Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.
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Article de méthode
Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes
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Résumé
Résumé
Les plantes mycohétérotrophes présentent l’une des formes les plus extrêmes de dépendance mycorhizienne, ayant totalement perdu leur capacité autotrophe. Aussi essentiels que toute autre ressource vitale, les champignons auxquels ces plantes s’associent intimement leur sont essentiels. Par conséquent, certaines des techniques les plus pertinentes dans l’étude des espèces mycohétérotrophes sont celles qui permettent d’étudier les champignons associés, en particulier ceux qui habitent les racines et les organes souterrains. Dans ce contexte, des techniques d’identification des champignons endophytes dépendants et indépendants de la culture sont couramment appliquées. L’isolement des endophytes fongiques permet de les identifier morphologiquement, d’analyser leur diversité et de maintenir les inocules pour des applications dans la germination symbiotique des graines d’orchidées. Cependant, on sait qu’il existe une grande variété de champignons non cultivables qui habitent les tissus végétaux. Ainsi, les techniques d’identification moléculaire indépendantes de la culture offrent une couverture plus large de la diversité et de l’abondance des espèces. L’objectif de cet article est d’apporter le soutien méthodologique nécessaire à la mise en place de deux procédures d’investigation : l’une dépendante de la culture et l’autre indépendante. En ce qui concerne le protocole dépendant de la culture, les processus de collecte et de conservation des échantillons de plantes des sites de collecte aux installations de laboratoire sont détaillés, ainsi que l’isolement des champignons filamenteux des organes souterrains et aériens des plantes mycohétérotrophes, la conservation d’une collection d’isolats, la caractérisation morphologique des hyphes par la méthodologie de culture sur lame et l’identification moléculaire des champignons par extraction totale de l’ADN. Englobant des méthodologies indépendantes de la culture, les procédures détaillées comprennent la collecte d’échantillons de plantes pour des analyses métagénomiques et l’extraction totale de l’ADN à partir d’organes végétaux achlorophylliens à l’aide d’un kit commercial. Enfin, des protocoles de continuité (p. ex., réaction en chaîne par polymérase [PCR], séquençage) sont également suggérés pour les analyses, et les techniques sont présentées ici.
Introduction
Les champignons endophytes sont, par définition, ceux qui habitent l’intérieur des organes et des tissus végétaux lors d’infections discrètes (c’est-à-dire sans causer de dommages à leur hôte)1,2. Ces champignons peuvent interagir de manière neutre ou bénéfique avec les plantes hôtes, peuvent conférer une résistance aux agents pathogènes et aux conditions environnementales défavorables, et peuvent contribuer à la synthèse de composés bénéfiques pour la plante (par exemple, les facteurs de croissance et d’autres phytohormones)1,3. Les endophytes mycorhi....
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Protocole
1. Prélèvement d’échantillons de plantes
- Prélèvement d’échantillons pour les méthodes dépendantes de la culture
- Creusez soigneusement les organes souterrains ; Il peut s’agir de racines, de tiges, de rhizomes ou d’organes de stockage de la plante à collecter. En dehors des sols très compacts, collectez ces échantillons à la main.
REMARQUE : L’utilisation d’outils tels que des truelles ou des pelles dans cette étape est déconseillée, car elle peut endommager les structures fragiles des plantes mycohétérotrophes et peut provoquer une contamination des tissus par des champignons non endophytes. - Collectez autant d’organes so....
- Creusez soigneusement les organes souterrains ; Il peut s’agir de racines, de tiges, de rhizomes ou d’organes de stockage de la plante à collecter. En dehors des sols très compacts, collectez ces échantillons à la main.
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Résultats
Dans le protocole d’isolement, étant donné qu’il y a contamination par l’eau utilisée lors du dernier lavage et que la contamination est également détectée dans les boîtes de Pétri avec des fragments inoculés, différentes mesures peuvent être prises, selon le type de contaminant (tableau 1). Cette procédure doit être répétée dès le début en cas de contaminants fongiques très sporulants, qui présentent également une croissance accélérée, et de bactéries multiplicatrices in.......
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Discussion
La désinfestation superficielle des échantillons de plantes est l’une des étapes les plus critiques du protocole présenté. Il est fortement souhaitable qu’il n’y ait pas de contamination de la vaisselle PDA par des gouttes provenant du dernier lavage. Les bactéries sont fréquemment observées en tant que contaminants dans les boîtes d’isolement, généralement plus que les champignons sporulants en suspension dans l’air, étant donné que les bactéries endophytes sont également courantes dans les tissu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer et n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions les financements de la FAPESP (2015/26479-6) et du CNPq (447453/2014-9). JLSM remercie le CNPq pour les subventions à la productivité (303664/2020-7). Le MPP remercie Capes (bourse de maîtrise, processus 88887.600591/2021-00) et CNPq.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ruban | (de n’importe quelle entreprise, pour le montage du ruban adhésif dans les analyses micromorphologiques) | ||
| Ampicilline | Sigma-Aldrich | A5354 | (pour l’installation de fragments de plantes ; d’autres antibiotiques peuvent être utilisés - vérifier l’étape 2.2.1) |
| Autoclave | (de n’importe quelle entreprise, pour la stérilisation des matériaux en plusieurs étapes) | ||
| Gélose bactériologique | Sigma-Aldrich | A1296 | (pour de nombreuses étapes) |
| Solutions C1, C2, C3, C4, C5 et C6 | Qiagen | 12888-50 | (acheté avec le kit DNeasy PowerSoil) |
| Centrifugeuse ; ; | Merck/Eppendorf | 5810 G | (pour l’extraction totale de l’ADN des isolats fongiques) |
| Tubes à centrifuger | Merck | CLS430828 | (pour le prélèvement d’échantillons) |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich | C2432 | (pour l’extraction totale de l’ADN des isolats fongiques) |
| Rouge Congo | Supelco | 75768 | (pour la coloration des hyphes) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (pour plusieurs étapes) |
| Éthanol | Supelco | 100983 | Il faudra effectuer les dilutions appropriées (pour de nombreuses étapes) |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Papier filtre | Merck | WHA10010155 | (pour de nombreuses étapes) |
| Tubes à essai en verre | Merck | CLS7082516 | (pour la cryoconservation dans les grains de riz non décortiqués) |
| Laine de verre | Supelco | 20411 | (pour la cryoconservation dans les grains de riz non décortiqués) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Ou dextrose (pour la cryoconservation dans la vermiculite) |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5516 | Ou glycérine (pour la cryoconservation dans la vermiculite, pour la préparation du LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (pour l’extraction totale de l’ADN fongique isolats) |
| Acide lactique | Sigma-Aldrich | 252476 | (pour la préparation du LPCB - coloration des hyphes) |
| Solution de bleu de lactophénol (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (pour la coloration des hyphes) |
| Hotte | (classe I, de n’importe quelle entreprise, pour de nombreuses étapes) | ||
| Microscope | (de n’importe quelle entreprise, pour l’observation des hyphes) | ||
| MB Spin Colonnes | Qiagen | 12888-50 | (acheté avec le kit DNeasy PowerSoil) |
| Bleu de méthyle (bleu coton) | Sigma-Aldrich | M5528 | (pour la préparation du LPCB - coloration des hyphes) |
| Tube de microcentrifugation (1,5 mL) | Merck | HS4323 | (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Tube de microcentrifugation (2 mL) | Merck | BR780546 | (pour de nombreuses étapes) |
| Huile minérale | (pour la conservation des isolats fongiques) | ||
| Sacs | Taille moyenne 150 mm x 200 mm (pour le prélèvement d’échantillons) | ||
| Boîte de Pétri (verre, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, pour la culture sur lames de champignons, préférez les plus hauts) |
| Boîte de Pétri (verre, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (pour la purification des isolats fongiques) ; alternativement : boîtes de Pétri en polystyrène (stériles, irradiées aux rayons gamma, non autoclavables) |
| Boîte de Pétri (verre, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (pour l’installation de fragments de plantes) ; alternativement : boîtes de Pétri en polystyrène (stériles, irradiées aux rayons gamma, non autoclavables) |
| Phénol | Sigma-Aldrich | P1037 | (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques, pour la préparation du LPCB) |
| Porcelaine mortier | Sigma-Aldrich | Z247464 | (pour l’extraction totale de l’ADN des isolats fongiques) |
| Pilon en porcelaine | Sigma-Aldrich | Z247502 | (pour l’extraction totale de l’ADN des isolats fongiques) |
| Gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) | Millipore | P2182 | (pour de nombreuses étapes) |
| Tubes PowerBead | Qiagen | 12888-50 | (acheté avec le kit DNeasy PowerSoil) |
| Montage rapide milieu (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (pour la culture sur lames de champignons) |
| Gel de silice | Supelco | 717185 | (pour la cryoconservation dans les grains de riz non décortiqués) |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Dodécylsulfate de sodium (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Sel de sodium au laurylsulfate (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Hypochlorite de sodium (avec 2 % de chlore actif) | (produit commercial, pour la désinfestation superficielle) | ||
| Kit d’extraction d’ADN du sol (kit DNeasy PowerSoil) | Qiagen | 12888-50 | (pour l’extraction totale de l’ADN des organes végétaux) |
| Spectrophotomètre - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher | Scientific ND2000CLAPTOP | (pour l’extraction totale de l’ADN des organes végétaux) |
| Stéréomicroscope | (=microscope de dissection, de n’importe quelle société, pour les analyses macromorphologiques) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (pour l’installation de fragments de plantes) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (ou d’autres sociétés) |
| Homogénéisateur de tissus et lyseur de cellules | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Homogénéisateur de tissus automatisé et lyseur de cellules (pour l’extraction totale de l’ADN des organes végétaux) | |
| Bleu de toluidine O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (pour la coloration des hyphes) |
| Tréhalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (pour la cryoconservation dans la vermiculite) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699( | pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Grains | (pour la cryoconservation) | ||
| Tige | (ou une adaptation - vérifier l’étape 5.4.1, pour la culture en lames de champignons) | ||
| Vermiculite | Granulométrie fine (pour la cryoconservation dans la vermiculite) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’isolats fongiques) |
| Extrait de levure | Sigma-Aldrich | Y1625 | (pour la cryoconservation dans la vermiculite) |
Références
- de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes.
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer
