Article de méthode

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

DOI :

10.3791/65138

⸱

8 décembre 2023

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1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

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Résumé

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Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Résumé

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La plupart des bactéries, y compris les mycobactéries, génèrent des vésicules extracellulaires (VE). Étant donné que les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de composants cellulaires, notamment des métabolites, des lipides, des protéines et des acides nucléiques, plusieurs groupes ont évalué les versions natives ou recombinantes des bEV pour leur pouvoir protecteur en tant que candidats vaccins sous-unitaires. Contrairement aux VE natifs, les VE recombinants sont génétiquement modifiés pour contenir un ou plusieurs immunogènes d’intérêt. Au cours de la dernière décennie, différents groupes ont exploré diverses approches pour générer des bEV recombinants. Cependant, nous rapportons ici la conception, la construction et l’enrichissement des VE mycobactériennes recombinantes (mEV) dans les mycobactéries. Pour ce faire, nous utilisons Mycobacterium smegmatis (Msm), une mycobactérie avirulente du sol comme système modèle. Nous décrivons d’abord la génération et l’enrichissement des EV natifs de Msm. Ensuite, nous décrivons la conception et la construction de mEVs recombinants qui contiennent soit mCherry, une protéine rapporteure fluorescente rouge, soit EsxA (Esat-6), un immunogène important de Mycobacterium tuberculosis. Nous y parvenons en fusionnant séparément les N-terminaisons mCherry et EsxA avec l’extrémité C d’une petite protéine Msm, Cfp-29. Cfp-29 est l’une des rares protéines abondamment présentes chez les MsmEVs. Le protocole de génération et d’enrichissement des mEVs recombinants à partir de Msm reste identique à celui de génération et d’enrichissement des EVs natifs de Msm.

Introduction

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Malgré le développement et l’administration d’une large gamme de vaccins contre les maladies infectieuses, encore aujourd’hui, ~30 % de tous les décès humains sont dus à des maladies transmissibles1. Avant l’avènement du vaccin antituberculeux (TB) - Bacillus Calmette Guérin (BCG) - la tuberculose était la première cause de mortalité (~10 000 à 15 000/100 000 habitants)2. Grâce à l’administration du BCG et à l’accès facile aux médicaments antituberculeux de première et de deuxième intention, en 2022, le nombre de décès liés à la tuberculose a considérablement chuté à ~1 million/an en 2022 (c’est-à-dire ~15-20/100 000 habitants1). Cependant, dans les populations endémiques de tuberculose dans le monde, les décès liés à la tuberculose continuent de se situer entre ~100 et 550/100 000 habitants1. Bien que les experts reconnaissent plusieurs raisons conduisant à ces chiffres faussés, la protection médiée par le BCG ne dure même pas pendant la première décennie de la vie semble être la principale raison 3,4,5,6,7. Par conséquent, compte tenu des « Objectifs de développement durable » renouvelés de l’ONU et de la « Stratégie pour mettre fin à la tuberculose » de l’OMS, il y a un effort mondial concerté pour développer une alternative vaccinale bien supérieure au BCG qui offre peut-être une protection à vie contre la tuberculose.

Pour atteindre cet objectif, plusieurs groupes évaluent actuellement des souches modifiées/recombinantes du BCG, des espèces mycobactériennes non pathogènes et atténuées autres que le BCG, et des sous-unités candidates 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . En règle générale, les vaccins sous-unitaires sont des liposomes chargés sélectivement avec peu de protéines immunogènes purifiées (~1-6) de longueur complète ou tronquée de l’agent pathogène. Cependant, en raison de leur repliement parasite en conformations non natives et/ou d’interactions aléatoires non fonctionnelles entre les protéines chargées, les sous-unités manquent souvent d’épitopes natifs et germaniques et, par conséquent, ne parviennent pas à amorcer suffisamment le système immunitaire14,19,20.

Par conséquent, les vésicules extracellulaires (VE) des bactéries ont pris de l’ampleur en tant qu’alternative prometteuse 21,22,23,24,25,26. En règle générale, les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de leurs composants cellulaires, y compris certaines portions d’acides nucléiques, de lipides et des centaines de métabolites et de protéines27,28. Contrairement aux liposomes où quelques protéines purifiées sont chargées artificiellement, les bEV contiennent des centaines de protéines naturellement chargées, repliées nativement, avec une meilleure propension à amorcer le système immunitaire, en particulier sans le coup de pouce / l’aide d’adjuvants et d’agonistes des récepteurs de type Toll (TLR)27,28,29. C’est dans cette ligne de recherche que nous et d’autres avons exploré l’utilité des VE mycobactériennes en tant que boosters potentiels de sous-unités du BCG30. Malgré les inquiétudes selon lesquelles les bEV n’ont pas de charges antigéniques uniformes, les VE de Neisseria meningitidis atténué ont réussi à protéger les humains contre le méningocoque du sérogroupeB 31,32.

Du moins en théorie, les meilleurs VE qui pourraient bien booster le BCG sont les VE enrichis en bactéries pathogènes. Cependant, l’enrichissement des VE générées par des mycobactéries pathogènes est coûteux, long et risqué. De plus, les VE générées par des agents pathogènes peuvent être plus virulentes que protectrices. Compte tenu des risques potentiels, nous rapportons ici un protocole bien testé pour l’enrichissement des VE générées par le Msm cultivé axéniquement, une mycobactérie avirulente.

Cependant, bien qu’elles codent pour plusieurs orthologues de protéines pathogènes, les mycobactéries avirulentes manquent de plusieurs antigènes vaccinaux/épitopes protéiques pathogènes nécessaires pour préparer suffisamment le système immunitaire à la protection33. Par conséquent, nous avons également exploré la construction et l’enrichissement des VE recombinantes de Msm par ingénierie moléculaire, de sorte qu’une partie importante de toute protéine pathogène d’intérêt exprimée et traduite en Msm, doit atteindre ses EV. Nous avons émis l’hypothèse qu’une ou plusieurs des 10 protéines les plus abondantes des VE Msm, lorsqu’elles sont fusionnées à la protéine d’intérêt, aideront à une telle translocation.

Alors que nous commencions à standardiser l’enrichissement des VE mycobactériennes (mEVs) dans notre laboratoire, en 2011, Prados-Rosales et al. ont rapporté pour la première fois la visualisation et l’enrichissement des mEVs in vitro30. Plus tard, en 2014, le même groupe a publié une version modifiée de sa méthode34 de 2011. En 2015, Lee et al. ont également fait état d’une méthode standardisée indépendante pour l’enrichissement en mEV à partir de cultures axéniques de mycobactéries35. En combinant les deux protocoles34,35 et en incorporant quelques-unes de nos modifications après une standardisation approfondie, nous décrivons ici un protocole qui permet d’enrichir régulièrement les mEVs à partir de cultures axéniques de mycobactéries 36.

Ici, nous détaillons particulièrement l’enrichissement des VE spécifiques au MSM, qui est une extension d’un protocole publié36 pour l’enrichissement des VE mycobactériennes en général. Nous détaillons également comment construire des mEVs recombinants (R-mEVs) qui contiennent la protéine mCherry (en tant que rapporteur fluorescent rouge) et EsxA (Esat-6)37,38,39, un immunogène prédominant et une sous-unité potentielle de vaccinogène de Mycobacterium tuberculosis. Le protocole d’enrichissement des R-mEVs reste identique à celui que nous avons décrit pour l’enrichissement des VE natifs à partir de Msm.

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Protocole

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1. Conditions de croissance de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli et de leurs dérivés

  1. Média
    1. Bouillon liquide Middlebrook 7H9
      1. Préparez la solution mère Tween-80 à 20 % en préchauffant le volume requis d’eau doublement distillée (ddw) dans un bécher en verre à ~45-50 °C au micro-ondes, ajoutez le volume requis de Tween-80 à l’aide d’une éprouvette de mesure appropriée et remuez continuellement sur un petit agitateur magnétique pour amener les 20 % Tween-80 dans une solution uniforme. Filtrer le Tween-80 à 20 % à travers un filtre d’élimination de 0,22 um et conserver la solution mère jaune pâle à 4 °C.
        REMARQUE : Toutes les traces de Tween-80 dans l’éprouvette de mesure doivent être transférées dans le bécher pour une concentration finale précise. Ne pas autoclaver le bouillon Tween-80 préparé. Filtrer (utiliser 0,22 μM), stériliser et conserver à 4 °C.
      2. Suivez les instructions du fabricant pour la préparation du bouillon 7H9. Suspendre 4,7 g de poudre 7H9 dans 900 mL de ddw. Ajouter 2 mL de glycérol, mélanger le contenu et cuire à l’autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 20 min.
        REMARQUE : N’ajoutez pas d’enrichissement ADC Middlebrook (ADC) et Tween-80 avant l’autoclavage.
      3. Une fois que le milieu autoclavé a refroidi à température ambiante (RT, c’est-à-dire ~25 °C), dans une enceinte de sécurité biologique standard de type A2, ajouter de manière aseptique 10 fois 10 ml de stock d’ADC (1 x final) et 2,5 ml (0,05 % final) de 20 % Tween-80. Filtrer le mélange à travers une unité de filtration jetable de 0,22 μm et stocker la solution mère transparente vert jaunâtre très clair à 4 °C.
        REMARQUE : Le pH du substrat doit être de ~6,6 à 6,8 (si <6,4 ou >7,0, jetez-le et faites-le frais). Conserver à 4 °C (stable pendant 3 à4 semaines). Il est fortement recommandé de filtrer le média 7H9 (après l’ajout de l’ADC et du Tween-80) deux fois à travers deux unités de filtration jetables indépendantes de 0,22 μm.
    2. Bouillon liquide de Sáton (milieu minimal)
      1. Dissoudre la L-asparagine (0,4 % p/v) et l’acide citrique (0,2 % p/v) dans 950 mL de ddw. Ajouter 1 mL de chacun des bouillons 1 000 x (en poids jj) de phosphate de potassium dibasique fraîchement préparés (incolores ; bouillon 10 g/20 mL ; 1 x 0,5 g/L final) ; sulfate de magnésium heptahydraté (incolore ; bouillon 10 g/20 mL ; final 1x 0,5 g/L) ; et le citrate d’ammonium ferrique (brun très clair ; bouillon 1,6 g/40 mL ; final 1x 0,04 g/L) et bien mélanger sur un agitateur magnétique.
        REMARQUE : Au mieux, les stocks 1 000x peuvent avoir 2 semaines ; si vous êtes plus âgé, préparez des bouillons frais ; rangez-les à RT dans l’obscurité (par exemple, à l’intérieur d’une armoire ou d’une étagère). Si le citrate d’ammonium ferrique est brun foncé, jetez-le et rendez-le frais. Il est préférable d’ajouter les trois sels dans l’ordre mentionné à l’étape 1.1.2.1. Faites tourbillonner la solution à chaque fois avant d’ajouter chaque solution saline.
      2. Mesurez et notez le pH à l’aide d’un pH-mètre ; Assurez-vous qu’il se situe autour de 3,1 à 3,2. Si le pH est supérieur à 3,7, jetez les bouillons et préparez-les frais. Pour ajuster le pH à 7,4, utilisez autant de gouttes d’hydroxyde de sodium 10 N que nécessaire. Surveillez le pH final tout en agitant continuellement la solution/le milieu sur un agitateur magnétique.
      3. Ajouter 4,76 mL de glycérol, 0,25 mL de Tween-80 à 20 % (0,005 % final, voir aussi la note de l’étape 2.2.1.3), et seulement ensuite, porter le volume à 1 L. Ensuite, filtrez-stérilisez deux fois 1 L de milieu avec deux filtres d’élimination séparés de 0,22 μm. Conservez le milieu clair et incolore à 4 °C (stable pendant 2 semaines).
        REMARQUE : Ce n’est qu’après avoir ajusté le pH à 7,4 que vous ajoutez du glycérol. Sinon, le support deviendra blanc trouble. S’il est trouble, jetez-le (n’essayez pas de le chauffer) et préparez-le frais. Pour toutes les préparations de mEVs, utilisez du Sauton’s fraîchement préparé.
    3. Base gélosée Middlebrook 7H11
      1. Suivez les instructions du fabricant pour la préparation. Suspendre 19 g de poudre 7H11 dans 900 mL de ddw. Ajouter 5 mL de glycérol, agiter à l’aide d’un agitateur magnétique pour obtenir une suspension uniforme (vert pâle ; pH 6,6 à 6,8 ; si >7,2, jeter et préparer frais), et autoclaver à 121 °C, 15 psi et pendant 20 min.
        REMARQUE : N’ajoutez pas d’ADC et 0,05% Tween-80 avant l’autoclavage.
      2. Lorsque le milieu refroidit à ~50 °C, de manière aseptique dans une enceinte de sécurité biologique de type A2, ajouter 100 mL d’ADC (amené à RT) et 2,5 mL de Tween-80 à 20 % (final de 0,05 %) (amené à RT). Distribuer immédiatement de manière aseptique dans des boîtes de Pétri.
        REMARQUE : Les plaques sont stables à 4 °C pendant au moins 4 à6 semaines. Assurez-vous que les plaques sont à RT pendant la nuit avant d’emballer les plaques pour un stockage à 4 °C. Sinon, l’humidité sera piégée dans les plaques pendant l’incubation à 37 °C.
    4. Bouillon Miller Luria Bertani (LB) et base d’agar
      1. Suivez les instructions du fabricant pour la préparation. Pour préparer le bouillon LB, suspendez 25 g de poudre dans 1 000 mL de ddw et remuez doucement pendant 5 minutes dans un bécher en verre sur un agitateur magnétique. Lors de la suspension uniforme, aliquote les volumes requis dans des flacons de milieu (p. ex., 300 mL dans un flacon de 500 mL) et un autoclave. Pour préparer la gélose LB, suspendre 40 g de poudre dans 1 000 mL de ddw et autoclaver (12 g de poudre dans 300 mL de ddw dans un flacon en verre de 500 mL).
  2. Conditions de croissance
    REMARQUE : Toutes les étapes du travail de culture bactérienne doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (type A2). Toutes les cultures doivent être traitées avec des tubes, des flacons et des pointes de pipette stériles.
    1. Jour 1
      1. Ajouter 1 mL de bouillon glycérol de Msm (du congélateur à -80 °C) à 2 x 10 mL (dans des tubes centrifugés coniques stériles de 50 mL) de bouillon 7H9 fraîchement autoclavé, refroidi et préchauffé (~37 °C), remuer trois fois, fermer les couvercles et incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C et 200-220 tr/min (agitateur d’incubateur).
        REMARQUE : Pour cultiver Mycobacterium tuberculosis (Mtb), suivez des étapes similaires, mais incubez les tubes de 50 mL pendant 4 à 6 jours à37 °C et 120-150 tr/min (agitateur d’incubateur) dans des réglages BSL3. Suivre TOUTES les directives internationales et les pratiques de biosécurité des agents pathogènes BSL3 et du groupe de risque 3 lors de la manipulation et de la mise au rebut du Mtb et de ses cultures. Utilisez une enceinte de sécurité biologique de type B2 pour la manipulation du Mtb et de ses cultures.
    2. Jour 2
      1. Lorsque OD 600 (A 600nm ; densitomètre cellulaire) atteint ~1,0, centrifugez les cultures Msm pendant 10 min à 3200 × g et RT (centrifugeuse de paillasse). Jeter les surnageants à l’aide d’embouts de pipette stériles de 1 ml.
        REMARQUE : L’étape ci-dessus reste la même pour les cultures Mtb, sauf que le nombre de jours est de 4 à 7. Veillez à ne pas toucher la pastille bactérienne avec l’embout de la pipette.
      2. Lavage : À chaque pastille de Msm, ajouter 1 mL de milieu Sauton’s préchauffé (à l’étape 1.1.2) et remettre délicatement en suspension avec des pointes de pipette de 1 mL pour obtenir une suspension uniforme. À l’aide d’embouts de pipette stériles, composez les volumes jusqu’à 10 ml (dans chacun) avec le même milieu. Centrifuger les suspensions pendant 10 min à 3 200 × g et RT et éliminer les surnageants. Répétez cette étape une fois de plus.
        REMARQUE : L’étape ci-dessus reste la même pour les cultures Mtb.
      3. Remettre en suspension les cellules Msm lavées deux fois dans 20 ml (chacune) de Sauton préchauffées (préchauffées dans un incubateur à plaques ou à agitateur) et mesurer la densité optique des cellules à 600 nm. Inoculer le volume requis de cultures Msm dans des erlenmeyers stériles de 1 L contenant ~330 mL de Sauton stérile de sorte que le diamètre extérieur final de600 soit de ~0,05.
        REMARQUE : Les resuspensions doivent toujours commencer dans un petit volume. Si le volume final est directement ajouté à la pastille en une seule étape, les cellules resteront sous forme de pastilles diffuses (un indicateur d’une mauvaise remise en suspension). La seule façon de résoudre le problème est de faire tourner les cultures vers le bas et de refaire la suspension comme recommandé. L’étape ci-dessus reste la même pour les cultures Mtb.
    3. Jour 2/3
      1. Incuber la culture de 330 mL dans l’agitateur de l’incubateur à 200 tr/min et à 37 °C jusqu’à ce que le diamètre extérieur de la culture600 atteigne ~0,3. Ensuite, lavez les cellules une fois (comme à l’étape 1.2.2.2 mais avec un volume égal), puis remettez la pastille en suspension dans le même volume. Répartir 50 mL des cultures remises en suspension chacune dans six erlenmeyers stériles de 1 L, contenant chacun 280 mL de Sauton stérile préchauffé avec 1/10ème de Tween-80 normalement utilisé (0,05 %) soit 0,005 % (voir également la note de l’étape 2.2.1.3. pour comprendre pourquoi 1/10ème). Le diamètre extérieur final de600 doit être d’environ 0,05.
        REMARQUE : Pour les cultures Mtb, au lieu de flacons Erlenmeyer, utilisez des bouteilles à rouleau (d’une capacité de 1/2/4 L). Ajustez le volume de culture par bouteille de manière à ce que, lorsqu’elle est conservée sur l’appareil à rouleaux, la culture n’atteigne pas l’embouchure de la bouteille. Le volume réel de la bouteille à rouleau dépendra de la capacité de la bouteille à rouleau.
      2. Incuber chacune des cultures de 330 mL dans l’agitateur de l’incubateur à 200 tr/min et à 37 °C jusqu’à ce que la DO600 atteigne 2,0 à 2,5 (~15-18 h).
        REMARQUE : Pour les cultures Mtb, assurez-vous que le diamètre extérieur final600 est de ~1,0-1,2 (prend ~5-8 jours).

2. Enrichissement des mEV Msm par l’utilisation de la centrifugation à gradient de densité

  1. Jour 4
    1. Centrifuger les ~2 L de cultures Msm au stade exponentiel moyen dans 6 flacons à centrifuger stériles de 400 ml à 4 °C pendant 20 min à ~8 000 × g (centrifugeuse au sol). Recueillir le surnageant de milieux usés ou de culture dans deux erlenmeyers de 1 L pré-réfrigérés et autoclavés et conserver une aliquote de la pastille pour toute procédure d’analyse (telle que le SDS-PAGE et le western blot - non détaillé ici).
      REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées à froid (~ 4 °C) pour mieux maintenir l’intégrité des mEV. Les mEV sont assez stables à RT, mais la réfrigération est indispensable pour une stabilité à long terme (la congélation et la décongélation répétées ne sont pas recommandées). Au cours de la croissance de la culture axénique, les mEV se dissocient de la surface du MSM/Mtb et s’accumulent dans le surnageant de culture/milieu épuisé.
    2. Filtrer le surnageant de culture Msm d’abord à travers la ou les unités de filtration d’élimination de 0,45 μm, puis à travers l’unité de filtration d’élimination de 0,22 μm pour éliminer toute trace de bactéries.
      REMARQUE : La filtration directe à travers les filtres de 0,22 μm étouffe souvent les unités de filtration (car la pastille bactérienne peut être perturbée lors de l’exécution de l’étape 2.1.1.). Pour générer des surnageants de culture de Mtb, effectuer trois filtrations de cultures de Mtb (c’est-à-dire la première étape de filtration avec une unité de filtration jetable de 0,45 μm ; deux étapes de filtration consécutives avec des unités de filtration jetables de 0,22 μm) avant de déplacer les filtrats de culture dans des réglages BSL-2.
  2. Jour 4/5
    1. Utilisez les concentrateurs à membrane de 30 kDa pour concentrer le filtrat de culture Msm (~2 L) jusqu’à ~ 38 mL en centrifugeant le filtrat de culture à 4 °C, 20 min et à 3 200 × g.
      1. Prélavez d’abord les concentrateurs avec de l’eau froide stérile (~15 mL) (laver à 4 °C, 5 min et à 3 200 × g).
      2. Laver avec ~15 mL de Sauton’s préfiltré et froid (mêmes conditions que pour l’eau (2.2.1.1.)) pour éliminer toute trace de produits chimiques (utilisés lors de la fabrication).
      3. Étant donné que ~130 centricons (si une seule utilisation) sont techniquement nécessaires pour concentrer ~2 L de filtrat de culture, réutilisez les centricons au moins 3 à 4 fois si nécessaire. Suivez ces étapes : concentrez 15 mL à 0,5 à 1,0 mL (suivez l’étape 2.2.1), transférez le concentré dans un tube d’ultracentrifugation propre, autoclavé et froid de 38 mL, puis transférez à nouveau le filtrat de culture non concentré restant dans les centricons utilisés pour une concentration répétée.
        REMARQUE : L’utilisation de concentrateurs de 24 et 30 kDa pour concentrer 2 L de filtrat de culture peut prendre jusqu’à 6 h. Lors de la concentration du filtrat de culture, le Tween-80 se concentre également et peut bloquer le concentrateur. L’utilisation de Tween-80 à 0,005 % final (plutôt que 0,05 %) dans les milieux de Sauton permet d’éviter ce blocage. La concentration réduite de Tween-80 n’affecte pas la suspension uniforme de Msm pendant la croissance et ne provoque pas d’agglutination des cellules Msm. Cependant, comme les cellules Mtb s’agglutinent à 0,005 % Tween-80, utilisez 0,05 % Tween-80 pour les VE spécifiques à Mtb.
    2. Transvaser le filtrat de culture concentré de Msm (~38 ml) dans un tube à centrifuger en polypropylène propre, lavé (avec ddw) et pré-refroidi de 40 à 50 mL et le soumettre à une centrifugation en deux étapes, d’abord à 4 000 × g, puis à 15 000 × g, les deux étapes à 4 °C pendant 20 minutes (pour éliminer tous les débris). Utilisez une centrifugeuse au sol pour la même chose.
  3. Jour 5/6
    1. Transvaser le surnageant de culture dans un tube à ultracentrifuger en polypropylène pré-réfrigéré de 38,5 mL et le faire tourner dans une ultracentrifugeuse à 100 000 × g pendant 4 h à 4 °C.
      REMARQUE : Un godet pivotant fonctionne mieux à cette vitesse. Assurez-vous de remplir le tube d’ultracentrifugation à ras bord et d’avoir un tube d’ultracentrifugeuse d’équilibre de poids équivalent. Si l’un des tubes est collé au godet pivotant après la centrifugation (ce qui se produit en raison de la condensation), à l’aide d’une pince, retirez-le doucement du rotor. L’essuyage de l’humidité condensée présente sur la surface extérieure de l’ultracentrifugeuse avant l’ultracentrifugation empêche le collage.
    2. Conservez le surnageant dans un tube préréfrigéré de 50 ml (voir note). Retournez le tube de l’ultracentrifugeuse sur un papier absorbant frais non pelucheux pour éliminer les traces du surnageant. Remettre le granulé en suspension dans 600 μL de solution tampon HEPES (50 mM HEPES et 150 mM NaCl, pH 7,4 ; filtrer-stériliser avant utilisation).
      REMARQUE : Enregistrez le surnageant uniquement en tant que sauvegarde. La pastille mEV native se présente sous la forme d’une tache gélatineuse de 5 à 7 mm de diamètre, jaune grisâtre terne à translucide. Si aucune pastille n’est visible, répétez l’étape 2.3.1 en réutilisant le surnageant enregistré. Si aucune pastille n’apparaît après avoir répété l’étape 2.3.1, jetez-la et recommencez à partir de l’étape 1.2. La pastille prend du temps à se remettre en suspension. Il est recommandé d’ajouter le tampon HEPES et de le laisser toute la nuit à 4 °C pour faciliter la remise en suspension. Remettre en suspension doucement, mais avec des pipetages répétés (utiliser des embouts P200 pour une meilleure remise en suspension) jusqu’à ce que la remise en suspension soit uniforme.
  4. Jour 6
    1. Soumettre la pastille remise en suspension à une centrifugation à gradient de densité à base d’iodixanol.
      1. Étalez la pastille remise en suspension au fond du tube d’ultracentrifugation en polypropylène ultra-clair de 13 mL propre, lavé (avec ddw) et pré-refroidi et mélangez doucement (utilisez une pipette de 1 mL) avec ~4 mL de solution d’iodixanol à gradient de densité inerte (disponible dans le commerce sous forme de solution à ~60 % p/v). Après avoir superposé la pastille remise en suspension au fond du tube (jusqu’à un maximum de 5 mL), recouvrir de 1 mL (p/v) de sous-stocks de 40 %, 30 %, 20 % et 10 % de 'iodixanol' dans l’ordre respectif (préparer les sous-stocks (avec tampon HEPES) à partir de 60 % de stock). Ensuite, ajoutez 4 mL de sous-stock à 6 % (préparé à partir de 60 % de bouillon avec tampon HEPES) en haut pour remplir le tube.
        REMARQUE : Préparez le dégradé juste avant l’utilisation ; Ne jamais stocker et utiliser.
      2. Pesez soigneusement (sans secouer) le tube dans un bécher en verre et transférez-le doucement dans le rotor à godets oscillants.
        REMARQUE : La pesée est nécessaire pour équilibrer avec un tube factice (également pesé).
      3. Soumettez-le à l’ultracentrifugation à 141 000 × g pendant 16 h à 4 °C.
  5. Jour 7
    1. Retirez délicatement le tube (voir la note de l’étape 2.3.1) et prélevez des fractions de 1 mL dans des tubes de microcentrifugation fraîchement autoclavés ; faites attention aux fractions 4à 6, qui contiennent généralement les mEV Msm.
      REMARQUE : Les mEV de ces fractions se fractionnent normalement en trois ou quatre bandes de mEVs (l’une est la bande principale) qui sont de couleur blanc terne. Les R-mEVs contenant mCherry se fractionnent dans les 5 e à 7e fractions et apparaissent violet foncé à magenta. Les véhicules électriques VTT se fractionnent généralement en 5à 7e fraction. La séparation des mEV dans le gradient dépend de la concentration de gradient utilisée et de la qualité de la couche du gradient. Si les mEV se rompent partiellement, ils peuvent se fractionner en fractions antérieures. Alternativement, si la pastille obtenue après l’étape 2.3.2 n’est pas bien remise en suspension, les vésicules forment des micropastilles denses qui se fractionnent sous forme de fractions ultérieures. Nous recommandons une collecte précise des fractions uniquement lorsque l’utilisateur souhaite évaluer laquelle des fractions de 1 mL contient les mEV. Les utilisateurs peuvent souhaiter aliquoter en fractions plus ou moins grandes en fonction de leur convenance. Lorsque nous les utilisons pour certaines applications, par exemple, en les testant en tant que rappel potentiel d’un vaccin sous-unitaire au BCG, nous limitons notre collecte des mEV à moins de 250 μL des fractions (où les mEV se fractionnent) afin de ne pouvoir collecter spécifiquement que les bandes et traiter les mEV comme indiqué en 2.7.5. Cela permet d’éliminer plus efficacement toutes les traces d’iodixanol qui pourraient interférer avec nos expériences en aval.
  6. Jour 8
    1. Regrouper les fractions contenant des mEVs, diluer avec un tampon HEPES à 38 mL et répéter l’ultracentrifugation à 4 °C pendant 16 h à 100 000 × g. Remettre la pastille en suspension (comme à l’étape 2.3.2 avec les mêmes précautions) soit dans un tampon HEPES, soit dans un tampon que les expériences en aval (non détaillées ici) telles que l’estimation des protéines, les analyses de nano-suivi, la coloration négative, la microscopie électronique à transmission, le transfert Western et le marquage immuno-or nécessitent.
      REMARQUE : Pour une meilleure remise en suspension, sonnez le tube contenant du mEV pendant 10 minutes à l’aide d’un sonicateur à bain-marie à ultrasons. La sonisation pendant une période plus longue peut provoquer la rupture et la perte de mEV intacts. S’il est bien suspendu, la sonication n’est pas nécessaire. Toutes les étapes de 2.1 à 2.6 sont identiques tout en enrichissant les VE générés par le VTT.

3. Construction et enrichissement de mEVs recombinants.

NOTE : L’une des 10 protéines les plus abondantes (identifiées par spectrométrie de masse) des VE Msm est Cfp-2930. Compte tenu de sa petite taille (29 kDa), de sa structure secondaire simple 40, de sa localisation dans la membrane 41 et de sa propension à être sécrété dans les milieux épuisés dans les cultures axéniques (par exemple, en tant que protéine de filtrat de culture ; sécrétée à la fois par Msm et Mtb42,43, ici, elle a été exploitée pour délivrer un rapporteur fluorescent rouge et une protéine d’intérêt (EsxAMtb) dans les mEVs. Pour y parvenir,

  1. Utiliser des amorces directes et inverses appropriées (Tableau 1 ; compatibles avec le clonage direct dans un vecteur navette tel que pMV261) pour amplifier le cfp-29 à partir de Msm. En utilisant ~50 ng d’ADN génomique Msm de haut poids moléculaire (~>20 kb) comme modèle, la PCR amplifie le fragment du gène cfp-29 avec une ADN polymérase de relecture haute fidélité (telle que Phusion ou Q5). Suivez les recommandations du fabricant pour la PCR.
    REMARQUE : Concevez les sites de restriction nécessaires en amorces pour faciliter le clonage dans n’importe quel autre vecteur de navette d’intérêt. Les conditions et le volume de la PCR varient en fonction du type et de la marque de l’ADN polymérase de relecture utilisée. Le volume du mélange réactionnel varie en fonction de la quantité de matrice d’ADN et de la quantité d’ADN polymérase relusée. Suivez les recommandations du fabricant pour les conditions de PCR, le succès de l’amplification et l’élimination du recuit non spécifique des amorces.
  2. La PCR purifie l’amplicon élué avec n’importe quel kit de purification PCR disponible dans le commerce et vérifie la longueur de l’amplicon par électrophorèse sur gel d’agarose standard. Digérer l’amplicon purifié.
    1. Estimez la quantité d’amplicon purifié à l’aide d’un spectrophotomètre. Utilisez au moins 2 μg d’amplicon cfp-29 pour la digestion.
    2. Digérer d’abord avec BstB1 à 65 °C pendant 1 h (type et quantité de tampon et d’enzyme - selon les recommandations du fabricant), ramener la température de réaction à RT, puis digérer avec HindIII pendant 1 h à 37 °C (type et quantité de tampon et d’enzyme - selon les recommandations du fabricant).
    3. La PCR purifie et élue l’amplicon digéré dans 50 μL de ddw sans nucléase autoclavée.
    4. Estimer la concentration et le rendement de l’amplicon digéré à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver à -20 °C jusqu’à la mise en place de la ligature. REMARQUE : Après PCR, vérifier la longueur de l’amplicon (~798 + 50 pb) et le rendement en électrophoresant 10 μL du mélange de réaction PCR sur un gel d’agarose à 1%. Bien que la double digestion ne soit pas possible avec cette combinaison d’enzymes, un tampon compatible empêchera la purification répétée par PCR et la perte subséquente de l’amplicon digéré. La concentration d’amplicon digéré varie selon le kit utilisé pour la purification par PCR. Il varie également en fonction de la longueur (en pb) des vecteurs alternatifs de votre choix.
  3. Utiliser les amorces directes et inverses (Tableau 1), une relecture de l’ADN polymérase et ~50 ng d’ADN génomique Mtb, amplifier par PCR l’amplicon spécifique à l’étiquette FLAG esxA ou esxA-3X. Utilisez ~5 ng d’ADN plasmidique approprié pour amplifier mCherry par PCR. Les détails du plasmide et de la séquence se trouvent dans le fichier supplémentaire 1.
    REMARQUE : Utilisez un linker Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine 44,45(G4S) entre cfp-29 et mCherry/esxA/esxA-3X FLAG ; avant le démarrage de mCherry, le linker G4S aide mCherry à ne pas subir de plis non fonctionnels parasites (y compris ceux entraînés par Cfp-29). Reportez-vous aux séquences cfp-29, hsp60 promoter, mCherry et esxA dans le fichier supplémentaire 1. Les plasmides servant de modèles pour mCherry sont disponibles dans différents dépôts/banques de plasmides. Différentes versions (séquences légèrement modifiées) de mCherry sont disponibles qui nécessiteront des séquences d’amorçage avant et arrière modifiées. Les amorces (tableau 1) aident à amplifier le mCherry mentionné dans le fichier supplémentaire 1. La fusion de l’extrémité N de mCherry/esxA/esxA ::3XFLAG à l’extrémité C-terminale de Cfp-29 fonctionne bien.
  4. Digérer 1 μg d’ADN des amplicons mCherry/esxA/esxA ::3XFLAG et purifier l’ADN digéré.
    1. Digérer deux fois chaque amplicon avec HindIII et HpaI pendant 1 h à 37 °C (ou selon les recommandations du fabricant).
    2. Utilisez un kit de purification PCR disponible dans le commerce et les recommandations du fabricant pour purifier l’amplicon digéré. Éluer l’amplicon digéré dans 50 μL de ddw sans nucléase autoclavée.
    3. Estimer la concentration et le rendement de l’amplicon digéré à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver à -20 °C jusqu’à la mise en place de la ligature.
  5. Traiter 2 μg de pMV261-KanR (fichier supplémentaire 1) ou un vecteur de clonage approprié avec l’enzyme ou les enzymes de votre choix.
    1. Digérer d’abord avec BstB1 à 65 °C pendant 1 h (type et quantité de tampon et d’enzyme - selon les recommandations du fabricant), ramener la température de réaction à RT, puis digérer avec HindIII pendant 1 h à 37 °C (type et quantité de tampon et d’enzyme - selon les recommandations du fabricant).
    2. Gel purifiant et éluant dans 50 μL de ddw sans nucléase autoclavée.
    3. Estimez la concentration et le rendement du vecteur digéré à l’aide d’un spectrophotomètre. Conserver à -20 °C jusqu’à la mise en place de la ligature.
      REMARQUE : Le clonage en une étape à deux fragments est possible avec les amorces ci-dessus pour le pMV261. N’importe quel vecteur navette alternatif qui survit en tant qu’épisome fonctionnera. Les plasmides intégratifs fonctionneront également, mais le rendement en protéines recombinantes sera relativement inférieur par cellule.
  6. Mettez en relation et transformez-vous en une souche compatible d’E. coli.
    1. Pour la ligature, utilisez 125 ng du vecteur. Utilisez des amplicons mCherry/esxA/esxA ::3XFLAG correctement digérés dans un rapport molaire de 1 :3. Effectuer la ligase pendant la nuit à l’aide de T4 DNA Ligase (quantité conforme aux recommandations du fabricant) à 16 °C dans un bain-marie réfrigéré à circulation.
      REMARQUE : Utiliser des témoins appropriés, tels que le vecteur uniquement avec et sans T4 DNA Ligase, pour évaluer l’efficacité de la digestion et prédire l’efficacité du succès du clonage.
    2. Transformation
      1. Décongeler des aliquotes de cellules chimiquement compétentes NEB5α (~100 μL par transformation) sur de la glace pendant 15 min. Mélangez délicatement deux fois à l’aide d’un embout de pipette stérile. Ajouter le mélange de ligature (jusqu’à 20 μL) aux cellules froides compétentes.
      2. Mélangez délicatement les cellules de pipette + l’ADN ligaturé. Incubez le mélange sur de la glace pendant 30 minutes supplémentaires.
      3. Fournir un choc thermique à 42 °C (dans un bain-marie à circulation) pendant 60 s et transférer immédiatement sur la glace pendant 15 minutes supplémentaires.
      4. Récupérer les cellules transformées en ajoutant 1 mL de bouillon SOC (2 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 et 20 mM de glucose) et incuber à 37 °C pendant 1 h à 200 tr/min.
      5. Essorez les bactéries récupérées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (3000 × g, RT et 10 min), jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 200 μL de milieux LB stériles, préchauffés et fraîchement préparés, et étalez la suspension sur des plaques de gélose LB Miller fraîchement versées contenant les antibiotiques requis à des concentrations appropriées.
      6. Incuber les boîtes de Pétri dans un incubateur à plaques préréglé à 37 °C.
  7. Rechercher (non détaillé ici) les clones potentiels, vérifier (par PCR/enzymes de restriction de la colonie)46 et les séquencer (séquençage de Sanger) pour confirmer la fusion.
  8. Extraire l’ADN plasmidique (~200 ng/1-2 μL ; n’importe quel kit disponible dans le commerce) du clone confirmé (fond E. coli ) et le transformer en cellules électro-compétentes de Msm fraîchement fabriquées.
  9. Préparation de cellules électrocompétentes Msm
    1. Cultivez fraîchement Msm (comme dans les étapes 1.2.1 et 1.2.2). Lavez le Msm fraîchement cultivé comme aux étapes 1.3.3 et 1.3.4 (sauf qu’utilisez 7H9 + ADC + Tween-80 (riche) au lieu de Sauton).
    2. Ajouter une aliquote des cellules Msm lavées à un OD final de 600 de ~0,05 dans un erlenmeyer stérile de500 ml contenant 150 ml de milieux riches.
    3. Incuber dans l’agitateur de l’incubateur à 200 tr/min et 37 °C jusqu’à ce que le diamètre d’exposition de la culture600 atteigne ~0,8 à 1,0 (~12-14 h).
    4. Transférez la culture dans une bouteille à centrifuger préréfrigérée de 400 ml et incubez-la sur de la glace pendant 60 à 90 minutes. Ensuite, pelletez les cellules à 4 °C pendant 15 minutes à 4 000 × g.
    5. Lavez les cellules deux fois (chaque fois avec 150 ml, à 4 000 × g, 4 °C et 15 min) avec du glycérol à 10 % stérile (autoclavé) glacé.
      REMARQUE : À chaque lavage, le granulé se détache. Soyez prudent lorsque vous jetez le surnageant entier (après chaque lavage). Sinon, la majorité des cellules seront perdues dans le surnageant mis au rebut.
    6. Lavez les cellules une fois de plus avec 75 mL de glycérol stérile glacé à 10 % contenant 0,005 % de Tween-80.
    7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 7,5 mL de glycérol à 10 % avec 0,005 % de Tween-80 et l’aliquote dans des aliquotes de 400 μL.
      REMARQUE : Bien que les cellules électrocompétentes Msm soient compétentes pendant au moins 4 mois, les cellules électrocompétentes fraîchement préparées donnent les meilleurs résultats. Lors de l’utilisation de vieilles cellules compétentes, quelques colonies non roses (blanches) apparaissent comme de faux transformants. Plus les cellules compétentes sont anciennes, plus les colonies blanches sont nombreuses.
  10. Transformation de Msm
    1. Décongeler les cellules compétentes Msm aliquote sur de la glace.
      REMARQUE : La décongélation à RT et la transformation de ces cellules donnent moins d’efficacité.
    2. Ajouter 1 à 2 μL d’ADN plasmidique (~200 ng au total) aux cellules froides compétentes, mélanger doucement avec un embout de pipette stérile de 1 mL et transférer dans une cuvette d’électroporation stérile pré-refroidie de 2 mm.
    3. Transférez la cuvette fermée avec le mélange de cellules compétentes Msm + ADN plasmidique dans la souris de l’elctroporator, fermez doucement le couvercle et appliquez une impulsion (type de désintégration exponentielle) à 2,5 kV (tension), 25 μF (capacité) et 1000 Ω (résistance).
    4. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu riche stérile préchauffé (7H9 + ADC + Tween-80) dans la cuvette, mélanger délicatement avec un embout de pipette stérile de 1 mL et transférer tout le contenu dans un tube stérile de 10 mL.
    5. Incuber le contenu pendant 3 h dans un agitateur incubateur réglé à 37 °C et 200 tr/min. Essorer le contenu dans un tube de microcentrifugation (4 000 × g, RT et 10 min), jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 200 μL de milieu riche stérile préchauffé et étaler la suspension sur des plaques de gélose 7H11 fraîchement versées contenant de l’ADC, du Tween-80 et les antibiotiques requis à des concentrations appropriées.
      REMARQUE : Pour le Msm, si nécessaire, utiliser l’hygromycine, la kanamycine et l’apramycine aux concentrations finales de 50 μg/mL, 25 μg/mL et 50 μg/mL, respectivement. Le MSM en soi n’est PAS résistant à ces antibiotiques. N’utilisez ces antibiotiques que lorsque vous utilisez des plasmides avec les gènes de résistance appropriés pour la sélection/croissance de colonies de MSM transformantes/recombinantes.
    6. Incuber les boîtes de Pétri dans un incubateur à plaques préréglé à 37 °C. En règle générale, les transformants apparaissent entre 3 et5 jours.
      NOTE : Si une protéine d’intérêt est toxique pour le Msm, les transformants peuvent émerger plus tard ou ne pas émerger. Dans ce cas, clonez les versions tronquées de la longueur complète.
    7. Faire des stocks de glycérol des colonies émergentes de Msm après avoir vérifié la présence de clones positifs (comme à l’étape 3.7)
  11. Pour enrichir les R-mEVs contenant des protéines mCherry ou EsxA, cultivez d’abord R-Msm exprimant le FLAG mCherry ou exsA ou esxA ::3X en suivant les étapes 1.2.1 à 1.2.3, puis suivez les étapes 2.1 à 2.6. pour enrichir les R-mEVs. Les R-mEVs éluent dans les fractions 4 ème-7ème après le spin du gradient de densité (étape 2.5). Les pastilles R-mEVs après la première étape d’ultracentrifugation (2.3.1). Après avoir effectué la même chose qu’à l’étape 2.3.1, vérifiez que les R-mEV sont visibles sous la forme d’une pastille violet foncé à magenta de 5 à 7 mm de diamètre en bas au centre de l’ultracentrifugeuse.
  12. Effectuer des analyses occidentales47 (non détaillées ici) pour détecter la ou les protéines d’intérêt dans les R-mEVs enrichis.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous utilisons M. smegmatis (Msm) comme mycobactérie modèle pour démontrer l’enrichissement des mEVs natives et recombinantes (R-mEVs). Ce protocole d’enrichissement des mEVs résumé schématiquement (Figure 1) fonctionne également pour l’enrichissement des R-mEVs de Msm et des EVs natifs de Mtb (avec des modifications mineures comme dans les notes de protocole de 1.2). La visualisation des mEVs enrichis nécessite de les colorer négativement au microscope électronique à transmission

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étant donné que la mise au point d’un nouveau vaccin antituberculeux supérieur au BCG et capable de le remplacer reste un défi de taille, plusieurs groupes poursuivent la découverte de différents vaccins antituberculeux sous-unitaires capables d’augmenter la puissance du BCG et de prolonger sa durée de protection48,49. Compte tenu de l’attention croissante portée aux VE bactériennes (bEV) en tant que sous-unités potentielles et adjuvants naturels

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs déclarent que ce travail de recherche a été mené en l’absence de toute relation/intérêt commercial ou financier qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient sincèrement le professeur Sarah M. Fortune d’avoir aimablement partagé le stock de M. smegmatis mc2155. Ils remercient également Servier Medical Art (smart.servier.com) d’avoir fourni quelques éléments de base pour la figure 1. Ils remercient sincèrement le soutien des autres membres du laboratoire pour leurs ajustements patients pendant la longue utilisation des agitateurs d’incubateur, des centrifugeuses et des ultracentrifugeuses pour l’enrichissement en mEV. Ils remercient également M. Surjeet Yadav, l’assistant de laboratoire, de toujours s’assurer que la verrerie et les consommables nécessaires étaient toujours disponibles et à portée de main. Enfin, ils remercient les équipes administratives, d’achat et financières de THSTI pour leur soutien constant et leur aide dans la bonne exécution du projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Armoire de biosécurité de type A2Thermo Fisher Scientific, USASérie 1300
Centrifugeuse de paillasseEppendorf, USA5810 R
BstB1, HindIII, HpaINEB, USANEB
DensitomètreGE Healthcare, USAUltraspec 10
Acide citriqueSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
Phosphate de potassium dibasiqueSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
Eau double distilléeMerck, États-Unis~18,2 MW/cm @ 25 oC
Cuvettes d’électroporationBio-Rad, États-UnisÉlectroporateur de 2 mm
Bio-Rad, États-UnisÉlectroporateur
spécifique à EsxA AbAbcam, Royaume-UniLapin polyclonal
Citrate d’ammonium ferriqueSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
Centrifugeuse modèle au solThermo Fisher Scientific, États-UnisSorvall RC6 plus
VerrerieBorosil, INDE1 L Erlenmeyer flacons
GlycérolSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
HEPES et chlorurede sodiumSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
Agitateurs d’incubateurThermo Fisher Scientific, États-UnisMaxQ 6000 & 8000
L-AsparagineSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
Luria Bertani Bouillon et agar, MillerHi Media, INDIAHi Media
Sulfate de magnésium HeptahydrateSigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
Agitateur magnétiqueTarsons, INDETarsons
mCherry-specific AbAbcam, UKRabbit monoclonal
Micro-ondesLG, INDEMC3286BLT
Middlebrook 7H9 BrothBD, USADifco Middlebrook 7H9 Bouillon
Middlebrook ADC enrichmentBD, USABBL Middlebrook ADC enrichment
NanodropThermo Fisher Scientific, États-UnisSpectronic 200 UV-Vis
NEB5aNEB, États-Unisun dérivé de DH5a
Optiprep (Iodixanol)Merck, États-UnisDisponible sous forme de solution mère à 60 % (dans l’eau)
Kit de purification PCRHi Media, INDIAHi Media
PH-mètreMettler Toledo, États-UnisMettler Toledo
Mini kit d’ADN plasmidiqueHi Media, INDEIncubateur à
plaquesMedia Thermo Fisher Scientific, États-UnisNouvelle série
Plasmide pMV261Addgene, États-Unis *
*The  ;   ; plasmide  ;   ; est  ;   ; Non  ;   ; plus disponibles dans cette banque		Vecteur navette
Proof-reading DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific, USAPhusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA PolymeraseNEB, USANEB
Bain d’eau circulant réfrigéréThermo Fisher Scientific, USAR20
Middlebrock 7H11 Base de géloseBD, USABBL Seven H11 Agar base
SOC bouillonHi Media, INDIAHi Media
Sodium HydroxideSigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
T4 DNA LigaseNEB, USANEB
Tween-80Sigma-Aldrich, Merck, USASigma Aldrich
UltracentrifugeuseBeckman Coulter, USAOptima L100K
Tubes d’ultracentrifugation - 14 mLBeckman Coulter, États-UnisType polyallomère &ndash ; type ultra clair dans le rotor SW40Ti
Tubes d’ultracentrifugation - 38 mLBeckman Coulter, États-UnisType polypropylène&ndash ; type trouble pour rotor SW28
Sonicateur de nettoyage à bain d’eau par ultrasonsThermo Fisher Scientific, USASonicator - modèle de paillasse
0.22 & micro ; m Filtres jetablesThermo Fisher Scientific, États-UnisNunc-Nalgene
30-kDa Concentrateurs CentriconMerck, États-UnisFiltres ultra-centrifuges Amicon - Millipore
3X FLAGAnticorps Sigma-Aldrich, Merck, États-UnisSigma Aldrich
400 mL Flacons de centrifugationThermo Fisher Scientific, États-UnisNunc-Nalgene
50 mL Tubes àcentrifugerCorning, États-UnisStérile, préemballé
Bactéries
Souche<
em>Escherichia coliNEB, ÉTATS-UNISNEB 5-alpha (un dérivé de DH5&alpha ;).
Msm exprimant cfp29 ::mCherryCette étudeMC2  ; 155
Msm exprimant cfp29 ::esxACette étudeMC2  ; 155
Msm exprimant cfp29 ::esxA ::3X FLAGCette étudeMC2  ; 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)Prof. Sarah M. Fortune, Université Harvard, États-Unis  ; MC2  ; 155
cellulaire Hi de plasmides

Références

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Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 2/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Mots-clés

V sicules extracellulaires mycobact riennesVE recombinantesVE nativesMycobacterium smegmatisenrichissement des VEultracentrifugation sur gradient de densitVE bact riennesd livrance d EsxAfusion mCherrymicroscopie lectronique transmission

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