Ici, nous proposons un protocole pour l’administration intratrachéale de lipopolysaccharides (LPS) via une intubation endotrachéale oropharyngée non invasive. Cette méthode minimise le traumatisme de l’intervention chirurgicale pour l’animal et délivre avec précision le LPS à la trachée, puis aux poumons.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Instillation intratrachéale non invasive de lipopolysaccharides chez la souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le modèle murin de lésion pulmonaire aiguë (LAI) induite par le lipopolysaccharide (LPS) ou l’endotoxine est toujours parmi les modèles les plus couramment utilisés dans les études animales de lésions pulmonaires aiguës ou d’inflammation aiguë. Les méthodes actuellement les plus couramment utilisées dans les modèles murins de lésions pulmonaires aiguës sont l’injection intrapéritonéale de LPS et la trachéotomie pour la perfusion trachéale de LPS. Cependant, la première méthode manque de ciblage pulmonaire et endommage d’autres organes, et la dernière méthode induit un traumatisme opératoire, un risque d’infection et un faible taux de survie. Ici, nous recommandons une méthode d’intubation endotrachéale oropharyngée non invasive pour l’instillation de LPS chez la souris. Dans cette méthode, le LPS est introduit de manière non invasive dans la trachée par la cavité oropharyngée pour être instillé dans les poumons à l’aide d’un appareil d’intubation endotrachéale. Cette méthode assure non seulement le ciblage pulmonaire, mais évite également les dommages et le risque de mort chez les animaux. Nous nous attendons à ce que cette approche soit largement utilisée dans le domaine des lésions pulmonaires aiguës.
Introduction
Les lésions pulmonaires aiguës (LAI) sont un syndrome clinique courant. Sous une variété de facteurs pathogènes, la perturbation de la barrière physiologique des cellules épithéliales pulmonaires et des cellules endothéliales vasculaires entraîne une augmentation de la perméabilité alvéolaire, entraînant ainsi une diminution de la compliance pulmonaire, un œdème pulmonaire et une hypoxémie sévère1. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est la forme la plus grave de LAI. L’inflammation incontrôlée et les dommages causés par le stress oxydatif sont considérés comme les principales causes de l’ALI et du SDRA2 plus grave. Lorsque les cellules épithéliales alvéolaires sont directement endommagées en raison d’un traumatisme, la chaîne de réponse inflammatoire des macrophages alvéolaires est activée, entraînant une inflammation du poumon3. À l’échelle mondiale, il y a plus de 3 millions de patients atteints de SDRA aigu par an, et ils représentent environ 10 % des admissions en unité de soins intensifs; De plus, le taux de mortalité dans les cas graves atteint 46 %4,5,6. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle animal approprié d’ALI pour étudier sa pathogenèse. La souris est l’animal expérimental le plus couramment utilisé dans l’étude de l’ALI, car ses voies respiratoires peuvent bien simuler les voies respiratoires humaines pour les études sur l’ALI. De plus, l’ALI se manifeste par une infiltration massive de cellules inflammatoires, une augmentation de la perméabilité vasculaire pulmonaire et un œdème pulmonaire. Les changements dans les cytokines inflammatoires dans le sérum et le rapport poids sec-humide des poumons reflètent le degré d’ALI7.
À l’heure actuelle, les principales méthodes de modélisation de l’ALI induite par le LPS chez la souris comprennent l’intubation trachéale intranasale et chirurgicale 8,9. Ici, nous proposons une nouvelle méthode pour délivrer du LPS dans la trachée par intubation oropharyngée non invasive. Cette méthode utilise un intubateur éclairé pour trouver la trachée de la souris, puis délivre du LPS dans la trachée et les poumons. Cette méthode délivre le LPS aux poumons avec plus de précision que la méthode d’administration intranasale. Par rapport à l’intubation trachéale chirurgicale, cette méthode ne nécessite pas de chirurgie, évite de causer des plaies et réduit la douleur chez la souris10. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour établir un modèle murin plus convaincant de l’IAL.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Le protocole d’expérimentation animale a été examiné et approuvé par le Comité de gestion de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (dossier n° 2021-11). Des souris C57/BL mâles (20-25 g, âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été gardées dans une chambre animale et étaient libres de boire et de manger pendant l’expérience.
1. Préparation
- Assurez-vous que la plate-forme d’intubation se compose d’une base, d’une colonne montante, d’un trombone, de deux élastiques et de ficelles. Prenez une ficelle, passez la ficelle à travers les deux trous au sommet de la colonne montante et attachez les deux extrémités de la ficelle, respectivement, aux petites saillies au sommet de la colonne montante.
REMARQUE: Laissez de la place pour que la tête de la souris passe entre la chaîne et les deux trous. - Attachez deux élastiques à chaque extrémité du trombone et collez le trombone avec les élastiques à l’arrière de la colonne montante. Enfin, fixez le riser à la base à 90° (Figure 1).
- Sélectionnez une canule de la taille et de la longueur appropriées. Pour une souris de 20−30 g, un cathéter de 22 G (2,5−3,8 cm de long) peut être utilisé11. Assemblez la canule sur un stylo canule et allumez la lumière du stylo (Figure 2).
- Préparez de petites pinces chirurgicales et une pipette Pasteur en les désinfectant avec de l’alcool à 70%.
2. Préparation de la substance d’essai
- Peser et dissoudre 3 mg de LPS dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2) pour former une solution de LPS à une concentration de 3 mg/mL.
- Peser et dissoudre 10 mg de pentobarbital sodique dans 1 mL de solution saline normale pour former une solution de pentobarbital sodique à 1 %. Filtrer-stériliser la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.
3. Instillation oropharyngée non invasive
- Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 1% de pentobarbital sodique à une dose de 50 mg/kg12,13. Déterminer la profondeur de l’anesthésie par un manque de réponse au réflexe de redressement.
- Placez la souris anesthésiée sur la plateforme d’intubation. Fixez les dents antérieures supérieures avec le fil et les deux avant-pieds avec les élastiques (Figure 3).
- Retirez la langue avec une pince à épiler et tenez-la avec la main gauche. Poussez lentement la canule, le long de la bouche, avec la main droite vers le haut, jusqu’à l’épiglotte mandibulaire. Utilisez la lumière du stylo canule pour trouver la trachée et insérez-la lentement dans la trachée (Figure 4).
- Une fois la canule insérée dans la trachée, retirez lentement le stylo d’intubation et laissez la canule à l’intérieur. Insérez la pipette Pasteur dans le joint de la canule et appuyez sur la tête (Figure 5).
REMARQUE : Si la poitrine de la souris se gonfle, l’intubation est réussie (Figure 6). - Après une intubation endotrachéale réussie, instiller aux souris 3 mg/mL de LPS à 3 mg/kg à travers la canule à l’aide d’une microseringue à tête plate14,15 (figure 7).
- Une fois cela fait, retirez la canule et la microseringue. Retirez la souris de l’échafaudage et placez-la dans une cage séparément pour récupérer. Observez l’état respiratoire de la souris jusqu’à ce qu’elle se soit rétablie et qu’elle ait retrouvé sa conscience.
NOTE: À 12 h après l’instillation trachéale LPS, euthanasier les souris en suivant la procédure approuvée par le comité d’éthique animale. Les dosages sériques du TNF-α et les mesures du poids des poumons secs et humides ont été effectués à l’aide de procédures standard.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La méthode proposée pour l’instillation de LPS chez la souris a été vérifiée en évaluant l’expression de la cytokine inflammatoire TNF-α et le rapport poids sec-humide des poumons 12 h après l’instillation de LPS. Il y avait quatre groupes dans l’expérience: témoin à blanc (sans aucun traitement), intubation chirurgicale16, intranasale17,18 et intubation oropharyngée non invasive (n = 6). Par rapport au gro...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans un premier temps, nous avons regardé à l’intérieur de la cavité buccale pour trouver l’emplacement de la trachée19. Cependant, au cours de ce processus, nous avons découvert que la trachée des souris C57 / BL est étroite, ce qui rend difficile de trouver l’emplacement correct par cette méthode sans l’aide d’équipements tels qu’un endoscope20. Après une exploration plus approfondie, nous avons constaté que la lumière de la lampe à intubateur pouvait pénétrer la surface ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.: 81903902), la China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), le Sichuan Science and Technology Program (No.: 2020YJ0172) et le Xinglin Scholar Research Premotion Project de l’Université de Chengdu de TCM (No.: QJRC2022053).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Seringues d’un microlitre | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | Pour livrer LPS | |
| Canule de souris | RWD Life Science | 803-03008-00 | Canule de souris |
| Kit d’intubation de souris | RWD Life Science | 903-03027-00 | Comprenant une base, une colonne montante, un intubateur, une pince chirurgicale et certains cordes |
| Pipette Pasteur | Biosharp life science | BS-XG-03 | Pour vérifier le succès de l’intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., Chine | 20220918 | Pour anesthésier les souris |
Références
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96(2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999(2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530(2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62(2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. Repeated orotracheal intubation in mice. Journal of Visualized Experiments. (157), e60844(2020).
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
