Formulation et caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques

Summary

Nous décrivons ici la production et la caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques. Les nanodisques d’amphotéricine B sont pris comme exemple pour décrire le protocole de manière progressive.

Abstract

Le terme nanodisque fait référence à un type discret de nanoparticule composé d’un lipide formant une bicouche, d’une protéine d’échafaudage et d’un agent bioactif intégré. Les nanodisques sont organisés comme une bicouche lipidique en forme de disque dont le périmètre est circonscrit par la protéine d’échafaudage, généralement un membre de la famille des apolipoprotéines échangeables. De nombreux agents bioactifs hydrophobes ont été efficacement solubilisés dans des nanodisques par leur intégration dans le milieu hydrophobe de la bicouche lipidique de la particule, ce qui donne une population largement homogène de particules de l’ordre de 10 à 20 nm de diamètre. La formulation de nanodisques nécessite un rapport précis de composants individuels, une addition séquentielle appropriée de chaque composant, suivie d’une sonication en bain du mélange de formulation. La protéine d’échafaudage amphipathique entre spontanément en contact et réorganise le mélange bicouche dispersé formant des lipides et des agents bioactifs pour former une population discrète et homogène de particules de nanodisques. Au cours de ce processus, le mélange réactionnel passe d’un aspect opaque et trouble à un échantillon clarifié qui, lorsqu’il est entièrement optimisé, ne produit aucun précipité lors de la centrifugation. Les études de caractérisation comprennent la détermination de l’efficacité de la solubilisation des agents bioactifs, la microscopie électronique, la chromatographie par filtration sur gel, la spectroscopie d’absorbance ultraviolette visible (UV/Vis) et/ou la spectroscopie de fluorescence. Ceci est normalement suivi d’une étude de l’activité biologique utilisant des cellules ou des souris en culture. Dans le cas des nanodisques hébergeant un antibiotique (c.-à-d. l’amphotéricine B antibiotique polyène macrolide), leur capacité à inhiber la croissance de levures ou de champignons en fonction de la concentration ou du temps peut être mesurée. La relative facilité de formulation, la polyvalence en ce qui concerne les composants, la taille des particules à l’échelle nanométrique, la stabilité inhérente et la solubilité aqueuse permettent une myriade d’applications in vitro et in vivo de la technologie des nanodisques. Dans le présent article, nous décrivons une méthodologie générale pour formuler et caractériser les nanodisques contenant de l’amphotéricine B en tant qu’agent bioactif hydrophobe.

Introduction

Les lipoprotéines discoïdales naissantes de haute densité (HDL) sont des progéniteurs naturels du HDL sphérique beaucoup plus abondant présent dans le système circulatoire humain. Ces particules naissantes, également appelées pré-ß HDL, possèdent des propriétés structurelles uniques et distinctives¹. En effet, plutôt que d’exister sous forme de particule sphéroïdale, les HDL naissants sont en forme de disque. Des études approfondies de caractérisation structurale sur les HDL discoïdaux naturels et reconstitués ont révélé qu’ils sont constitués d’une bicouche phospholipide dont le périmètre est circonscrit par une apolipoprotéine échangeable amp....

Protocol

1. Transformation, expression et purification du composant protéique d’échafaudage

1. Transformation bactérienne BL21 avec plasmide contenant de l’apoE4-NT
   1. Décongeler un tube de cellules compétentes BL21 (DE3) sur de la glace pendant 10 min.
   2. Une fois que toute la glace a fondu, mélanger doucement et soigneusement pipeter 50 μL des cellules dans un tube de transformation sur de la glace.
   3. Ajouter 5 μL contenant 50 ng d’ADN plasmidique (pour la séquence, voir le tableau supplémentaire 1) au mélange cellulaire. Agitez soigneusement le tube quatre ou cinq fois pour mélanger. Ne pas vortex.
   4. Pla....

Results

Procédé de formulation de nanodisques d’agent bioactif
Dans la procédure de formulation ampB-nanodisque décrite, la réaction est considérée comme terminée lorsque l’aspect de l’échantillon passe de trouble à clair (Figure 1). Ce changement indique que des nanodisques se sont formés et que l’agent bioactif a été solubilisé. Souvent, les agents bioactifs absorbent la lumière dans la région de longueur d’onde visible (par exemple, ampB, curcumine, lutéine, coenzyme Q_10<.......

Discussion

La formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques fournit une méthode pratique pour solubiliser des composés hydrophobes autrement insolubles. Étant donné que les nanodisques d’agents bioactifs du produit sont entièrement solubles dans les milieux aqueux, ils constituent une méthode d’administration utile pour un large éventail de molécules hydrophobes (tableau 1). Il s’agit notamment des petites molécules, des drogues naturelles et synthétiques, des phytonutriments, des hormones, etc. La stra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotéricine B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Préparation standard
Ampicilline	Fisher	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmide	GenScript	N/A	Transformation
Fiole à chicanes	Nouveau-Brunswick Scientific N	/A	Expansion & Expression
BL21 compétent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifugeuse flacons	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flacon	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Essai de viabilité de la levure
Tubes borosilicatés en verre	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Logiciel)	Dotmatics	N/A	Essai de viabilité de la levure
Bain de sonication chauffé	VWR	N/A	ND Formulaton
Module de chauffage et d’azote	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Héparine HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside  ;	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifugeuse	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophiliseur	Labconco	7755030	Formulation ND
Méthanol Fisher	Scientific	A452-4	Formulation ND
Azote gazeux	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM média	RPI Produits de recherche	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vecteur	GenScript	N/A
Transformation Boîte de Pétri	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation &
Expansion Quartz	Cuvettes Fisher Brand	14385 928A	Analyse spectrale
Incubateur à secousses	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Bouées	Thermo Scientific	66430
Purification SnakeSkin Tube de dialyse	Thermo Scientific	68100
Purification SnakeSkin Tube de dialyse	Thermo Scientific	88243
Purification Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S271
Purification Phosphate de sodium dibasique	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Phosphate de sodium monobasique	Fisher Scientific	BP329-500	Spectres de purification
/POR Fermetures pondérées	Spectrum Medical Industries	132736
Spectrophotomètre	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	Analyse spectrale
Centrifugeuse de table	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Logiciel)	Shimadzu	N/A	Analyse spectrale
Filtre à vide	Millipore	9004-70-0	Expression & Pompe à vide de purification
	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression &
Purification Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Levure	N/A	BY4741	Essai de viabilité de la levure
Extrait de levure-Peptone-Dextrose	BD	242820	Essai de viabilité de la levure