Article de méthode

Ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains

2K vues

⸱

DOI :

10.3791/65110

⸱

23 février 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit des instructions détaillées pour effectuer des évaluations de ferritinophagie à haut débit basées sur l’immunofluorescence dans des fibroblastes humains primaires dérivés de la peau.

Résumé

Les mutations du gène de l’autophagie WDR45/WIPI4 sont à l’origine de la neurodégénérescence associée à la bêta-hélice (BPAN), un sous-type de maladies humaines connues sous le nom de neurodégénérescence avec accumulation de fer dans le cerveau (NBIA) en raison de la présence de dépôts de fer dans le cerveau des patients. Les niveaux de fer intracellulaires sont étroitement régulés par un certain nombre de mécanismes cellulaires, y compris le mécanisme critique de la ferritinophagie. Cet article décrit comment la ferritinophagie peut être évaluée dans les fibroblastes humains primaires dérivés de la peau. Dans ce protocole, nous utilisons des conditions modulatrices du fer pour induire ou inhiber la ferritinophagie au niveau cellulaire, telles que l’administration de bafilomycine A1 pour inhiber la fonction des lysosomes et les traitements au citrate d’ammonium ferrique (FAC) ou au déférasiox (DFX) pour surcharger ou épuiser le fer, respectivement. Ces fibroblastes traités sont ensuite soumis à une imagerie à haut débit et à une analyse de localisation quantitative basée sur CellProfiler de la ferritine endogène et des marqueurs autophagosomaux/lysosomaux, ici LAMP2. Sur la base du taux de ferritine autophagosomale/lysosomale, des conclusions peuvent être tirées concernant le niveau de ferritinophagie. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la ferritinophagie dans les fibroblastes primaires dérivés de patients atteints de BPAN ou dans d’autres types de cellules de mammifères.

Introduction

Les protéines WIPI (WD-repeat interagissant avec les phosphoinositides) sont des effecteurs PI3P conservés au cours de l’évolution avec des rôles distincts dans l’autophagie1. Les quatre protéines WIPI humaines (WIPI1 à WIPI4) se replient en hélices β à sept pales avec deux régions conservées au cours de l’évolution dans lesquelles les acides aminés homologues et invariants se regroupent sur des sites opposés de l’hélice. Un site est aligné avec la région de liaison au phosphoinositide dans les pales 5 et 6 de l’hélice. L’autre site est aligné avec la région d’interaction protéine-protéine où les WIPI s’associent à des membres distincts de la machinerie de l’autophagie ou des facteurs de régulation de l’autophagie2.

WIPI4 fonctionne dans le contrôle de la régulation de l’autophagie pilotée par l’énergie et au niveau du contrôle de la taille de l’autophagosome3 naissant en croissance. Une mutation du gène WIPI4 , appelée WDR45, est à l’origine de la neurodégénérescence associée à la bêta-hélice (BPAN), un sous-type de neurodégénérescence avec accumulation de fer dans le cerveau (NBIA) chez les patients humains qui se caractérise par un halo de fer hypointense dans la substance noire et le globus pallidus4. La présence de dépôts de fer anormaux chez les patients atteints de BPAN provoque des lésions neuronales qui se traduisent par une encéphalopathie, un retard global du développement, des convulsions et, finalement, un parkinsonisme, une démence et une spasticité5.

L’homéostasie du fer est étroitement régulée par de multiples mécanismes cellulaires, la concentration de fer cytosolique étant contrôlée par les niveaux d’expression et la fonctionnalité des transporteurs de fer, des transporteurs de fer et des protéines de stockage du fer6 . La concentration de fer cytosolique, à son tour, détermine si des voies de dégradation telles que la ferritinophagie7 ou la clairance protéasomale de la ferritine8 oxydée sont impliquées.

Au cours de la ferritinophagie, la ferritine est recrutée sélectivement dans les autophagosomes par le récepteur cargo NCOA4 et ciblée pour la dégradation lysosomale en réponse à de faibles niveaux de fer intracellulaires7. Étant donné le rôle de WIPI4 dans la régulation de la taille des membranes autophagosomiques3, il est raisonnable de prédire que la perte de cette fonction spécifique peut affecter la séquestration sélective de la ferritine dans les autophagosomes et, par conséquent, la ferritinophagie. L’étude de cette étape clé du métabolisme du fer pourrait ouvrir des portes à des options thérapeutiques pour les patients atteints de BPAN ; Cependant, les protocoles couramment utilisés pour étudier la ferritinophagie dans les cellules humaines ne sont en cours de développement que maintenant.

Cet article décrit une méthode à haut débit, basée sur la fluorescence, pour évaluer la ferritinophagie dans les cellules humaines. L’application de ce test à des cellules BPAN dérivées de patients peut fournir des informations précieuses sur la façon dont la ferritinophagie diffère de celle des cellules humaines saines et peut servir de référence pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette maladie humaine rare.

Protocole

1. Culture et ensemencement de cellules primaires

  1. Récupérez le flacon contenant des cellules congelées dans le réservoir d’azote liquide et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce qu’il atteigne la salle de culture cellulaire. Dans une hotte préalablement stérilisée, tenez le flacon dans la main pour que la suspension cellulaire décongèle. Remettre les cellules en suspension et les transférer dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm contenant 9 ml de DMEM préchauffé avec 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Agiter doucement pour que les cellules se répartissent uniformément sur la plaque et incuber pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2
  2. Le lendemain matin, examinez les cellules pour confirmer qu’elles sont attachées. Changez le milieu en DMEM frais + 10 % FCS + 1 % P/S, et laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence.
  3. Retirer le milieu de culture, laver 2 fois avec du DPBS, ajouter 1 mL de trypsine dans la plaque et l’incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 10 min. Ajouter 9 mL de DMEM + 10 % de FCS dans la plaque et remettre les cellules en suspension.
  4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Déterminez manuellement le nombre de cellules à l’aide d’une chambre Neubauer et diluez la suspension cellulaire dans du DMEM + 10 % de FCS jusqu’à ce qu’une concentration cellulaire de 40 000 cellules/ml soit atteinte.
  5. Dans une plaque à fond de verre à 96 puits, semer 100 μL/puits de suspension cellulaire. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 16 h.

2. Traitements

  1. Préparez les traitements suivants selon le tableau des matériaux : milieu témoin, milieu témoin plus déférasiox (DFX) pour la chélation du fer, ou milieu témoin plus citrate d’ammonium ferrique (FAC) pour la charge en fer. Préparer tous les traitements en présence et en l’absence d’un inhibiteur lysosomal (bafilomycine A1) pour l’évaluation du flux de ferritinophagie.
  2. Retirer le milieu de culture de la plaque et le remplacer par le traitement correspondant (100 μL/puits).
  3. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 6 h.

3. Fixation et coloration

  1. Aspirez le produit de traitement et lavez-le 2 fois avec du DPBS (Table of Materials).
  2. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA, Table des matériaux) par puits. Fixez les cellules pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité.
  3. Retirez le PFA et lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T (Table des matériaux).
  4. Bloc dans PBS/T contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à 4 °C.
  5. Préparez le mélange d’anticorps primaires (tableau des matériaux) dans PBS/T (anticorps de ferritine 1:50, anticorps LAMP2 1:50).
  6. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et appliquez 50 μL du mélange d’anticorps par puits. Enveloppez les plaques de parafilm et laissez incuber toute la nuit à 4 °C.
  7. Le lendemain matin, préparez le mélange d’anticorps secondaires (1:200) dans du PBS/T.
  8. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et appliquez 50 μL du mélange d’anticorps secondaires par puits. Incuber à 4 °C pendant 1 h dans l’obscurité.
  9. Préparer une solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS à température ambiante.
  10. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS/T et ajoutez 100 μL/puits de colorant DAPI. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité.
  11. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS et ajoutez 50 μL de PBS dans chaque puits. Enveloppez les plaques avec du parafilm et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité.

4. Imagerie automatisée à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser

  1. Remplacez le PBS dans la plaque par 50 μL de PBS frais à température ambiante.
  2. Couvrez la plaque de papier d’aluminium et apportez-la à la salle de microscopie.
  3. Allumez le microscope confocal à balayage laser, placez un porte-échantillon pour les plaques à 96 puits sur la table du microscope et choisissez un objectif approprié (ici : 40x). Voir le tableau 1 pour plus de détails.
  4. Ajustez les paramètres d’imagerie (Tableau 1).
    1. Dans la configuration intelligente, sélectionnez les lasers et les filtres, puis affectez-les à des pistes (pistes 1 à 3) pour une qualité d’image et une vitesse optimales (Tableau 1).
    2. Lors de la sélection du type d’expérience, cliquez sur Tuiles pour activer l’option de sélection et d’enregistrement des positions X,Y déterminées sur la plaque.
    3. Dans le module Configuration de l’imagerie , visualisez les voies d’acquisition, les pistes qui leur sont attribuées et leurs longueurs d’onde d’excitation et d’émission (Tableau 1).
    4. Dans le module Mode d’acquisition, sélectionnez les éléments suivants : Vitesse de balayage : 6 ; Direction : bidirectionnelle ; Moyenne : 2x ; Bits par pixel : 8.
    5. Dans le module Canaux , ajustez la puissance du laser, le sténopé et le gain principal pour chaque canal individuellement (Tableau 2). Ajustez ces paramètres pour obtenir des images correctement exposées sans les sursaturer.
    6. Cliquez sur le module Focus stratégie .
      1. Sélectionnez Combiner l’autofocus logiciel et la mise au point définitive.
      2. Sous Canal de référence et décalages, sélectionnez le canal le plus stable/le plus lumineux comme référence (normalement DAPI ou 488 nm).
      3. Sous Répétitions et fréquence des événements de stabilisation, sélectionnez Standard.
    7. Dans le module Autofocus logiciel , sélectionnez les éléments suivants : Mode | Intensité; Recherche | Intelligent; Échantillonnage | Bien; Portée relative.
    8. Cliquez sur le module Tuiles .
      1. Sélectionnez Positions | positions uniques.
      2. Sous Configuration avancée, naviguez dans la plaque, identifiez une position pour l’imagerie et cliquez sur le bouton + sous l’onglet Configuration de la position .
      3. Étiquetez chaque position avec des informations supplémentaires qui seront enregistrées sur les métadonnées de l’image. Pour ce faire, ouvrez l’onglet Propriétés , cliquez sur l’icône de la roue à côté du menu déroulant Catégorie , puis cliquez sur Nouveau pour ouvrir une nouvelle boîte de dialogue dans laquelle le nom de la nouvelle catégorie doit être saisi. Pour attribuer une catégorie à une certaine position, sélectionnez-la, cliquez sur l’onglet Propriétés , allez dans le menu déroulant Catégories et sélectionnez l’étiquette correspondante.
        REMARQUE : Il est recommandé de créer une catégorie pour chaque traitement afin d’étiqueter chaque position avec le traitement auquel les cellules ont été soumises.
      4. Sous Support d’échantillons, sélectionnez Fond en verre Multiwell 96-Cellvis #0. Cliquez sur Calibrer pour calibrer le microscope à la surface de la plaque. Choisissez entre un étalonnage en 1 point ou en 7 points en fonction des spécifications du système.
      5. Sous Options, sélectionnez un chevauchement de tuiles de 10 %. Sous Déplacement dans les régions de mosaïques, sélectionnez Peigner. Cochez les cases suivantes : utiliser la vitesse de la platine à partir du contrôle de la platine, utiliser l’accélération de la platine à partir du contrôle de la platine et la pyramide d’image lors de l’acquisition.
  5. Exécutez l’acquisition d’images et enregistrez les résultats de l’image (fichiers czi) et les métadonnées de l’image (fichiers csv) sur un disque dur portable.
  6. Exportez les images sous forme de fichiers TIFF.

5. Analyse d’images à haut débit

  1. Créez un fichier de feuille de calcul de métadonnées distinct avec les colonnes suivantes : Position, Puits, Condition, Série et Ensemble. Les données appropriées pour remplir ces colonnes sont extraites du fichier de métadonnées d’origine provenant de la microscopie confocale à balayage laser.
  2. Téléchargez le logiciel open source CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Lancez CellProfiler 4.2.4 en double-cliquant et importez le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1) par glisser-déposer.
    REMARQUE : Retrouvez ci-dessous les étapes de compilation du pipeline CellProfiler (Fichier supplémentaire 1) pour la reconnaissance automatisée des fibroblastes à l’aide de la coloration DAPI (Module 1, reconnaissance des noyaux, voir Tableau 2) et de la fluorescence de fond dans les cellules uniques dérivées d’AF488 (Module 2, reconnaissance cellulaire, voir Tableau 2). La reconnaissance des puncta (appelés objets) est déterminée par la taille du puncta et l’intensité de la fluorescence puncta sur le bruit de fond (Module 3, reconnaissance puncta, voir le tableau 2). Enfin, en fonction des limites des cellules, les ponctualités reconnues par le logiciel sont attribuées aux cellules correspondantes (Attribuer des relations). Une description détaillée de la mise en œuvre d’un pipeline CellProfiler pour les études d’autophagie a été publiée précédemment9. De plus, le Tableau 2 contient les paramètres CellProfiler utilisés dans cette étude. De plus, le fichier supplémentaire 2 affiche le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1) avec des captures d’écran prises dans l’ordre et faisant référence aux modules détaillés dans le tableau 2.
  4. Avant d’adapter le pipeline CellProfiler (fichier supplémentaire 1), faites glisser et déposez des fichiers image .czi individuels ou un dossier contenant plusieurs fichiers image .czi dans le module Image .
  5. Personnalisez le pipeline de reconnaissance d’image. Dans le module Noms et types , remplacez le code c1-c3 par un code qui permet au logiciel d’identifier et de trier les images monocanal à analyser.
  6. Ajustez les paramètres de pipeline pour les modules IdentifyPrimaryObjects et IdentifySecondaryObjects en optimisant les entrées numériques dans les modules. Les valeurs utilisées dans cette étude sont présentées dans le tableau 2.
  7. Pour suivre les ajustements, sélectionnez l’option Mode de test en cliquant sur le bouton Démarrer le mode de test . Cliquez ensuite sur le bouton Étape entre les modules. Attendez que des fenêtres contextuelles (l’image d’entrée d’origine, les contours de reconnaissance dessinés sur l’image d’origine et le résultat de l’analyse) montrent comment une image serait analysée avec les paramètres qui viennent d’être saisis.
  8. Une fois le pipeline optimisé, terminez le mode test. Exécutez l’analyse en activant le mode de test de sortie, puis en cliquant sur le bouton Analyser les images .
  9. Une fois l’analyse terminée, vérifiez la précision de la détection des cellules et des points en comparant les images d’entrée avec les sorties de superposition (limites de cellules, points de contrôle) générées par CellProfiler. Si elles ne sont pas satisfaisantes, ajustez les valeurs numériques dans les différents modules (tableau 2) jusqu’à ce que le résultat de l’analyse soit suffisamment précis.

6. Analyse des données

  1. Après avoir exécuté l’analyse, attendez que le logiciel crée un ensemble de fichiers texte tabulaires avec les résultats. Si vous utilisez le pipeline CellProfiler fourni (fichier supplémentaire 1), recherchez les fichiers de sortie suivants :
    1. Le fichier CellProfilerOutputCells , qui répertorie le numéro d’image attribué par le logiciel, le numéro de cellule attribué aux cellules individuelles, le nom du fichier d’origine et le chemin d’accès indiquant l’emplacement de stockage des fichiers, le nombre de points (ferritine, LAMP2) par cellule et la zone moyenne des points (ferritine, LAMP2) par cellule.
    2. Le fichier CellProfilerOutputExperiment , qui fournit des informations sur les détails techniques liés à l’expérience (par exemple, la version du logiciel, les canaux d’image, les balises de métadonnées).
  2. Ouvrez ces fichiers sous forme de feuilles de calcul.
  3. Procéder à l’analyse statistique des dénombrements ponctuels et des nombres de colocalisation ponctuels à l’aide du logiciel de statistiques préféré (Table des matériaux).

Résultats

Des fibroblastes primaires dérivés de la peau humaine (F-CO-60) provenant de donneurs sains (Figure 1A) ont été préparés pour des évaluations de la ferritinophagie à l’aide d’un traitement à la baflomycine A1, suivi d’une immunocoloration de la ferritine endogène et de la LAMP2, d’une analyse d’image automatisée et d’une analyse basée sur CellProfiler (Figure 1B).

La colocalisation de la ferritine endogène et de la LAMP2 a augmenté après que la dégradation lysosomale de la ferritine a été bloquée par l’ajout de bafilomycine A1, ce qui correspond à sa capacité à inhiber les enzymes lysosomales V-ATPase et, par conséquent, à bloquer la ferritinophagie7 (Figure 2). De plus, la reconnaissance logicielle des cellules, ainsi que la reconnaissance de la ferritine et de LAMP2, sont présentées à titre d’exemple (Figure 2).

À cet égard, il convient de noter que le pipeline CellProfiler décrit ici est extrêmement polyvalent et peut être adapté à des lectures supplémentaires et/ou alternatives, par exemple pour évaluer les effets de certaines mutations du BPAN sur la croissance cellulaire, les mitochondries ou d’autres organites dans le contexte de systèmes de marqueurs unicellulaires fonctionnels.

figure-results-1
Figure 1 : Vue d’ensemble de l’expérience. Représentation graphique de (A) le processus de ferritinophagie et (B) le flux de travail expérimental pour évaluer la ferritinophagie dans les fibroblastes humains primaires dérivés de la peau, comme décrit dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Images représentatives. Des fibroblastes humains primaires dérivés de la peau dans un milieu témoin (nourri) en l’absence (A) ou (B) en présence de bafilomycine A1 ont été soumis à une analyse d’immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps anti-ferritine et anti-LAMP2, tandis que les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI. Des images de fluorescence exemplaires acquises avec l’automatisation de la microscopie confocale à balayage laser sont présentées (barres d’échelle : 10 μm). Des changements dans l’abondance et la colocalisation de la ferritine et de LAMP2 ont pu être observés lors de l’inhibition lysosomale lors de l’administration de bafilomycine A1. L’analyse basée sur CellProfiler est également affichée, montrant les superpositions d’images dérivées du logiciel de la reconnaissance cellulaire (violet), des noyaux (bleu), de la ferritine (vert), de LAMP2 (rouge) et de la ferritine/LAMP2 (jaune) co-localisante. (C) Coupes d’image agrandies (barre d’échelle = 10 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Les paramètres de microscopie confocale à balayage laser utilisés dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Les paramètres numériques de CellProfiler utilisés dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Le pipeline CellProfiler utilisé dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Affichage du pipeline CellProfiler (voir Fichier supplémentaire 1) avec des captures d’écran prises dans un ordre consécutif (voir Tableau 2). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette méthode, qui utilise la microscopie à fluorescence automatisée combinée à l’analyse d’images en libre accès basée sur CellProfiler9 pour évaluer la localisation intracellulaire des facteurs clés de ferritinophagie, a été conçue pour fournir des informations précieuses sur l’efficacité de la clairance lysosomale de la ferritine via l’autophagie sélective, appelée ferritinophagie7. Ce protocole permet de manipuler de grands ensembles d’échantillons avec plusieurs lignées cellulaires et traitements simultanément, et d’évaluer les lectures souhaitées, telles que les nombres de ferritine puncta et de ferritine puncta colocalisant avec LAMP2, qui est un marqueur lysosomal typique pour évaluer le flux de ferritinophagie. Cependant, il convient de souligner ici qu’une analyse d’image précise et automatisée dépend de la qualité de l’image, qui, à son tour, dépend de la spécificité de l’anticorps et d’une imagerie optimale. Par conséquent, l’analyse d’images basée sur un logiciel ne doit être effectuée qu’avec des images de haute qualité.

La modulation des niveaux de fer dans les cellules peut fournir des informations précieuses sur les mécanismes qui sont activés pour réguler l’homéostasie du fer dans le contexte de la maladie. Cet article décrit une méthode pour étudier les maladies du BPAN dans des cellules dérivées de patients traitées avec des agents de charge et de chélation du fer. Deferasiox (DFX) est un chélateur de fer connu largement utilisé dans le domaine10. Lors de l’application, il piège le fer libre dans le cytoplasme et déclenche une réponse cellulaire à la carence en fer. Comme le but de cette étude était d’évaluer la ferritinophagie, priver les cellules de fer était un moyen simple de favoriser la dégradation de la ferritine par autophagie comme mécanisme de compensation pour reconstituer le réservoir de fer cellulaire. Le citrate d’ammonium ferrique (FAC), au contraire, est utilisé pour charger les cellules avec du fer. Les cellules activent la synthèse de la ferritine en réponse à des concentrations de fer cytosolique excessives et donc toxiques11. Le citrate d’ammonium ferrique favorise donc la synthèse de la ferritine et le piégeage du fer dans les hétéropolymères de ferritine, qui peuvent, à leur tour, activer la ferritinophagie.

Pour étudier le flux ferritinophagique, dans ce protocole, nous colorons sélectivement les acteurs clés du processus - la ferritine et les lysosomes (ici marqués par LAMP2) - et évaluons leur colocalisation. Un pourcentage élevé de ponctuations colocalisantes est indicatif d’une dégradation lysosomale efficace de la ferritine. Pour maximiser l’information récupérée à partir de ces expériences, des colorants supplémentaires ou des anticorps marqueurs peuvent être utilisés.

Il convient de noter que cette méthode présente des défis techniques inhérents. Les fibroblastes primaires dérivés de différents donneurs humains peuvent proliférer et se développer différemment in vitro. Par conséquent, pour des résultats comparables, différentes cellules doivent être ensemencées au même passage. Par conséquent, il est conseillé d’effectuer une expérience d’essai avant de procéder à ce protocole afin d’examiner les temps de doublement des cellules ou des lignées cellulaires à utiliser.

Cette méthode n’est pas limitée à l’étude de la ferritinophagie ; En changeant simplement les traitements et les anticorps utilisés, il peut être réutilisé pour évaluer diverses autres voies d’autophagie sélectives ; par exemple, la mitophagie peut être examinée en utilisant CCCP comme inducteur de stress mitochondrial et des anticorps optineurine, LC3 et LAMP2 pour la coloration12.

Dans l’ensemble, la combinaison de l’acquisition d’images automatisée et de l’analyse CellProfiler constitue un outil puissant pour l’évaluation fonctionnelle à haut débit de fibroblastes humains uniques. Ceci est particulièrement pertinent pour l’étude des maladies humaines, pour lesquelles l’analyse et la comparaison de grandes cohortes de cellules dérivées de patients et de cellules dérivées de donneurs sains sont d’un grand intérêt.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (projet E03). La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fibroblastes humains primaires dérivés de la peauBiopsie cutanée, donneur humain sain, Biobank University Clinic Tü ; bingen, Approbation éthique 389/2019BO2F-CO-60, passage 9
Traitements de culture cellulaireConcentration finale (composé)
Milieu témoinDMEM 10 %FCS(DMSO uniquement)
Milieu témoin + bafilomycine A1DMEM 10 % FCS100 nM bafilomycine A1
Milieu témoin + déférasiox (DFX)DMEM 10 %FCS30 & micro ; M DFX
Support de contrôle + DFX + bafilomycineA1DMEM 10 %FCS30 & micro ; M DFX, 100 nM bafilomycine A1
Milieu témoin + citrate d’ammonium ferrique (FAC)DMEM 10 % FCS0,05 mg/mL
Milieu témoin FAC + FAC + bafilomycine A1DMEM 10 % FCS0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycine A1
Matériel
Albumine [BSA] Fraction VAppliChemA1391
Alexa 488 chèvre a-rabbitLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 chèvre a-sourisLife TechnologiesA-11003
Bafilomycine A1Sigma Aldrich196000
BioLite Cell Culture traitée Boîtes de 10cmThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO  ;AppliChemA3672
DPBS sans calcium ni magnésiumGibco14190094
Sérum fœtal bovin (FCS)Gibco10437-028
Citrate d’ammonium ferrique (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITINE (rate humaine)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine)Life Technologies15140-122
Trypsine-EDTA (0,05 %) avec rouge de phénolGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 puits fond de verre #0 plaquesCellvisP96-0-N
Solution
3,7 % de paraformaldéhyde (PFA)PFA dissous dans du PBS, pH 7,5 ;
Bafilomycine A1 100 mM StockBafilomycine A1 diluée dans
du DMSO Citrate d’ammonium ferrique (FAC) 100 mg/mL StockFAC dilué dans de l’eau double distillée autoclavée
PBS/TPBS, complété par 10 % de Tween20  ;
PBS/T + BSAPBS, complété par 10 % de Tween20, 1 % de BSA  ;
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel Version 16.50Microsoft Office Plus 365
 ;

Références

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Hom ostasie du ferd gradation lysosomale de la ferritinemutation des g nes de l autophagieimagerie haut d bitmicroscopie confocaleanalyse CellProfilerimmunomarquagemarqueur LAMP2
Ferritinophagie : évaluation de la dégradation sélective du fer par autophagie dans les fibroblastes humains
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.