Élucider le métabolisme du 2,4-dibromophénol chez les plantes

Un nombre croissant de polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques ^1,2, et le sol est considéré comme un puits important pour ces contaminants ^3,4. Les contaminants présents dans le sol peuvent être absorbés par les plantes et potentiellement transférés à des organismes de niveau trophique supérieur le long des chaînes alimentaires, en pénétrant directement dans le corps humain par la consommation des cultures, ce qui entraîne une exposition involontaire ^5,6. Les plantes utilisent différentes voies pour métaboliser les xénobiotiques à des fins de détoxification⁷ ; Il est important d’élucider le métabolisme des xénobiotiques, car ils contrôlent le devenir réel des contaminants dans les plantes. Comme les métabolites peuvent être excrétés par les feuilles (dans l’atmosphère) ou les racines, la détermination des métabolites dans les toutes premières phases de l’exposition offre donc la possibilité de tester un nombre étendu de métabolites⁸. Cependant, les études utilisant des plantes intactes nécessitent des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs.

Les cultures de callosités végétales sont donc une bonne alternative pour étudier le métabolisme des xénobiotiques in planta, car elles peuvent réduire considérablement le temps de traitement. Ces cultures excluent les interférences microbiennes et la dégradation photochimique, simplifient l’effet matriciel des plantes intactes, standardisent les conditions de culture et nécessitent moins d’efforts expérimentaux. Les cultures de callosités végétales ont été appliquées avec succès comme approche alternative dans les études métaboliques du triclosan⁹, du nonylphénol¹⁰ et du tébuconazole⁸. Ces études ont montré que les schémas métaboliques dans les cultures de callosités étaient similaires à ceux des plantes intactes. Cette étude propose une méthode d’identification efficace et précise des métabolites des xénobiotiques chez les plantes sans protocoles complexes et chronophages. Ici, nous utilisons des cultures de callosités végétales en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution pour l’analyse des métabolites avec des signaux de faible intensité^11,12.

À cette fin, des suspensions de callosités de carotte (Daucus carota var. sativus) ont été exposées à 100 μg/L de 2,4-dibromophénol pendant 120 h dans un agitateur à 130 tr/min et à 26 °C. Le 2,4-dibromophénol a été choisi en raison de son activité endocrinienne perturbatrice¹³ et de sa présence répandue dans le sol¹⁴. Les métabolites ont été extraits et analysés par spectrométrie de masse à haute résolution. Le protocole proposé ici permet d’étudier le métabolisme in planta d’autres types de composés organiques qui peuvent être ionisés.

1. Différenciation des callosités de la carotte

REMARQUE : Autoclaver tous les équipements utilisés ici et effectuer toutes les opérations dans un établi ultra-propre stérilisé aux UV.

1. Vernaliser les graines en immergeant les graines de carotte uniformes (Daucus carota var. sativus) dans de l’eau déminéralisée à 4 °C pendant 16 h.
2. Stérilisez les graines vernalisées en surface avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes, puis rincez-les trois fois avec de l’eau déminéralisée stérile dans des conditions aseptiques.
3. Stérilisez ensuite les graines avec 20 % de H2 O₂ pendant 20 min et lavez-les six fois avec de l’eau déminéralisée stérilisée dans des conditions aseptiques.
4. Faire germer les graines de manière aseptique en les semant sur un milieu MS sans hormones (pH 5,8, autoclavé à 121 °C pendant 20 min) contenant 1% d’agar-gel, et en incubant à 26 °C avec une photopériode de 16 h (350 μmol/m²s) pendant 15 jours.
5. Obtenir les explants en coupant l’hypocotyle et le cotylédon des plantules en petits morceaux (0,5 cm).
6. Transformer les explants en boîtes de Pétri (deux à quatre explants par boîte) contenant 15 à 20 mL de milieu MS aseptique complété par de l’auximone (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique ; 1 mg/L) et de la phytokinine (6-benzylaminopurine ; 0,5 mg/L) dans des conditions aseptiques.
7. Incuber les explants dans l’obscurité à 26 °C pendant 3-4 semaines pour induire le durillon.
8. Séparez les tissus calleux (environ 1 cm de diamètre) formés à partir des explants initiaux à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince.
   REMARQUE : Les tissus calleux nouvellement formés sont de couleur blanche à jaune crème et s’attachent lâchement aux explants initiaux.

2. Traitement au 2,4-dibromophénol

1. Dissoudre 1 μg de 2,4-dibromophénol dans 10 mL de milieu MS liquide aseptique (la concentration finale de 2,4-dibromophénol est de 100 ppb, pH 5,6-7,0).
2. Ajouter 3 g de callosité de carotte fraîche (étape 1.8) dans des flacons en verre contenant la solution de 2,4-dibromophénol préparée (à partir de l’étape 2.1) dans des conditions aseptiques. Considérez cela comme le traitement au 2,4-dibromophénol.
   REMARQUE : Les flacons en verre ont été autoclavés et scellés à l’aide d’un film de paraffine.
3. Inclure un milieu témoin contenant uniquement la solution de 2,4-dibromophénol (préparée à l’étape 2.1) pour évaluer la dégradation abiotique du 2,4-dibromophénol.
4. Inclure un témoin vierge contenant uniquement le cal de la carotte (pas de solution de 2,4-dibromophénol) pour vérifier toute contamination potentielle.
   1. Préparer le témoin à blanc contenant la carotte en ajoutant 3 g de callosités de carottes fraîches récoltées seulement dans 10 mL de milieu MS stérile.
5. Incuber le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins à milieu et à blanc à 130 tr/min et 26 °C dans l’obscurité dans un incubateur pendant 120 h.
6. Retirer les flacons en verre de l’incubateur pour prélever les échantillons du traitement au 2,4-dibromophénol et des contrôles après 120 h d’incubation.
   REMARQUE : Tous les échantillons ont été préparés en trois exemplaires.

3. Préparation de l’échantillon

1. Séparez soigneusement le cal du milieu MS par filtration avec des filtres en fibre de verre (0,45 μm) pour le traitement au 2,4-dibromophénol et les témoins. Récupérez les callosités après les avoir lavées trois fois avec de l’eau ultra-pure.
2. Lyophiliser le cal collecté avec de l’azote liquide, puis homogénéiser le cal collecté (0,2 g) avec un broyeur de tissus à haut débit à 70 Hz pendant 3 min.
3. Augmenter le cal homogénéisé en ajoutant 50 μL de substitut 4-n-NP-d₄ à 25 mg/L à l’aide d’une microseringue en verre, puis en faisant tourner le vortex pendant 1 min.
4. Ponifier les échantillons avec 5 mL de méthanol/eau (1 :1, v/v) dans un ultrasonicateur (150 W, 40 kHz) rempli d’eau glacée pendant 30 min, pour en extraire le 2,4-dibromophénol et les métabolites.
5. Centrifuger les suspensions à 8 000 x g à 4 °C pendant 10 min et recueillir les surnageants par pipetage.
   1. Répétez trois fois les processus d’extraction de l’échantillon de callosité et combinez les extraits.
6. Faire passer les extraits dans des cartouches d’extraction en phase solide équilibrée lipophile (HLB SPE) avec un débit de 1 mL/min.
   REMARQUE : Les cartouches HLB SPE ont été prétraitées séquentiellement avec 6 mL de méthanol et 6 mL d’eau pour éliminer toute interférence.
7. Éluer les analytes en faisant passer 6 mL de méthanol à travers les cartouches HLB SPE. Ensuite, concentrer les éluants obtenus à 1 mL sous un léger jet d’azote gazeux pour l’analyse instrumentale.
8. Injecter 10 μL d’éluants résultants dans l’UPLC-Q-TOF-MS pour l’analyse du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites¹⁵.
   1. Filtrer tous les échantillons à l’aide d’une membrane en nylon de 0,22 μm avant l’analyse instrumentale.

4. Analyse instrumentale

NOTE : Les analyses du 2,4-dibromophénol et de leurs métabolites ont été réalisées sur un chromatographe liquide à ultra-performance (UPLC) en combinaison avec un spectromètre de masse micrOTOF-QII équipé d’une ionisation par électropulvérisation (ESI), fonctionnant en mode d’ions positifs et négatifs.

1. Ouvrez la porte de la colonne chauffante et installez la colonne UPLC en connectant l’entrée de la colonne à la vanne d’injection et la sortie de la colonne à l’entrée du spectromètre de masse.
   NOTE : Une colonne C18 (50 mm x 2,1 mm ; granulométrie de 1,7 μm) a été utilisée pour la séparation des analytes à 40 °C.
2. Connectez la phase mobile A (eau ultra-pure) et la phase mobile B (méthanol de qualité chromatographique) à l’instrument en insérant l’extrémité des tubes de solvant A et B dans les bouteilles de solvant correspondantes, respectivement.
   1. Filtrer toutes les phases mobiles (500 ml pour chacune) à travers un filtre de 0,22 μm et soniser pendant plus de 30 min.
3. Dans la fenêtre du logiciel, cliquez sur Instrument | Méthode d’entrée pour modifier les conditions du chromatogramme en phase liquide.
   1. Régler les conditions de gradient de la phase mobile B comme suit : un débit de 1,0 mL/min ; 0 à 0,5 min, 5 % ; 0,5 à 3,5 min, 5 % à 50 % ; 3,5 à 6,5 min, 50 % à 100 % ; 6,5 à 7 min, 100 % ; 7 à 10 min, 100 % à 5 %.
   2. Réglez le débit d’injection des échantillons dans l’UPLC-Q-TOF-MS sur 0,2 mL/min.
      REMARQUE : L’injection de l’échantillon est programmée à l’aide d’un échantillonneur entièrement automatique.
4. Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Méthode MS puis paramétrez les paramètres de Q-TOF-MS : un débit de gaz desséchant (N₂) de 8 L/min, une température de 300-350 °C ; une tension capillaire de 4 500 V ; une énergie de collision de 5 à 45 V ; et une plage de balayage complète de 40 à 800 Da.
5. Placez les flacons d’échantillons aux emplacements correspondants des plateaux d’échantillons par numéro de série et réinsérez les plateaux d’échantillons dans la chambre d’échantillonnage.
   REMARQUE : Gardez les plateaux d’échantillons à plat et assurez-vous que la porte de la chambre d’échantillon est fermée.
6. Dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez Fichier | Nouveau pour créer une base de données. Nommez la base de données.
7. Chargez l’exemple de programme créé ci-dessus en sélectionnant Fichier MS | Fichier d’entrée | Injecter du volume.
8. Enregistrez la base de données dans le dossier d’exemple du projet en cliquant sur Fichier | Sauvegarder.
9. Sélectionnez Exécuter | Démarrez dans la fenêtre principale du logiciel, puis sélectionnez Acquérir des exemples de données et cliquez sur OK dans la fenêtre de la liste d’exemples de démarrage exécutée pour collecter les données.
   REMARQUE : Le chromatogramme en temps réel peut être visualisé en cliquant sur Chromatogramme | Mise à jour en temps réel pendant le processus d’acquisition des données.
10. Traitez les données dans le logiciel en sélectionnant la ligne de données cible et en cliquant sur la fenêtre Chromatogramme pour afficher le chromatogramme MS Scan.
11. Dans la fenêtre Chromatogramme , cliquez sur Affichage | TIC | ScanWaveDS | Ajouter une trace | OK pour obtenir les spectres de masse de balayage fille.
12. Identifier les métabolites en comparant les chromatogrammes du traitement au 2,4-dibromophénol et des témoins.
13. Élucider les métabolites candidats par le temps de rétention, la masse et les modèles de fragmentation^16,17.
    NOTA : L’erreur de précision de masse entre les valeurs expérimentales de m/z des ions parents des métabolites candidats et leur m/z théorique correspondante doit être inférieure à 10 ppm.

Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1. En suivant le protocole, nous avons comparé le chromatogramme de l’extrait de callosité de carotte du traitement au 2,4-dibromophénol aux témoins, et avons trouvé huit pics distincts qui sont présents dans le traitement au 2,4-dibromophénol mais absents chez les témoins (Figure 2). Cela indique qu’un total de huit métabolites du 2,4-dibromophénol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 et M187) ont été détectés avec succès dans le cal de carotte traité au 2,4-dibromophénol. De plus, le pic du 2,4-dibromophénol parent (temps de rétention = 0,85 min) n’a pas été trouvé dans le chromatogramme du traitement au 2,4-dibromophénol (Figure 2), ce qui indique que le 2,4-dibromophénol a été rapidement métabolisé dans le cal de la carotte dans les conditions expérimentales.

Les données chromatographiques et massiques utilisées pour identifier les métabolites du 2,4-dibromophénol dans le cal de la carotte sont résumées dans le tableau 1. Le 2,4-dibromophénol incubé dans le cal de la carotte a conduit à la formation de métabolites par conjugaison directe avec du glucose (M562, M545, M661 et M413) et des acides aminés (M339, M380 et M424). Par exemple, M413 a produit des fragments à m/z 250,8954 et 163,1485, qui correspondent au phtalate de dibutyle (DBP) et au glucose (C6H11O5). M413 a ensuite été métabolisé pour former les métabolites de conjugaison disaccharide M661, M545 et M562, en ajoutant du pentose ou de l’hexose. On a supposé que les acides M339, M380 et M424 étaient de l’alanine 2,4-dibromophénol, de l’acétylalanine 2,4-dibromophénol et de l’acide acétylaspartique 2,4-dibromophénol, car ils ont la perte neutre caractéristique d’acide aminé (C 3 H 6 NO2), d’acétylalanine (C 5 H 8 NO3) et d’acide acétylaspartique (C6H8NO5), produisant les fragments correspondants à m/z 89,0932, 129.1140 et 173.1235, respectivement15. Les résultats présentés suggèrent que les cultures de callosités végétales peuvent être utilisées comme un outil efficace et fiable pour élucider le métabolisme des xénobiotiques dans les cultures.

Figure 1 : Schéma de la méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Les chromatogrammes du 2,4-dibromophénol (photo ci-contre) et des métabolites du 2,4-dibromophénol. Cette figure a été adaptée avec la permission de Sun et al.15. Droit d’auteur (2018) American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Résumé du 2,4-dibromophénol et de ses métabolites découverts dans les extraits de callosités de carotte. Ce tableau a été adapté avec la permission de Sun et al.15. Droit d’auteur (2018) American Chemical Society.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.