Article de méthode

Les oligonucléotides antisens comme outil d’inhibition prolongée des ARNlnc nucléaires dans les lignées cellulaires humaines

DOI :

10.3791/65124

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1 septembre 2023

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1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour analyser la fonction des ARNlnc dans des processus dépendant du temps tels que l’instabilité chromosomique, un effet d’inactivation prolongé doit être obtenu. À cette fin, nous présentons ici un protocole qui utilise des oligonucléotides antisens modifiés pour obtenir une neutralisation efficace dans les lignées cellulaires pendant 21 jours.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les ARN longs non codants (ARNlnc) jouent des rôles régulateurs clés dans l’expression des gènes au niveau transcriptionnel. Des preuves expérimentales ont établi qu’une fraction substantielle de lncRNA s’accumule préférentiellement dans le noyau. Pour l’analyse de la fonction des ARNlnc nucléaires, il est important de parvenir à une neutralisation efficace de ces transcrits à l’intérieur du noyau. Contrairement à l’utilisation de l’interférence ARN, une technologie qui dépend de la machinerie de silençage cytoplasmique, une technologie d’oligonucléotide antisens (ASO) peut réaliser l’inactivation de l’ARN en recrutant la RNase H dans les duplex ARN-ADN pour le clivage de l’ARN nucléaire. Contrairement à l’utilisation d’outils CRISPR-Cas pour l’ingénierie du génome, où des altérations possibles de l’état de la chromatine peuvent se produire, les ASOs permettent l’inhibition efficace des transcrits nucléaires sans modifier le génome. Néanmoins, l’un des principaux obstacles à l’inactivation médiée par l’ASO est son effet transitoire. Pour l’étude des effets à long terme du silençage de l’ARNlnc, il est nécessaire de maintenir un knockdown efficace pendant une longue période. Dans cette étude, un protocole a été développé pour obtenir un effet knockdown pendant plus de 21 jours. L’objectif était d’évaluer les effets cis-régulateurs de l’inactivation de l’ARNlnc sur le gène codant adjacent RFC4, qui est lié à l’instabilité chromosomique, une condition qui n’est observée qu’au fil du temps et du vieillissement cellulaire. Deux lignées cellulaires humaines différentes ont été utilisées : la PrEC, cellules épithéliales primaires normales de la prostate, et la HCT116, une lignée cellulaire épithéliale isolée du carcinome colorectal, qui a permis de réduire avec succès les lignées cellulaires analysées.

Introduction

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La grande majorité du génome humain est transcrite, ce qui donne lieu à une grande variété de transcrits, y compris les ARNlnc, qui, en nombre, dépassent le nombre de gènes codants annotés dans le transcriptome humain1. Les ARNlnc sont des transcrits de plus de 200 nucléotides qui ne codent pas pour les protéines 2,3 et ont récemment été examinés pour leurs fonctions régulatrices importantes dans la cellule4. Il a été démontré que leurs fonctions dépendent de leur localisation subcellulaire5, comme le noyau où une fraction significative des ARNlnc s’accumulent et participent activement à la régulation transcriptionnelle6 et au maintien de l’architecture nucléaire7, entre autres processus biologiques 8,9,10.

Pour la caractérisation fonctionnelle des ARNlnc nucléaires, des méthodes capables d’induire un knockdown (KD) dans le noyau doivent être utilisées, et les ASOs sont un outil puissant pour faire taire les transcrits nucléaires. En général, les ASOs sont des séquences d’ADN simple brin de ~20 paires de bases qui se lient à l’ARN complémentaire par appariement de bases Watson-Crick 11,12,13 et peuvent modifier la fonction de l’ARN par des mécanismes qui dépendent de leur structure chimique et de leurs modifications 13,14. Les modifications chimiques de l’ASO peuvent être divisées en 2 grands groupes : les modifications du squelette et les modifications de l’anneau glucidique 2'15, qui sont toutes deux destinées à augmenter la stabilité en conférant une résistance élevée aux nucléases, mais aussi à renforcer l’effet biologique recherché13,16. Parmi les modifications du squelette, les liaisons phosphoramidate morpholino (PMO), thiophosphoramidate et morpholino sont largement utilisées à des fins telles que l’interférence dans l’épissage17,18 en servant d’agents bloquants stériques19 mais pas pour induire la dégradation du transcrit. Une autre modification du squelette est la liaison phosphorothioate (PS), l’une des modifications les plus couramment utilisées dans les ASO. Contrairement aux modifications mentionnées précédemment, les liaisons PS n’interfèrent pas avec le recrutement de la RNase H12,20, permettant ainsi l’inactivation de l’ARN. Cependant, il existe également une grande variété de modifications de l’anneau de sucre2' 21 ; néanmoins, dans le but de neutraliser l’ARN, parmi les modifications qui induisent des effets de silençage efficaces, on trouve les acides nucléiques verrouillés (LNAs)22, 23 et la modification 2'-O-méthyl24. Même si les LNA se sont avérés très efficaces pour l’inactivation par rapport à d’autres modifications25, ils peuvent induire des effets indésirables tels que l’hépatotoxicité26 et l’induction de l’apoptose in vivo et in vitro27.

Dans le but de l’inactivation de l’ARN, les ASOs avec les modifications appropriées mentionnées ci-dessus peuvent recruter les RNases H1 et H220,28, et ces enzymes sont recrutées dans des hybrides ADN-ARN et clivent l’ARN cible, libérant l’ASO13. Les produits d’ARN de ce clivage sont ensuite traités par la machinerie de surveillance de l’ARN, ce qui entraîne une dégradation de l’ARN29 sans modifier la région génomique d’intérêt, contrairement à d’autres techniques telles que les systèmes CRISPR-Cas, où les modifications de l’état de la chromatine peuvent créer des effets biologiques indésirables30. Malgré les avantages de la technologie ASO, les effets temporaires de silençage dus à la division cellulaire ou à la dégradation de l’ASO au fil du temps constituent un obstacle à surmonter lors de l’étude de processus dépendants du temps tels que l’instabilité chromosomique (CIN)31.

En particulier, la CIN est définie comme une augmentation du taux de modifications du nombre et de la structure des chromosomes par rapport à celles des cellules normales32 et résulte d’erreurs dans la ségrégation des chromosomes pendant la mitose, conduisant à des altérations génétiques qui sont à l’origine de l’hétérogénéité intratumorale33 au fil du temps. Ainsi, la CIN ne peut pas être évaluée uniquement en trouvant un caryotype aneuploïde. Pour l’étude et l’évaluation correctes de la CIN en culture cellulaire, il est important de surveiller les cellules au fil du temps. Pour l’étude des effets d’un KD d’ARNlnc sur la CIN, une méthodologie permettant un effet KD prolongé est nécessaire. À cette fin, des ASOs ont été utilisés dans ce protocole, où lncRNA-RFC4 a été réduit au silence avec succès dans les lignées cellulaires humaines HCT115 et PrEC pendant 18 et 21 jours, respectivement. Ce transcrit est un ARNlnc non caractérisé de 1,2 kb de longueur, et sa localisation génomique est sur le chromosome 3 (q27.3). Il est adjacent au gène codant pour la protéine RFC4, un gène associé à la CIN dans différents types de cancer humain 34,35,36.

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Protocole

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REMARQUE : Ce protocole est destiné à être exécuté uniquement par du personnel de laboratoire ayant de l’expérience dans les procédures de sécurité de laboratoire. Il est essentiel de lire correctement les fiches de données de sécurité de tous les réactifs et matériaux utilisés dans ce protocole avant de commencer à manipuler des matières et des équipements dangereux. Il est essentiel de lire, de comprendre et de respecter toutes les exigences de sécurité indiquées dans le manuel de sécurité du laboratoire de votre établissement tout au long du protocole. L’élimination de tous les déchets biologiques et chimiques doit être effectuée conformément au manuel de gestion et d’élimination des déchets de l’établissement. S’ils ne sont pas manipulés avec soin et conformément aux pratiques de laboratoire sécuritaires, les matériaux et l’équipement utilisés dans ce protocole peuvent causer des blessures graves. Suivez toujours le manuel de laboratoire de sécurité et les procédures de sécurité de l’établissement.

1. Conception des organismes de réglementation

  1. Concevez manuellement des ASOs comme décrit ci-dessous.
    1. Obtenez la séquence complète du transcrit cible et analysez-la dans le RNAfold WebServer, Université de Vienne37 (Table des matériaux), en utilisant les paramètres par défaut sur le site Web pour obtenir la structure secondaire à énergie libre minimale (MFE).
    2. Lorsque les résultats sont prêts, allez dans le dessin de la structure simple MFE et cliquez sur Afficher dans Forna pour ouvrir la structure secondaire MFE sur le site Web, et le logiciel affichera la structure secondaire prédite de la transcription analysée.
    3. À partir de la structure secondaire MFE prédite, sélectionnez une région de 20 pb de longueur dans l’ARN, en évitant les G-strings (séquences de 3 guanines d’affilée) lors de la conception des oligonucléotides. Pour sélectionner la meilleure région cible pour l’ASO, utilisez les régions dont la probabilité d’appariement de bases internes est plus faible (Figure 1).
    4. À partir de la région sélectionnée de 20 pb, créez la séquence de complément inverse. Créez manuellement le complément inversé ou utilisez l’outil en ligne du complément inversé (Table des matériaux). La séquence inverse du complément sera l’ASO qui doit être synthétisé pour l’expérience.
    5. Analysez la séquence ASO à l’aide de Nucleotide Blast NCBI (blastn) et UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). Assurez-vous que les ASOs ne présentent pas d’homologie avec d’autres transcrits ou d’autres régions génomiques du génome humain.
      REMARQUE : La synthèse et la purification de l’ASO ont été effectuées par une société commerciale (Table des matériaux).
  2. Assurez-vous que les oligonucléotides synthétisés ont les caractéristiques suivantes.
    1. Assurer les liaisons PS tout au long de la séquence de l’oligonucléotide38 (Figure 2A). S’assurer que les ASOs sont chimériques, avec 5 nucléotides flanquant les extrémités 5' et 3' avec des anneaux de sucre modifiés avec du 2'-O-méthyle (figure 2B).
    2. Assurez-vous que les 10 nucléotides du milieu ont un cycle glucidique non modifié pour soutenir la liaison de la RNase H (Figure 2C).
    3. Demandez à l’entreprise d’effectuer la purification à l’aide d’un dessalage standard et d’un HPLC39 en phase inverse (RP).
    4. Commandez la livraison ASO au format lyophilisé.
  3. Dissoudre les ASO lyophilisés dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans calcium ni magnésium jusqu’à une concentration finale de 200 μM. Conserver à -20 °C.
  4. Préparez la solution de travail d’ASO en diluant la substance concentrée à une concentration de 20 μM. Préparez la dilution à l’aide de DPBS. Conserver à -20 °C.
    REMARQUE : Pour cette étude, deux ASOs ciblant lncRNA-RFC4 ont été conçus. Pour optimiser la concentration d’ASO pour la transfection et l’efficacité, le protocole de Zong et al.40 a été suivi. Deux ASO ont été conçus et optimisés expérimentalement selon le protocole de Zong : ASO-lncRFC4 et ASO-lncRFC4-2. Après optimisation, un ASO efficace ciblant lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, a été sélectionné pour le protocole de knockdown prolongé (Figure supplémentaire 1). En tant que contrôle positif, un ASO efficace précédemment confirmé ciblant l’ARNlnc MALAT18 a été utilisé : ASO-MALAT1. Pour le contrôle négatif, un ASO ciblant le gène lacZ d’Escherichia coli , ASO-lacZ (numéro d’accession NCBI : FN297865), a été conçu.

2. Préparation des cellules

REMARQUE : Travaillez à l’intérieur du capot de culture cellulaire chaque fois que des lignées cellulaires, des solutions, du matériel ou tout produit à utiliser lors de la manipulation de la culture cellulaire sont manipulés. Lors de la manipulation de liquides pour la culture cellulaire, utilisez toujours des pipettes sérologiques stérilisées ou des micropipettes avec des pointes stérilisées. Respectez et respectez toujours toutes les exigences de sécurité indiquées dans le manuel de sécurité du laboratoire de l’établissement pendant toute la durée du protocole.

  1. Préparez le milieu de culture cellulaire complet pour chaque lignée cellulaire comme décrit ci-dessous.
    1. Pour HCT116, préparez le milieu McCoy’s 5A avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
    2. Pour la PrEC, préparer le milieu basal des cellules épithéliales de la prostate avec le kit de croissance des cellules épithéliales de la prostate.
  2. Utiliser trois plaques de culture de 100 mm (55 cm2 de surface) pour les expériences de KD, une pour chaque oligonucléotide à utiliser : ASO ciblant l’ARNlnc, ASO à utiliser comme témoin positif (ASO-MALAT1) et ASO à utiliser comme contrôle négatif (ASO-lacZ).
  3. Utilisez deux plaques de culture de 35 mm (9 cm2 de surface) à utiliser comme points de contrôle pour le KD entre les passages cellulaires, dont l’une sera transfectée avec un milieu de transfection complet pour ASO-lncRFC4 et l’autre pour ASO-lacZ.
    REMARQUE : La transfection a été planifiée conformément aux procédures et protocoles du fabricant du réactif de transfection à base de lipides (voir le tableau des matériaux) précédemment rapportés41,42.
  4. Cellules de semence à une densité de 1 x 104 cellules/cm2 dans des boîtes de culture cellulaire. Incuber à 37 °C dans l’incubateur en utilisant 5 % de CO2 dans l’air jusqu’à ce que les cellules atteignent 50 % de confluence (lorsque 50 % de la surface est recouverte par la monocouche cellulaire). Avec une confluence de 50 %, les cellules sont prêtes à être transfectées pour ce protocole.
    REMARQUE : Pour la transfection d’ASO-lncRFC4 et d’ASO-lacZ, une boîte de 100 mm et une boîte de 35 mm ont été ensemencées. Pour la transfection d’ASO-MALAT1, seule une boîte de 100 mm a été ensemencée (figure 3A).

3. Transfection

  1. Échauffez le sérum réduit à 37 °C avant le début de l’intervention.
  2. Pour la transfection avec ASO-lacZ et ASO-lncRFC4, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    REMARQUE : La transfection avec ASO-lacZ et ASO-lncRFC4 est prévue pour les cellules d’une surface de 55cm2 ; Lorsque différentes zones sont utilisées, les volumes peuvent être ajustés en conséquence. Cette procédure doit être effectuée pour chaque ASO utilisé dans les mêmes conditions.
    1. Préparez le tube 1 à l’intérieur du capot de culture cellulaire en dissolvant 43,75 μL d’ASO (20 μM) dans 1,4 mL de milieu sérique réduit chaud dans un tube à centrifuger conique de 15 mL.
    2. Préparez le tube 2 à l’intérieur du capuchon de culture cellulaire en mélangeant 18,66 μL de réactif de transfection à base de lipides avec 1,4 ml de milieu sérique réduit chaud dans un tube de microfuge sans RNase de 1,5 mL.
    3. Incuber les tubes 1 et 2 à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire à température ambiante pendant 10 min.
    4. Ajouter la solution contenue dans le tube 2 (réactif de transfection + sérum réduit) directement dans le tube 1 (ASO + sérum réduit) lentement, goutte à goutte, pour éviter de répandre les réactifs sur la surface du tube.
    5. Incuber le mélange contenu dans le tube 1 pendant 20 min à l’intérieur de la hotte de culture à température ambiante.
    6. Ajouter le sérum réduit chaud moyen au tube 1 jusqu’à un volume final de 8,75 ml.
      REMARQUE : Le milieu de transfection final contenait de l’ASO à une concentration de 100 nM.
    7. Retirer le milieu de culture de la boîte de culture cellulaire contenant les cellules à transfecter et ajouter 7,5 ml du milieu de transfection à la plaque de culture de 100 mm et 1 ml à la plaque de culture de 35 mm directement dans la monocouche cellulaire, goutte à goutte. Assurez-vous que le support est uniformément réparti sur toute la surface en secouant doucement le plat.
    8. Incuber dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 dans l’air pendant 6 h.
    9. Après 6 h d’incubation dans le milieu de transfection, ajouter 7,5 mL de milieu complet dans les cellules de la plaque de culture de 100 mm et 1 mL de milieu complet dans les cellules de la plaque de culture de 35 mm. Incuber à 37 °C et 5 % CO2.
  3. Pour la transfection avec ASO-MALAT1, effectuez les expériences décrites ci-dessous.
    REMARQUE : La transfection avec ASO-MALAT1 est prévue pour les cellules d’une surface de 55cm2.
    1. Préparez le tube 1 à l’intérieur du capot de culture cellulaire en dissolvant 37,5 μL d’ASO (20 μM) dans 1,2 mL de milieu sérique réduit chaud dans un tube à centrifuger conique de 15 mL.
    2. Préparez le tube 2 en mélangeant 16 μL de réactif de transfection à base de lipides avec 1,2 mL de milieu sérique réduit chaud.
    3. Incuber les tubes 1 et 2 à température ambiante pendant 10 min à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire.
    4. Ajouter la solution contenue dans le tube 2 (réactif de transfection à base de lipides + sérum réduit) directement dans le tube 1 (ASO + sérum réduit) lentement, goutte à goutte, pour éviter de répandre les réactifs sur la surface du tube.
    5. Incuber le mélange contenu dans le tube 1 pendant 20 min à l’intérieur de la hotte de culture à température ambiante.
    6. Ajouter le sérum réduit chaud dans le tube 1 jusqu’à un volume final de 7,5 ml. Le milieu de transfection final contenait de l’ASO à une concentration de 100 nM.
    7. Retirez le milieu de culture de la boîte de culture cellulaire contenant les cellules à transfecter et ajoutez 7,5 ml du milieu de transfection directement sur la monocouche cellulaire dans le sens goutte à goutte pour vous assurer que le milieu est uniformément réparti sur toute la surface en secouant doucement la boîte.
    8. Incuber à 37 °C dans un incubateur en utilisant 5 % de CO2 dans l’air pendant 6 h.
    9. Après 6 h d’incubation avec le milieu de transfection, ajouter 7,5 mL de milieu complet dans les cellules et incuber dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  4. Évaluez les cellules au microscope toutes les 12 à 24 heures jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le prochain cycle de transfection.
    REMARQUE : Ensuite, la transfection doit être effectuée lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 %. Au besoin, remplacez le milieu par un milieu de culture complet.
  5. Lorsque les cellules sont confluentes à 70 % dans la boîte de culture cellulaire, répétez la procédure (étapes 3.1 à 3.4) et effectuez le prochain cycle de transfection.
    REMARQUE : Après la deuxième transfection, les cellules doivent être évaluées au microscope toutes les 12 à 24 heures. La récolte et le passage des cellules doivent être effectués lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 85 %. Au besoin, remplacez le milieu par un milieu de culture complet.

4. Récolte et passage des cellules

REMARQUE : La récolte et le passage des cellules sont effectués tous les 2 cycles de transfection et après les 2e, 4eet 6ecycles de transfection. Le temps moyen de prélèvement dans les cellules HCT116 était de 6 jours après les 1re, 3eet 5e transfections, et pour les cellules PrEC, le temps moyen était de 7 jours après les 1re, 3e et 5e transfections. Le point temporel de la transfection diffère pour les deux lignées cellulaires utilisées dans ce protocole. Pour HCT116, les 2e, 3e, 4e, 5e et 6e transfections sont effectuées respectivement 3, 6, 9, 12 et 15 jours après la première transfection. Pour la PrEC, les 2e, 3e, 4e, 5e et 6e transfections sont effectuées respectivement 3, 7, 10, 14 et 18 jours après la première transfection. Reportez-vous à la chronologie de la figure 3 pour vérifier les points de temps pour la transfection, le passage et la récolte.

  1. Effectuer le prélèvement et le passage de cellules pour les expériences KD dans des plaques de culture de 100 mm, comme décrit ci-dessous.
    1. Procéder à la récolte des cellules et au passage lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 85 %.
    2. Réchauffez l’ensemble du fluide et lavez les solutions à 37 °C. Réchauffez le réactif de dissociation à température ambiante. Réchauffez la solution neutralisante pour le réactif de dissociation à température ambiante.
      REMARQUE : Les solutions de lavage, les réactifs de dissociation et les solutions neutralisantes diffèrent pour les deux lignées cellulaires utilisées dans ce protocole. Les cellules HCT116 sont lavées avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) et dissociées avec une solution de trypsine-EDTA. La neutralisation du réactif de dissociation est effectuée avec des milieux de culture complets pour les cellules HCT116. Pour la PrEC, une solution saline tamponnée à l’HEPES est utilisée comme solution de lavage. La trypsine-EDTA est utilisée comme réactif de dissociation. Pour neutraliser le réactif de dissociation, utilisez une solution neutralisante de trypsine.
    3. À l’intérieur de la hotte de culture, retirer le milieu de culture du plat de culture cellulaire et laver délicatement avec 3 ml de solution de lavage, puis jeter la solution de lavage. Répétez cette étape 2 fois.
    4. Ajouter 2 mL de réactif de dissociation selon la lignée cellulaire à la monocouche cellulaire et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min. Évaluer les cellules toutes les 2 minutes jusqu’à ce que la dissociation soit complète.
    5. Ajouter 2 mL de solution neutralisante selon la lignée cellulaire et transférer tout le volume de la suspension cellulaire de la boîte de culture cellulaire dans un tube de centrifugation conique de 15 mL.
    6. Pour l’extraction de l’ARN, prélever 500 μL de suspension cellulaire et le transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Placez le tube sur de la glace et passez à l’étape 5.1 pour l’extraction de l’ARN et la RT-qPCR.
    7. Centrifuger le reste de la suspension cellulaire à 120 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
    8. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 2 mL de milieu de culture complet et procéder au comptage cellulaire selon les procédures standard.
    9. Pour le caryotype, ensemencer des cellules à une densité de 1 x 104 cellules/cm2 dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm de diamètre (surface de 9cm2), incuber dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 dans l’air pendant 24 h et procéder au caryotypage selon les procédures standard.
    10. Pour poursuivre les expériences KD dans le passage cellulaire suivant, ensemencez des cellules à une densité de 1 x 104 cellules/cm2 dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 100 mm de diamètre. Ce plat sera le passage numéro 2 de l’expérience. Incuber à 37 °C dans un incubateur en utilisant 5 % de CO2 dans l’air jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 50 %.
      REMARQUE : Si vous le souhaitez, les cellules restantes peuvent être utilisées pour l’extraction et/ou la congélation des protéines selon les procédures standard.
    11. Répéter les étapes 3.1 à 4.1.10 pour la transfection et la récolte à partir du passage 2 et du passage 3.
  2. Suivez la procédure suivante pour le prélèvement cellulaire pour les points de contrôle des expériences KD dans des boîtes de culture de 35 mm.
    REMARQUE : La récolte pour le premier point de contrôle de l’expérience KD est effectuée 2 jours après les procédures de 2e et 4e transfection.
    1. Réchauffez l’ensemble du support et des solutions de lavage à 37 °C. Réchauffez le réactif de dissociation à température ambiante. Réchauffez la solution neutralisante pour le réactif de dissociation à température ambiante.
    2. À l’intérieur de la hotte de culture, retirez le milieu de culture de la boîte de culture cellulaire et lavez-le délicatement avec 0,5 ml de solution de lavage, puis jetez la solution de lavage. Répétez cette étape 2 fois.
    3. Après avoir jeté les solutions de lavage, ajoutez 0,5 mL de réactif de dissociation selon la lignée cellulaire et incubez à 37 °C pendant 3 à 5 min. Évaluez les cellules toutes les 2 minutes jusqu’à ce que la dissociation soit complète.
    4. Ajoutez 0,5 ml de solution neutralisante selon la lignée cellulaire et transférez tout le volume de la suspension cellulaire de la boîte de culture cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et placez-le sur de la glace.
    5. Passez à l’étape 5.1 pour l’extraction de l’ARN et la qPCR.

5. Extraction d’ARN et RT-PCR

  1. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 2 min à 4 °C et jeter le surnageant. Lavez la pastille cellulaire avec 600 μL de PBS froid (4 °C).
  2. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 2 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    Utilisez la pastille cellulaire pour l’extraction de l’ARN selon les procédures standard.
  3. Procéder au traitement par DNase de l’ARN purifié selon la procédure standard suivie en laboratoire. Au point de pause, stockez l’ARN purifié à -80 °C pendant de longues périodes.
  4. Utilisez l’ARN pour la synthèse standard de l’ADNc avec chaque échantillon d’ARN obtenu. Au point de pause, stockez l’ADNc à -20 °C pendant de longues périodes.
  5. Effectuez une qPCR standard en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Pour la qPCR, les oligonucléotides amplifient les transcrits suivants : lncRNA d’intérêt, MALAT1 et un gène exprimé de manière constitutive en tant que contrôle interne (Tableau 1). Pour ce protocole, l’expression RPS28 a été utilisée comme contrôle interne.
    2. Effectuez des réactions qPCR pour amplifier le contrôle interne, l’ARNlnc d’intérêt et MALAT1 en utilisant l’ADNc de l’échantillon ASO-LacZ. Cet exemple sera utilisé pour normaliser l’expression des autres échantillons.
    3. Effectuez des réactions qPCR pour amplifier le contrôle interne RPS28 et l’ARNlnc d’intérêt en utilisant l’ADNc de l’échantillon ASO-lncRNA.
    4. Effectuez des réactions qPCR pour amplifier les contrôles internes RPS28 et MALAT1 à l’aide de l’ADNc de l’échantillon ASO-MALAT1. Suivez les conditions de configuration de la réaction et du thermocycleur comme décrit dans le tableau 2.
    5. Analysez les données qPCR par normalisation ΔΔCt de l’expression du transcrit d’intérêt par rapport au contrôle interne, puis normalisez l’expression du transcrit d’intérêt (lncRNA ou MALAT1) par rapport à l’expression du même transcrit dans l’échantillon ASO-LacZ pour obtenir le niveau d’expression relatif du transcrit.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le protocole actuel, l’utilisation d’ASOs a été adaptée à la KD d’un ARNlnc nucléaire pendant une période prolongée dans les lignées cellulaires humaines PrEC et HCT116.

Certes, l’expérience KD a été couronnée de succès dans la lignée cellulaire PrEC pendant 21 jours de l’expérience, comme l’observe la figure 4. Pour confirmer cette affirmation, en plus d’analyser l’expression dans les jours de passage cellulaire (Figure 4

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comme mentionné précédemment, les ARNlnc ont des fonctions régulatrices clés dans la cellule ; Ainsi, la dérégulation de ces transcrits peut être impliquée dans des maladies. Le cancer est l’une de ces maladies caractérisée par une dérégulation de l’ARNlnc43,44. Dans cette maladie, les ARNlnc sont connus pour jouer des rôles régulateurs importants en tant qu’oncogènes45 ou suppresseurs de tumeurs

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manriquez, Rogelio est un étudiant au doctorat du Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et a reçu une bourse CONACyT avec le numéro CONACyT CVU : 581151.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à centrifuger 15ml - Tubes coniques 15mlThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm Plat de culture traité TCCorning  ;430167Surface :55 cm2
Corning 35 mm Plat de culture traité TCCorning  ;430165Surface : 9 cm2
DPBS, sans calcium, sans magnésiumThermo Fisher Scientific14190144
Sérum fœtal bovin (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 lignée cellulaireATCCCCL-247
HEPES, solution tampon 1MThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies  ;NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy’s 5A medium  ;ATCC30-2007
Cellules épithéliales primaires de la prostate humaine normales (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Explosion de nucléotides NCBI  ;NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Milieu sérique réduitThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7,4Thermo Fisher Scientific
Cellule épithéliale de la prostate Milieu basalATCCPCS-440-030
Kit de croissance des cellules épithéliales de la prostateATCCPCS-440-040
Complément inversé outil en ligneNANA https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
Tubes à microfuges sans RNase, 1,5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénolThermo Fisher Scientific12604013Solution de trypsine-EDTA
Solution neutralisante de trypsineATCCPCS-999-004
Trypsine-EDTA pour cellules primairesATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Humain (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

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Mise jour du knockdown des lncRNA nucl airesARN non codants longsrecrutement de la RNase Hknockdown prolong de l ARNeffets de r gulation cisinstabilit chromosomiquecellules PrECcellules HCT116
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