Le réseau d’anesthésie en série pour l’étude à haut débit d’agents volatils utilisant Drosophila melanogaster

L’existence d’effets anesthésiques collatéraux (c.-à-d. des effets qui ne sont pas immédiatement observables mais qui peuvent avoir des conséquences comportementales différées) est généralement admise, mais la compréhension de leurs mécanismes et facteurs de risque reste rudimentaire ^1,2. Leur manifestation tardive et leur subtilité limitent le nombre de variables potentiellement importantes qui peuvent être étudiées dans des modèles de mammifères dans des délais raisonnables et à un coût acceptable. La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) offre des avantages uniques dans le cadre de la maladie neurodégénérative³ et pour le dépistage toxicologique⁴ qui, à ce jour, n’ont pas été appliqués à l’étude des effets collatéraux anesthésiques.

Nous avons développé le réseau d’anesthésie en série (SAA) pour faciliter l’utilisation des mouches des fruits dans l’étude de la pharmacodynamique anesthésique et de la pharmacogénétique. Un avantage clé de la SAA est l’exposition simultanée à des conditions expérimentales identiques de plusieurs cohortes. Associé à la flexibilité expérimentale des mouches des fruits, le débit élevé de la SAA permet l’exploration de variables biologiques et environnementales à une échelle impossible dans les modèles de mammifères.

En principe, le SAA est simplement une série d’emplacements d’anesthésie connectés (chambres constituées de flacons de 50 mL) à travers lesquels un gaz porteur délivre des agents volatils. La première chambre du système contient de l’eau distillée à travers laquelle le gaz porteur est humidifié (les mouches sont sensibles à la déshydratation), et elle se termine par un simple indicateur de débit qui indique le flux de gaz à travers le système. De fins filets placés sur les ouvertures des tubes de raccordement séparent les chambres pour empêcher la migration des mouches entre les chambres. Le nombre d’emplacements « en série » est limité par la résistance à l’écoulement de gaz non pressurisé (tubes, filets).

Nous avons caractérisé la cinétique de ce prototype SAA dans une précédente publication⁵. Bien que les propriétés pharmacocinétiques exactes varient d’un AAS à l’autre, les bases pertinentes qui ont été testées expérimentalement sont les suivantes : (i) un débit initial de 1,5-2 L/min équilibre toutes les chambres (volume total de ±550 mL) avec la concentration souhaitée d’anesthésique en 2 minutes ; ii) la concentration de vapeur anesthésique délivrée dans les chambres ne change pas sensiblement entre le premier et le dernier emplacement parce que la quantité d’anesthésique contenue dans le volume de gaz dans une chambre individuelle (50 mL) dépasse de loin la quantité absorbée par un nombre quelconque de mouches; et (iii) une fois que les chambres sont équilibrées, le débit de gaz porteur peut être réduit (50-100 mL/min ou moins) pour éviter le gaspillage et la contamination de l’environnement (les anesthésiques volatils ont des propriétés de gaz à effet de serre). Le débit minimal nécessaire pour maintenir une concentration de vapeur à l’état d’équilibre dépend principalement de la fuite du SAA, car l’absorption de vapeur par les mouches est négligeable. Dans ces conditions standard (2 % d’isoflurane et débit de gaz porteur de 1,5 L/min), les mouches sont anesthésiées (c.-à-d. immobiles) dans toutes les positions du réseau en 3 à 4 minutes, avec des différences imperceptibles entre les positions. Les VGA peuvent être administrés pendant quelques minutes à quelques heures, et nos paradigmes d’exposition typiques sont compris entre 15 min et 2 h. Pour rincer le système, le vaporisateur est éteint et le débit est maintenu pour échanger environ 10x les volumes du réseau (1,5 L/min pendant 5 min). La vitesse d’élimination de l’anesthésique variera avec le débit défini.

Les agents anesthésiques volatils interagissent avec de nombreuses cibles encore non identifiées, y compris le système immuno-inflammatoire⁶. La contribution des cibles moléculaires individuelles aux résultats primaires par rapport aux résultats collatéraux (« l’état anesthésique » par rapport aux « effets secondaires » à long et à court terme) est mal comprise. Par conséquent, un système de mouches sensible et à haut débit est précieux pour éclairer les expériences sur les animaux supérieurs, malgré les différences évidentes entre les mouches et les mammifères⁷. Certaines différences peuvent, en fait, être avantageuses; Par exemple, le système immunitaire de la mouche diffère de celui des animaux supérieurs en ce qu’il lui manque le bras adaptatif de la réponse⁸. Bien que cela puisse sembler une limitation pour comprendre la maladie chez l’homme, cela offre une occasion unique d’étudier l’interaction des VGA avec la réponse immuno-inflammatoire innée indépendamment de la réponse adaptative⁹. Cela permet d’étudier les effets pharmacologiques de l’AGV sur l’inflammation et leur modulation par les antécédents génétiques variés présents dans une population.

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans le protocole.

1. Construction de la SAA

1. Fabriquez le cadre en coupant du bois et en assemblant le cadre en utilisant les dimensions de la figure 1A.
2. Modifier les capsules de tubes coniques de 50 mL.
   1. Percez deux trous dans chaque bouchon avec un foret de 9/32 po. Poncez les trous pour nettoyer le plastique déchiqueté. Poncez le haut du capuchon pour rendre la surface rugueuse (cela aide à l’adhérence de la colle).
   2. Couper 5 mL de pipettes sérologiques à la taille (3 po pour l’entrée et 1,5 po pour l’écoulement) en entaillant le plastique, puis en le cassant à la ligne de pointage. Poncer les extrémités des pipettes coupées/cassées.
   3. Collez le filet sur les tubes (laissez le temps de séchage approprié pour l’adhésif). Coupez le filet à la taille du tube après le séchage de l’adhésif.
   4. Insérez les tubes dans les trous des bouchons coniques avec les deux tubes s’étendant (3/4 po) au-dessus du bouchon; s’assurer que le tube d’entrée s’étend plus longtemps dans le tube que le tube sortant (figure 1B).
   5. Appliquez de la colle sur le dessus des bouchons autour des tubes pour fixer les pièces ensemble (laisser sécher l’adhésif avant de continuer).
3. Fixez les capuchons au cadre et acheminez le tube (Figure 1C).
   1. Fixez les attaches de câble adhésif au cadre (3,25 po d’écart, centre à centre).
   2. Fixez les bouchons sur le cadre à l’aide de liens zippés; Coupez les extrémités courtes de l’étiquette de cravate zippée.
   3. Couper et raccorder les longueurs (9 po) des tubes Tygon aux tubes d’entrée/sortie de chaque bouchon modifié (figure 1D). En commençant par l’extrémité en amont, fixez d’abord à l’entrée, puis fixez ensuite le tube de l’écoulement sortant à l’entrée de la position suivante.
   4. Ajouter un indicateur de débit au « débit entrant » le plus en aval (position 10, figure 1E).
   5. Placez un tube conique de 50 mL en première position et remplissez-le d’eau juste en dessous du tube d’entrée (figure 1F).
4. Préparez l’interface pour le vaporisateur. Retirez les pistons, découpez les encoches de deux seringues distributrices de 10 ml (1/2 po de profondeur x 1/4 po de largeur, Figure 1G) et insérez-les dans le flux entrant et sortant du vaporisateur, les encoches étant tournées directement vers l’avant du vaporisateur pour les aligner avec les trous (Figure 1H). Facultatif : Collez les seringues modifiées en place. Si c’est abordable, utilisez un collecteur commercial (voir le tableau des matériaux pour une option).
5. Branchez l’ensemble du système. Utilisez le tube Tygon pour fixer les composants ensemble dans l’ordre suivant : réservoir de gaz porteur avec régulateur > débitmètre spécifique au gaz > vaporisateur > SAA (Figure 1C).
6. Remplissez les positions vides sur le réseau avec des tubes coniques vides de 50 mL. Allumez le réservoir d’essence, ouvrez le débitmètre à ~2 L/min et allumez le vaporisateur à 0%. Confirmez le débit de gaz à travers le système en vérifiant le débitmètre en amont du vaporisateur et l’indicateur de débit en aval de la dernière chambre de la SAA pour le débit. Vous pouvez également insérer l’extrémité du tube en aval dans l’eau et rechercher des bulles.
   REMARQUE: Comme le système n’est pas sous pression, une colonne d’eau de plus de quelques centimètres arrêtera l’écoulement. S’il n’y a pas d’écoulement à l’extrémité aval du réseau, vérifiez les points suivants : le vaporisateur doit être allumé pour permettre l’écoulement ; vérifier que le régulateur de réservoir et les débitmètres permettent le débit; vérifier les positions des matrices pour s’assurer que les tubes sont bien vissés; et vérifier s’il y a des fuites autour de l’adhésif sur les bouchons modifiés.

Figure 1 : Construction de la SAA. (A) Schéma, avec mesures, du cadre en bois qui supporte le SAA. (B) Coupe transversale schématisée, avec mesures, d’un bouchon modifié avec tubes d’entrée et de sortie constitués de pipettes sérologiques de 5 mL. (C) SAA assemblé (reproduit d’après Olufs et ^coll.5) (D) Détails d’un bouchon conique modifié de 50 mL montrant les tubes d’entrée et de sortie. E) Débit sortant en aval (position 10) avec l’indicateur de débit. F) Tube rempli d’eau en amont (position 1) pour humidifier le gaz vecteur. La flèche rouge indique le niveau d’eau. (G) Seringue de distribution modifiée de 10 mL pour le collecteur de fortune. Le cercle rouge met en évidence l’encoche de découpe située entre les marques de 8 ml et de 10 ml (ou 1/2 po x 1/4 po). H) Vue arrière du vaporisateur Tec7 montrant l’insertion et l’orientation des seringues modifiées. Une seule seringue est en place dans cette vue pour montrer, à gauche, le trou (flèche rouge) qui doit être aligné avec l’encoche de la seringue modifiée. Remarque : Un désalignement de cette encoche de découpe et de l’ouverture de sortie perturbera l’administration de l’anesthésique. Cette partie est un point faible potentiel dans ce système sur mesure. Si des fonds sont disponibles, un collecteur commercial devrait être utilisé. Abréviation : SAA = réseau d’anesthésie en série. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Avant l’exposition anesthésique

1. Vingt-quatre heures ou plus avant l’exposition anesthésique, trier les cohortes de mouches au besoin pour l’expérience en utilisant la méthode préférée (p. ex. CO₂ ou éther).

3. Fonctionnement de l’ASA

1. Transvaser les mouches des flacons alimentaires dans des tubes coniques vides de 50 ml (sans CO₂).
   1. Compter et noter toutes les mouches mortes avant l’exposition.
2. Déboucher et visser des tubes coniques de 50 ml avec des mouches sur le SAA.
3. Allumez le gaz porteur et réglez le débit souhaité.
   REMARQUE: Nous utilisons généralement 1-2 L / min.
4. Réglez le vaporisateur anesthésique à la concentration souhaitée.
   NOTE: Nous utilisons généralement 2% pour l’isoflurane et 3,5% pour le sévoflurane, qui sont des doses équipotentes chez les mammifères¹⁰.
5. Exposez les mouches pendant la durée souhaitée (min: 15 min).
   NOTE: Un temps d’exposition minimum de 15 minutes est recommandé pour éviter une éventuelle variabilité de l’équilibrage entre les positions du SAA. Dans ce système, il faut 2 à 3 minutes pour que les anesthésiques s’équilibrent dans toutes les positions.
6. À la fin de l’exposition, rincer le système avec un débit de gaz frais (vaporisateur réglé à 0%) à 1,5 L/min pendant 5 min correspondant à environ 10x les volumes du volume total de SAA.

4. Liste de contrôle avant de commencer une expérience

1. Ouvrez complètement le régulateur haute pression (sur le dessus du réservoir d’air), puis fermez-le un demi-tour pour assurer le débit du gaz vecteur.
2. Suivez les tubes pour chaque ligne jusqu’aux i) débitmètres et ii) vaporisateur (assurez-vous que les flux entrants / sortants sont correctement connectés), et iii) vérifiez le niveau d’anesthésie dans les vaporisateurs.
3. Après avoir chargé les chambres avec des sujets, vérifiez que l’air/gaz circule avec le test de bulle ou l’indicateur de débit.
   REMARQUE: Certains vaporisateurs ne permettent pas la circulation de l’air lorsque le cadran est en position d’arrêt.
4. Lorsque le gaz circule, confirmez que le débitmètre et l’indicateur de débit en aval indiquent le débit.
5. À la fin de l’expérience, prévoyez 4 à 5 minutes de débit d’air pour éliminer l’anesthésique.

Un lien vidéo SAA est fourni ici: Perouansky Research Methods - Department of Anesthesiology - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Notre laboratoire a utilisé la SAA pour (i) étudier l’effet du génotype sur la sensibilité comportementale aux anesthésiques5; ii) dépister les effets collatéraux des anesthésiques chez les mutants mitochondriaux11; et (iii) étudier la pharmacodynamique de l’isoflurane et du sévoflurane sur les résultats des lésions cérébrales traumatiques (TCC)12,13,14,15,16,17. Les résultats publiés démontrent clairement que le fond génétique influence la pharmacodynamique des VGA utilisés cliniquement en ce qui concerne à la fois le phénotype conventionnel de l’anesthésie et les effets collatéraux de la toxicité anesthésique, ainsi que la protection tissulaire 5,11,13,14,15.

Exemple représentatif 1 (Figure 2) : Dérive génétique de la résilience à la toxicité de l’isoflurane détectée par des conditions expérimentales reproductibles fiables
La découverte d’un changement quantitatif progressif de la mortalité induite par l’AGV chez les mouches ND2360114 cultivées séparément est un exemple de l’utilité de comparaisons fiables de la pharmacodynamique anesthésique entre les groupes expérimentaux utilisant le SAA. ND23 est un gène codant pour une sous-unité au cœur du complexe I du mETC (analogue à Ndufs8 chez les mammifères)18. Les mutations dans cette sous-unité sont une cause du syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle. Nous avons observé un affaiblissement progressif du phénotype de mortalité induite par l’isoflurane au fil du temps dans divers stocks homozygotes ND2360114 cultivés simultanément dans des conditions de laboratoire standard (c.-à-d. sans exposition aux VGA). Cette adaptation évolutive à la toxicité isoflurane s’est produite en l’absence de toute exposition aux VGA et est probablement un effet collatéral de la « survie du plus apte » au sein des stocks mutants. Ce changement graduel de la sensibilité à l’isoflurane serait resté inconnu sans notre confiance que les conditions expérimentales étaient identiques d’un essai à l’autre et au fil du temps. Nous concluons que la sélection favorise les modificateurs des effets de ND2360114, avec par coïncidence une résilience accrue à la toxicité de l’isoflurane. Comme l’inflammation du système nerveux central joue un rôle important dans la pathogenèse du syndrome de Leigh, l’évolution observée de la résistance peut être due à des changements adaptatifs dans la réponse immuno-inflammatoire innée, la résistance à la toxicité isoflurane étant un sous-produit accidentel.

Figure 2 : Variation de la mortalité induite par la toxicité de l’isoflurane à la suite de la pression évolutive chez les mouches ND2360114. Sept lignées (A-G) isolées d’une seule population par des accouplements à une paire, élargies et testées pour la mortalité sur 24 h (PM24) après une exposition de 2 heures à 2 % d’isoflurane (à l’âge de 10-13 jours) montrent une variabilité du phénotype provenant d’une seule population. Données présentées sous forme de diagrammes en boîtes et en moustaches. Les cases représentent les deuxième et troisième quartiles des données, les moustaches s’étendant jusqu’aux points de données minimum et maximum. La moyenne et la médiane sont indiquées respectivement par « + » et horizontales. Le pourcentage de mortalité des répliques individuelles (N) est représenté sous forme de cercles. N = 3-4 flacons de 20-50 mouches/flacon. Valeur de p pour une ANOVA unidirectionnelle ordinaire; p = 0,012 indique une différence significative entre les moyennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Exemple représentatif 2 (Figure 3) : Illustration d’une application à haut débit du SAA pour révéler les effets génétiques de base sur la pharmacodynamique de l’isoflurane
À titre d’exemple du débit élevé du système, la figure 3 illustre les effets d’expositions identiques à l’isoflurane (15 min d’isoflurane à 2 %) avant une lésion cérébrale traumatique (TCC)16, un protocole testant le préconditionnement anesthésique (AP) dans ce modèlede mouche 13,15,19. La lecture est la mortalité 24 heures après le TCC corrigé de l’attrition naturelle (IM24). Dans ce modèle, toutes les mouches ont retrouvé leur mobilité (c.-à-d. qu’elles étaient vivantes) dans les 30 minutes suivant le TCC, et la mortalité enregistrée dans l’IM24 était le résultat d’une lésion cérébrale secondaire (sBI). Dans les quatre lignées de mouches, l’AP avec de l’isoflurane a réduit le MI24 à divers degrés, indiquant que la réactivité à l’AP est un trait quantitatif. Comme la réponse inflammatoire est un facteur important de morbidité due à l’IBS, l’AP peut impliquer une modulation du système immunitaire20.

Figure 3 : Influence du fond génétique sur la suppression de la mortalité (IM24) par préconditionnement à l’isoflurane. Les mouches de préconditionnement avec 15 min d’isoflurane à 2% (violet) ont réduit l’indice de mortalité à 24 h (MI24) chez les souches w 1118 et y1w1118 (p < 0,0001 et p = 0,036, respectivement). Le MI 24 n’était pas significativement plus faible dans les raies préconditionnées Oregon R (OR) et Canton S (CS) (p = 0,16 et p =0,27, respectivement). Données présentées sous forme de diagrammes en boîtes et en moustaches. Les cases représentent les deuxième et troisième quartiles des données, les moustaches s’étendant jusqu’aux points de données minimum et maximum. La moyenne et la médiane sont indiquées respectivement par « + » et horizontales. Les valeurs MI24 des répliques individuelles (N) sont indiquées sous forme de cercles. N = 15-33 flacons de 30-40 mouches/flacon pour les mouches traitées par TBI. N = 2 à 15 flacons de 30 à 40 mouches/flacon pour les témoins non traités. Valeurs p d’un test t de Student bilatéral non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.