Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Praapti Jayaswal; Mohd Ilyas; Kuljit Singh; Saurabh Kumar; Lovely Sisodiya; Sapna Jain; Rahul Mahlawat; Nishant Sharma; Vishal Gupta; Krishnamohan Atmakuri

doi:10.3791/65138

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Article de méthode

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

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DOI :

10.3791/65138

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8 décembre 2023

Praapti Jayaswal¹ , Mohd Ilyas¹ , Kuljit Singh¹^,² , Saurabh Kumar¹^,³ , Lovely Sisodiya¹ , Sapna Jain¹ , Rahul Mahlawat¹ , Nishant Sharma¹^,⁴ , Vishal Gupta¹ , Krishnamohan Atmakuri¹

¹Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, ²Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, ³ICAR-Research Complex for Eastern Region, ⁴Public Health Research Institute, Rutgers University

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Résumé

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Résumé

La plupart des bactéries, y compris les mycobactéries, génèrent des vésicules extracellulaires (VE). Étant donné que les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de composants cellulaires, notamment des métabolites, des lipides, des protéines et des acides nucléiques, plusieurs groupes ont évalué les versions natives ou recombinantes des bEV pour leur pouvoir protecteur en tant que candidats vaccins sous-unitaires. Contrairement aux VE natifs, les VE recombinants sont génétiquement modifiés pour contenir un ou plusieurs immunogènes d’intérêt. Au cours de la dernière décennie, différents groupes ont exploré diverses approches pour générer des bEV recombinants. Cependant, nous rapportons ici la conception, la construction et l’enrichissement des VE mycobactériennes recombinantes (mEV) dans les mycobactéries. Pour ce faire, nous utilisons Mycobacterium smegmatis (Msm), une mycobactérie avirulente du sol comme système modèle. Nous décrivons d’abord la génération et l’enrichissement des EV natifs de Msm. Ensuite, nous décrivons la conception et la construction de mEVs recombinants qui contiennent soit mCherry, une protéine rapporteure fluorescente rouge, soit EsxA (Esat-6), un immunogène important de Mycobacterium tuberculosis. Nous y parvenons en fusionnant séparément les N-terminaisons mCherry et EsxA avec l’extrémité C d’une petite protéine Msm, Cfp-29. Cfp-29 est l’une des rares protéines abondamment présentes chez les MsmEVs. Le protocole de génération et d’enrichissement des mEVs recombinants à partir de Msm reste identique à celui de génération et d’enrichissement des EVs natifs de Msm.

Introduction

Malgré le développement et l’administration d’une large gamme de vaccins contre les maladies infectieuses, encore aujourd’hui, ~30 % de tous les décès humains sont dus à des maladies transmissibles¹. Avant l’avènement du vaccin antituberculeux (TB) - Bacillus Calmette Guérin (BCG) - la tuberculose était la première cause de mortalité (~10 000 à 15 000/100 000 habitants)². Grâce à l’administration du BCG et à l’accès facile aux médicaments antituberculeux de première et de deuxième intention, en 2022, le nombre de décès liés à la tuberculose a considérablement chuté à ~1 million/an en 2022 (c’est-à-dire ~15-20/100 000 hab....