Article de méthode

Un modèle d’oreille de souris pour l’évaluation de la dermatite de contact allergique

DOI :

10.3791/65120

⸱

24 mars 2023

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1Department of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou University, 2Department of Traditional Chinese and Western Medicine, Medical College, Yangzhou University, 3The Key Laboratory of Syndrome Differentiation and Treatment of Gastric Cancer of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Yangzhou University, 4Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases, Yangzhou University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons les méthodes pour induire une dermatite de contact allergique dans les oreilles de souris par le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) et comment évaluer la gravité de la dermatite de contact allergique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La peau est la première ligne de défense du corps humain et l’un des organes les plus exposés aux produits chimiques environnementaux. La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie de la peau courante qui se manifeste par une éruption cutanée locale, une rougeur et des lésions cutanées. L’apparition et le développement de la DCA sont influencés par des facteurs génétiques et environnementaux. Bien que de nombreux chercheurs aient construit une série de modèles de DCA au cours des dernières années, les protocoles expérimentaux de ces modèles sont tous différents, ce qui rend difficile pour les lecteurs de bien les établir. Par conséquent, un modèle animal stable et efficace est d’une grande importance pour étudier plus avant la pathogenèse de la dermatite atopique. Dans cette étude, nous détaillons une méthode de modélisation utilisant le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) pour induire des symptômes de type DCA dans les oreilles des souris et décrivons plusieurs méthodes pour évaluer la gravité de la dermatite lors de la modélisation. Ce protocole expérimental a été appliqué avec succès dans certaines expériences et a un certain rôle promotionnel dans le domaine de la recherche sur la DCA.

Introduction

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La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie de la peau courante qui se caractérise par des symptômes semblables à ceux de l’eczéma au site de contact, un œdème et un érythème dans les cas modérés, et des papules, de l’érosion, de l’exsudation ou même des cicatrices massives dans les cas graves1. Elle touche jusqu’à 20% de la population et peut toucher des personnes de tout âge2. La DCA survient souvent chez les personnes qui ont été exposées à des allergènes à plusieurs reprises et peut être causée par la réponse immunitaire de la personne à un ou plusieurs allergènes à la maison ou au travail3. L’hypersensibilité retardée de type IV est considérée comme le principal type de réponse immunitaire dans ACD4. Dans les zones de la peau qui ont été exposées à plusieurs reprises à des allergènes, les lymphocytes T mémoire circulants s’accumulent en grand nombre et induisent des réponses immunitaires et inflammatoires 3,5,6. Le but de ce travail est de proposer une technique de laboratoire fiable pour une étude plus approfondie des réponses immunologiques et inflammatoires dans le développement de la DCA.

L’apparition de la DCA est généralement due à une hypersensibilité de contact causée par une exposition répétée à des produits chimiques. De nombreux chercheurs ont développé divers modèles animaux de DCA chez des souris domestiques7,8, des cobayes 9,10 et d’autres animaux au cours des dernières décennies, afin de simuler l’apparition de la maladie. La plupart des méthodes expérimentales comportent deux étapes: la sensibilisation abdominale (induction) et l’apport de stimuli sur le dos ou le lobe de l’oreille (stimulation). Les substances chimiques couramment utilisées comprennent principalement le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB)/1-chloro-2,4-dinitrobenzène (DNCB)8,9,11, l’oxazolone 12, l’urushiol 13, etc. Parmi eux, DNFB et DNCB sont les plus utilisés, signalés pour la première fois en octobre 195810. Le modèle de sensibilisation au nickel14 et le modèle de dermatite de contact photoallergique15 sont également fréquemment utilisés.

Nous présentons une méthode expérimentale pour construire le modèle ACD. Cette méthode est résumée et optimisée sur la base d’études antérieures et par comparaison avec de multiples expériences. Par rapport à d’autres modèles de DCA, ce modèle présente certains avantages, tels que de petites différences individuelles, de courtes périodes expérimentales, une petite quantité de stimulation chimique, etc. En outre, cette étude est applicable aux souris, qui sont non seulement économiques, mais ont également plus d’options pour l’élimination des gènes ou la préparation de souris transgéniques16. Nous décrivons également les différentes méthodes utilisées pour surveiller les progrès de la DCA dans l’expérience, telles que la mesure de l’épaisseur de l’oreille, l’utilisation du colorant bleu Evans pour mesurer l’exsudation inflammatoire, etc. Ce modèle peut non seulement analyser les oreilles, le sang, la rate et d’autres échantillons de souris par des moyens de laboratoire pour explorer la pathogenèse de la DCA, mais est également applicable pour l’évaluation préclinique de nouvelles méthodes thérapeutiques, ce qui a une certaine signification promotionnelle.

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Protocole

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Tous les soins et traitements des souris étaient conformes aux directives établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux sous la licence de projet SYXK (SU) 2022-0044. Des souris mâles et femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées dans cette étude. Chaque groupe était composé de six souris (voir le tableau des matériaux). Les cages ont été placées dans une chambre à température contrôlée (22 ± 2 °C, cycle lumière/obscurité de 12 h) avec libre accès à la nourriture et à l’eau. Un organigramme expérimental est illustré à la figure 1.

1. Préparation des animaux

  1. Commencer la modélisation après 1 semaine d’acclimatation à l’environnement.
  2. Utilisez une lampe ultraviolette et un désinfectant à l’alcool à 75 % pour nettoyer et désinfecter l’environnement et les comptoirs avant de manipuler les souris.
    REMARQUE: Afin d’éviter l’influence de facteurs externes, le marquage des souris pour identification ne peut pas être effectué sur l’oreille de la souris; La coloration sur le dos ou sur la queue peut être utilisée comme alternative.
  3. Utilisez un petit coton-tige pour appliquer de l’eau savonneuse sur l’abdomen des souris (environ 1-2 cm2 de taille). Rasez la zone dans le sens de la croissance des poils avec une lame ou un rasoir (voir Tableau des matériaux) au début du modelage (jour 0; Figure 2A).
    REMARQUE: L’utilisation d’une lame de rasoir droite pour l’épilation nécessite un opérateur qualifié. Si elle n’est pas effectuée correctement, elle peut provoquer une irritation de la peau. Envisagez d’utiliser une crème dépilatoire, une tondeuse ou un rasoir de sécurité pour l’épilation.
  4. Pesez la souris et comparez les changements de poids dans chaque groupe.

2. Stimulation de la sensibilisation abdominale

  1. Assurer la récupération complète de toute blessure mineure à la peau de l’abdomen induite par le rasage. Appliquer la sensibilisation abdominale 2 jours après le rasage (jour 2).
  2. Préparer la solution de DNFB à 0,5 % : diluer le DNFB avec un mélange acétone/huile d’olive dans un rapport de 4:1 (p. ex., 400 μL d’acétone mélangé à 100 μL d’huile d’olive; voir le tableau des matières). Utilisez un pistolet à pipette pour souffler et mélanger 20 fois pour bien mélanger la solution DNFB. Avant chaque administration de solution DNFB à la souris, souffler et mélanger trois à cinq fois.
    REMARQUE: Préparez la solution avant utilisation et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière directe du soleil.
  3. Appliquer 25 μL de la solution de DNFB à 0,5 % sur la peau de la zone rasée sur l’abdomen des souris à l’aide d’une pipette (figure 2B).
  4. Déposer la solution DNFB au milieu de la zone de rasage abdominal et étaler légèrement avec le côté lisse de l’extrémité du pipeteur pour la disperser uniformément.
  5. À 30 s après la stimulation DNFB, placez les souris dans des cages vides sans litière pour les empêcher de frotter la solution DNFB. Lorsque la solution de DNFB est complètement sèche (environ 2 min), remettez les souris dans leur cage d’origine.
  6. Portez des gants lorsque vous manipulez la solution DNFB car elle est fortement irritante pour la peau humaine.

3. Stimulation de la sensibilisation à l’oreille

  1. Préparez une solution de DNFB à 0,2% comme ci-dessus, la solution du véhicule (un mélange 4: 1 d’acétone et d’huile d’olive) et de l’eau pure.
  2. Orientez le corps de la souris et faites en sorte que le bord extérieur de l’oreillette soit orienté vers le bas pendant toute l’opération pour empêcher la solution de pénétrer dans le conduit auditif pendant la stimulation DNFB.
  3. Les jours 4, 6, 8 et 10, utilisez un pipeteur pour appliquer 20 μL de la solution de DNFB à 0,2 % ou de la solution du véhicule lentement et uniformément sur la surface interne des oreillettes gauches des souris. Pour éviter que la solution de DNFB ne pénètre dans le conduit auditif, utilisez le côté lisse de l’embout de la pipette pour répartir délicatement la solution de DNFB pendant l’administration. Laissez l’oreille droite non traitée (Figure 2C).
  4. Attendez que la solution de DNFB soit sèche et replacez les souris dans la cage (environ 30 s).
  5. Portez des gants lorsque vous manipulez la solution DNFB.

4. Enregistrement du poids de la souris et des symptômes de la DCA

  1. Pesez la souris tous les jours, commencez le jour 1 et comparez avec son poids correspondant le jour 0; évaluer l’effet de la DCA sur le poids corporel des souris sous forme de changement de poids (g) ± erreur-type de la moyenne (MEB).
  2. Prenez des photos haute résolution des oreilles de souris pour enregistrer les symptômes cliniques de la DCA tous les 2 jours, à partir du jour 1.

5. Mesure de l’épaisseur de l’oreillette

  1. Mesurez l’épaisseur de l’oreillette tous les 2 jours, à partir du jour 1. Mesurez et notez les deux oreilles en détail.
  2. Utilisez des étriers vernier (voir le tableau des matériaux) pour mesurer l’épaisseur de l’oreillette à la même heure chaque jour afin d’obtenir des résultats précis (figure 3A). Empêchez les étriers vernier de continuer à serrer vers l’intérieur lorsqu’il y a un léger blocage, afin d’éviter d’endommager les tissus de l’oreille de la souris. Gardez la position fixe et enregistrez les données.
  3. Collectez l’épaisseur à trois endroits différents sur chaque oreillette (Figure 3B). Notez la moyenne des trois données comme valeur valide. Évaluer le gonflement de l’oreille en micromètres (μm) ±erreur type de la moyenne (MEB).

6. Évaluation du degré de gonflement inflammatoire

  1. Préparer la solution de colorant bleu Evans à 0,5 % (voir le tableau des matières) : diluer le colorant bleu Evans avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) le jour 11. Portez une blouse de laboratoire et des gants en tout temps, car le colorant bleu Evans est légèrement toxique pour les humains.
  2. Immobiliser les souris avec un fixateur: ouvrez le couvercle du fixateur (voir Tableau des matériaux), tenez la queue de la souris, faites en sorte que la tête de la souris fasse face au fixateur et faites grimper instinctivement la souris dans le fixateur. Couvrez le couvercle, faites sortir la queue de souris du trou sur le couvercle et ajustez la longueur du fixateur pour exposer toute la queue de la souris.
  3. Essuyez la queue à plusieurs reprises avec une boule de coton alcoolisé ou faites-la tremper dans de l’eau tiède pendant 30 s et pincez doucement la racine de la queue pour remplir et élargir les veines des deux côtés. Effectuer l’injection sous l’irradiation d’une source de lumière froide.
  4. Injecter lentement la solution de colorant bleu Evans dans la veine de la queue de la souris à l’aide d’une aiguille à insuline de 1 mm. Attendez 15 minutes, puis prenez des photos des oreilles de la souris.
    REMARQUE: Placez la souris sur la table et maintenez-la doucement pour exposer la région de l’oreille pour l’acquisition d’image. Peu de temps après l’injection avec la solution de colorant bleu Evans et en observant les indications correspondantes, utilisez la luxation cervicale pour euthanasier la souris.

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Résultats

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Sous stimulation répétée du DNFB, les oreilles de souris du groupe DNFB présentaient des symptômes cliniques évidents comparables à ceux de la DCA, avec des zones sensibles présentant les symptômes typiques de rougeur, de sécheresse et même d’érosion et d’exsudation. Cependant, l’administration d’eau pure (groupe témoin) ou de solvant témoin (groupe véhicule) n’a pas produit de symptômes similaires (figure 4).

Pendant ce temps, dans le groupe DNFB, par rapport à l...

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Discussion

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Le protocole décrit ici pour induire des symptômes semblables à ceux de la DCA dans les oreilles des souris peut être utilisé pour étudier la physiopathologie de la DCA et comme outil de dépistage pour le développement de nouveaux médicaments.

Il y a deux étapes clés pour établir un modèle de DCA : la sensibilisation initiale et la stimulation subséquente. L’abdomen est généralement le site de la sensibilisation initiale, mais le site de stimulation subséquente a été choisi légèrement différem...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC) à N.-N. Y. (81904212); Projet scientifique et technologique de médecine traditionnelle chinoise du Jiangsu (YB201995); et le Projet spécial de financement pour les chercheurs postdoctoraux en Chine (2020T130562).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB)Merck200-734-31-Fluoro-2,4-dinitrobenzène, &ge ; 99 %
AcétoneSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd10000418&ge ; 99.5 %
Feuille d’aluminium  ;CleanwrapCF-2
Evans blue dyeSolarbio314-13-6Teneur en colorant env. 80
 %Fixateur de sourisZHUYANBANGGEGD-SM1830
Huile d’oliveSolarbio8001-25-0500 ml
Pointe de pipetteBiofountFT-20010 - 200 &mu ; l
PipetteEppendorf AG312300025020 - 200 &mu ; l
Lame de rasoirShanghai Gillette Co. LTD74-S
Étriers VernierDelixi ElectricDECHOTVCS1200

Références

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  1. Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
  2. Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
  3. Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
  4. Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J. Allergic contact dermatitis. International Immunopharmacology. 2 (2-3), 201-211 (2002).
  5. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  6. Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
  7. Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
  8. Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
  9. Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
  10. Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
  11. Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
  12. Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
  13. Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
  14. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
  15. Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
  16. Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397(2022).
  17. Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
  18. Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
  19. Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237(2021).
  20. Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023(2023).

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Mots-clés

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