médié par TGN1412 n’a pu être détecté avec précision qu’au format SP qui réplique artificiellement la réticulation du récepteur Fc-gamma (FcγR), comme présenté ici, ou par amorçage dépendant du contact dans la préculture PBMC à haute densité et interaction Fc avec les cellules immunitaires CD32+ (telles que les cellules B²⁰ et les monocytes²¹).

En plus de ces plateformes, il existe d’autres façons d’effectuer l’ARC avec des systèmes de co-culture plus complexes. Un exemple d’ARC alternative à celles décrites dans ces méthodes consiste à co-cultiver des PBMC avec des cellules endothéliales de croissance sanguine autologues (BOEC)^22. Ce test a été décrit en 2015 comme une amélioration par rapport au test HUVEC :PBMC alors conventionnel chez les donneurs mixtes en supprimant le mésappariement tissulaire confondant. Il démontre une meilleure sensibilité au CRS anti-CD28SA que le test WB, et surmonte également la limitation du test PBMC en monoculture en imitant la combinaison de cellules endothéliales et de leucocytes présents in vivo, mais au prix d’étapes procédurales plus longues nécessitant des techniques de culture cellulaire spécialisées²².

De plus, bien que ce protocole se concentre spécifiquement sur la libération d’IFN-γ, d’IL-2, d’IL-6 et de TNF-α, des collègues de la MHRA ont déjà examiné l’IL-12 et d’autres dans ce contexte²³. La production d’IL-12 est augmentée par ces anticorps anti-CRS de contrôle positif, bien qu’elle ne soit pas particulièrement sensible, et donc peut-être pas un grand prédicteur de CRS dans cette modalité. Certaines cytokines, comme l’IL-15 entre autres, n’ont jamais été testées bien que les 4 cytokines évaluées dans notre protocole fournissent une bonne indication du risque potentiel de SRC. Bien sûr, en fonction de la modalité et des anticorps testés, d’autres cytokines pourraient être évaluées.

Combinées, ces observations soulignent l’importance de noter que, bien que l’utilisation de réactifs de référence puisse aider à identifier le risque de nouveaux anticorps CRS, il faut veiller à éviter une plateforme CRA sous-optimale qui pourrait ne pas identifier le potentiel CRS. De manière cruciale, le mécanisme d’action prédit d’un produit thérapeutique, que ce soit via sa région Fc ou son action hypothétique sur les cellules exprimant l’antigène, doit correspondre à la biologie du test. Par conséquent, bien que les différences dans le mécanisme d’action des réactifs thérapeutiques et de référence d’essai discutées dans cet article puissent constituer une limitation potentielle de telle sorte qu’une CRA pertinente pour l’anticorps d’essai puisse être incompatible avec la biologie des réactifs de référence, l’essai fournit une plate-forme robuste et fiable pour l’identification des dangers. Les résultats de plusieurs formats d’ARC couvrant divers mécanismes d’action et sous-ensembles de cellules immunitaires peuvent toutefois être nécessaires pour une confiance optimale dans les données d’évaluation de l’innocuité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,5 ml  ; Tubes de microcentrifugation, naturels (stériles)	Starlab	S1615-5510
Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé à la chaleur	ThermoFisher	10500064
Tubes héparinés	ThermoFisher	12967676
Heracell 150i Incubateur CO2	ThermoFisher	16406639
MESO QuickPlex SQ 120 Panneau pro-inflammatoire humain 1 kit V-PLEX  ;	Meso Scale Discovery	K15049
MESO QuickPlex SQ 120MM	Meso Scale Discovery	AI1AA-0
Neubauer Chambre de comptage d’hémocytomètre amélioré	Hawksley	AS1000
Panel de contrôles d’anticorps recombinants lyophilisés pour les tests de libération de cytokines	NISBC	19/156
PBS	ThermoFisher	10010023
Plaque de microtitration en polypropylène à 96 puits  ;	Corning	3879
Plaque de microtitration en polystyrène à 96 puits	Corning	3799
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093
Centrifugeuse Sorvall ST 40	ThermoFisher	75004525
Eau stérile	ThermoFisher	15230162