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Article de méthode

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

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DOI :

10.3791/65152

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1 septembre 2023

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1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Résumé

Les vaccins adjuvants à base de nanoémulsion ont attiré beaucoup d’attention en raison de leur petite taille de particules, de leur stabilité thermique élevée et de leur capacité à induire des réponses immunitaires valides. Cependant, il est essentiel d’établir une série de protocoles complets pour évaluer la réponse immunitaire d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. Par conséquent, cet article présente une procédure rigoureuse pour déterminer les caractéristiques physico-chimiques d’un vaccin (par microscopie électronique à transmission [MET], microscopie à force atomique [AFM] et diffusion dynamique de la lumière [DLS]), la stabilité de l’antigène et du système vaccinaux (par un test de centrifugeuse à grande vitesse, un test de stabilité thermodynamique, SDS-PAGE et Western blot), et la réponse immunitaire spécifique (IgG1, IgG2a et IgG2b). En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent évaluer avec précision l’effet protecteur d’un nouveau vaccin adjuvant de nanoémulsion dans un modèle murin MRSA252 mortel. Avec ces protocoles, l’adjuvant de vaccin nanoémulsion le plus prometteur en termes de potentiel adjuvant efficace peut être identifié. En outre, les méthodes peuvent aider à optimiser les nouveaux vaccins pour le développement futur.

Introduction

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène opportuniste avec l’un des taux d’infection les plus élevés dans les unités de soins intensifs (USI) des services 1, les services de cardiologie et lesservices de brûlures du monde entier. Le SARM présente des taux élevés d’infection, de mortalité et de résistance générale aux médicaments, ce qui présente de grandes difficultés dans le traitement clinique2. Dans la liste prioritaire mondiale des bactéries résistantes aux antibiotiques publiée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en 2017, le SARM figurait dans la catégorie3 la plus critique. Un vaccin contre l’infection à SARM est donc nécessaire de toute urgence.

L’adjuvant d’aluminium est utilisé depuis longtemps et le mécanisme auxiliaire de l’adjuvant est relativement clair, sûr, efficace et bien toléré4. Les adjuvants à base d’aluminium sont actuellement un type d’adjuvant largement utilisé. On croit généralement que les antigènes adsorbés sur les particules de sel d’aluminium peuvent améliorer la stabilité et renforcer la capacité du site d’injection à absorber les antigènes, assurant une bonne absorption et une libération lente5. Actuellement, le principal inconvénient des adjuvants d’aluminium est qu’ils n’ont pas d’effet adjuvant ou ne présentent qu’un faible effet adjuvant sur certains antigènes candidats vaccins6. De plus, les adjuvants d’aluminium induisent des réactions d’hypersensibilité médiées par les IgE5. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux adjuvants pour stimuler une réponse immunitaire plus forte.

Les adjuvants de nanoémulsion sont des systèmes de dispersion colloïdale composés d’huile, d’eau, de tensioactifs et de cosurfactants7. De plus, les adjuvants sont thermodynamiquement stables et isotropes, peuvent être autoclavés ou stabilisés par centrifugation à grande vitesse et peuvent se former spontanément dans des conditions de préparation douces. Plusieurs adjuvants d’émulsion (tels que MF59, série NB001-002, série AS01-04, etc.) sont actuellement sur le marché ou au stade de la recherche clinique, mais leur taille de particules est supérieure à 160 nm8. Par conséquent, les avantages des préparations médicinales à l’échelle nanométrique (1-100 nm) (c.-à-d. grande surface spécifique, petite taille de particules, effet de surface, énergie de surface élevée, effet de petite taille et effet tunnel macro-quantique) ne peuvent pas être pleinement exploités. Dans le protocole actuel, un nouvel adjuvant basé sur la technologie de nanoémulsion d’un diamètre de 1 à 100 nm a été signalé comme présentant une bonne activité adjuvante9. Nous avons testé la protéine antigénique du vaccin sous-unitaire de recombinaison HI (mutant de la α-hémolysine [Hla] et protéine de fusion de fragments actifs de la sous-unité N2 déterminant la surface des ions Fe ; Une série de procédures ont été établies pour examiner les propriétés physiques et la stabilité, évaluer sa réponse anticorps spécifique après administration intramusculaire et tester l’effet protecteur du vaccin à l’aide d’un modèle d’infection systémique chez la souris.

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base du manuel sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Des souris Balb/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Préparation de la protéine antigénique SARM HI

  1. Obtenir des clones IsdB et Hla à partir de sources commerciales (voir le tableau des matériaux), effectuer une amplification par amplification par amplification par polymérase en chaîne (PCR) pour amplifier les gènes IsdB et Hla, et ligaturer leurs produits sur le plasmide PGEX-6P-2 (obtenu commercialement; voir le tableau des matériaux). Criblage avec la souche vectorielle Xl/bleue d’Escherichia coli10.
  2. Transformer le clone positif en cellules compétentes pour E. coli BL21 (voir le tableau des matériaux) et l’amplifier avec la culture de requins10.
  3. Exprimer l’antigène et l’isoler après induction avec des trousses d’isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside et d’isolat de chromatographie multimodale (MMC)11 (voir le tableau des matériaux).
  4. Caractériser la protéine antigénique et la purifier avec un purificateur à automatisation complète11.
    1. Protéines marquées par affinité par gutathion S-transférase (GST) à partir de lysats clairs à l’aide d’une résine de chromatographie d’affinité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    2. Purifier les protéines recombinantes par MMC11.
    3. Éliminer l’endotoxine par la méthode de séparation de phase Triton X-11411. Brièvement, mélanger le Triton X-114 à 1% avec l’éluat de protéine recombinante à 0 °C pendant 5 min pour assurer une solution homogène, et incuber à 37 °C pendant 5 min pour permettre la formation de deux phases.
  5. Utiliser la méthode d’essai des endotoxines bactériennes11 avec les trousses Turtle (voir le tableau des matières) pour détecter la concentration d’endotoxines. L’endotoxine pour l’antigène protéique est de 0,06 EU/μg, inférieure à la norme internationale (1,5 EU/μg)10.
    1. Effectuer un test d’interférence pour éliminer l’influence possible du produit d’essai sur la détection des endotoxines11.
      REMARQUE: Selon l’annexe 2020 de la pharmacopée chinoise12, la teneur en endotoxines doit être inférieure à 5 EU / dose. La sensibilité du lysat de Limulus (λ0,25 EU/mL) et le taux de dilution effectif maximal de 33,3 ont été calculés12 sur la base de MVD = cL/λ, où L est la valeur limite de l’endotoxine bactérienne pour l’objet d’essai, c est la concentration de la solution de l’objet d’essai, et lorsque L est exprimé en EU/m, c est égal à 1,0 mg/mL. λ est la sensibilité marquée (EU/mL) du réactif en fer à cheval dans la méthode du gel.
  6. Recombiner l’antigène (48 kDa, déterminé par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium à 12 % [SDS-PAGE]) à 1,5 mg/mL dans de l’eau stérile sans endotoxine ni solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (méthode au dichlorate de sodium)11.
    NOTE: Le temps de pointe de la protéine était de 13,843 min, la pureté était de 99,4% (méthode de chromatographie liquide à haute performance) et la protéine a été stockée à -70 ° C10. L’ADN génomique extrait de la souche MRSA252 de S. aureus (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme modèle de PCR. Le gène IsdB a été amplifié à l’aide de l’amorce avant 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    C-39 et l’amorce inversée 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGCTTC-39. Le gène Hla a été amplifié à l’aide de l’amorce avant PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) et de l’amorce inverse PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTTC).

2. Préparation du vaccin à base de nanoémulsion

  1. Selon le rapport massique de 1:6:3 (p/p), ajouter trois types d’excipients en séquence (myristate d’isopropyle, huile de ricin de polyoxyéthylène et propylène glycol; voir le tableau des matières) à la solution protéique de l’antigène HI (10 mg/mL) et bien agiter. Ensuite, ajouter de l’eau pure stérilisée graduellement pour atteindre un volume final de 10 ml et agiter à 500 rpm et 25 °C pendant environ 20 min.
    REMARQUE: La nanoémulsion préparée dans ce protocole a un volume de 10 mL, et les masses des trois excipients sont de 0,34 g, 2 g et 1 g, respectivement. La solution protéique ici est la solution de travail, 10 fois la concentration de la solution finale.
  2. Préparer le vaccin adjuvant de nanoémulsion (1 mg/mL de protéines) par des méthodes d’émulsification à basse énergie13 pour obtenir une solution liquide claire et transparente.
    NOTE: La nanoémulsion à blanc (BNE) a été préparée par des méthodes similaires, sauf que l’eau a été remplacée par HI. La méthode habituelle d’émulsification consiste à chauffer les phases externe et interne à environ 80 °C pour l’émulsification, puis à les agiter et à les refroidir progressivement. Dans ce processus, une grande quantité d’énergie est consommée, et finalement, l’émulsion est obtenue.

3. Caractérisation physique et stabilité du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion

  1. Taille des particules, potentiel zêta et caractérisation de l’indice de dispersion des polymères (PDI).
    1. Préparer 100 μL du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion et diluer 50 fois avec de l’eau pour injection. Ajouter 2 mL d’échantillon pour la détection.
    2. Observez la taille des particules, le potentiel zêta et le PDI à 25 °C à l’aide d’un Nano Zetasizer (ZS; voir Tableau des matériaux).
  2. Microscopie électronique à transmission (MET)
    1. Diluer 10 μL de vaccin à nanoémulsion 50 fois avec de l’eau, placer sur une grille de cuivre de 100 mailles recouverte de carbone et colorer avec de l’acide phosphotungstique à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 5 minutes à température ambiante.
    2. Retirer l’excès de solution d’acide phosphotungstique avec du papier filtre.
    3. Observez la morphologie au microscope électronique à transmission (voir le tableau des matériaux). Examiner si les produits finis sont presque stables et circulaires dans le champ de vision du microscope électronique et s’ils présentent une bonne dispersion.
  3. Microscopie électronique à balayage (MEB)
    1. Diluer 50 μL du vaccin adjuvant nanoémulsion avec de l’eau, déposer 10 μL d’échantillons prédilués sur une plaquette de silicium et placer dans un incubateur contrôlé par thermostat à 37 °C pendant 24 h.
    2. Vaporiser le platine préparé sur le silicium pendant 40 s et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Observer les propriétés morphologiques des échantillons préparés au microscope électronique à balayage à haute résolution (voir le tableau des matériaux). Déterminer si les échantillons sont presque stables, sphériques et bien dispersés dans le champ de vision au microscope électronique.
  4. Stabilité morphologique
    1. Placer 1 mL d’échantillons de vaccin à nanoémulsion dans des tubes à microcentrifugation, et évaluer la stabilité des échantillons frais par centrifugation pendant 30 min à 13 000 x g à température ambiante (25°).
    2. Observer l’aspect de ces échantillons frais puis effectuer un test de stabilité thermodynamique de six cycles de température (un cycle : conserver à 4 °C pendant 48 h, 25 °C pendant 48 h et 37 °C pendant 48 h).
    3. Après centrifugation, laisser reposer les échantillons pendant 15 minutes pour déterminer s’il y a un effet Tyndall (si l’échantillon est clair et transparent sous la lumière) et si la désémulsification s’est produite (indiquée par une stratification claire après désémulsification).
  5. SDS-PAGE et Western blot
    1. Agiter les échantillons, mélanger une solution de 0,6 mL d’éthanol absolu et 0,3 mL de vaccin, et centrifuger (13 000 x g, 30 min à température ambiante, 25 °C).
    2. Transférer le surnageant de la solution dans un tube propre et dissoudre le précipité avec 0,3 mL d’eau. Obtenir les solutions surnageantes et précipitées (nanoémulsion vierge et vaccin) après traitement avec de l’éthanol absolu et une solution d’eau distillée, et effectuer la même dilution 50 fois.
    3. Mélanger 2,5 mL de gel de séparation A et 2,5 mL de gel de séparation B (voir le tableau des matières), ajouter 50 μL de persulfate d’ammonium à 10 % et placer rapidement la solution dans la plaque de verre à l’aide d’une pipette. Mélanger 1 mL de gel concentré A et 1 mL de gel concentré B, ajouter 20 μL de persulfate d’ammonium à 10 % dans la plaque de verre, insérer un peigne de taille appropriée et attendre la solidification.
    4. Ajouter au total 5 μL de solution tampon de charge protéique 5x à l’échantillon dilué obtenu à l’étape 3.5.2, et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min.
    5. Ajouter 10 μL de protéines chauffées au puits correspondant et ajouter 5 μL de marqueur protéique au puits marqueur.
    6. Connectez l’électrode, allumez l’électrophorèmètre (voir le tableau des matériaux) et réglez la tension à 300 V. Coupez l’alimentation lorsque l’électrophorèse atteint 1 cm du bas du caoutchouc PAGE.
    7. Retirer le gel et rincer avec ddH2O. Ajouter la solution de coloration Coomassie bleu vif G-250 (voir tableau des matières) pendant 10 min. Versez la solution de coloration et rincez le gel deux fois avec ddH2O.
    8. Ajouter la solution de décoloration disponible dans le commerce et cuire le gel au micro-ondes pendant 1 min. Agiter le gel pendant 10 minutes et changer à plusieurs reprises la solution de décoloration jusqu’à ce que le fond du gel soit clair. Ensuite, effectuez l’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le transfert Western a été prétraité, comme décrit aux étapes 3.5.1 à 3.5.6.
    9. Trempez trois blocs de papier filtre avec un tampon de transfert d’électrophorèse. Faire tremper la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans du méthanol pendant 30 s et transférer avec un instrument de transfert de gel semi-sec (deux couches de papier filtre, membrane PVDF, gel d’électrophorèse et une couche de papier filtre). Utilisez une tension de 23 V pour transférer la membrane pendant 23 min.
    10. Retirez la membrane de PVDF et lavez une fois avec une solution saline tamponnée Tris-Tween 20 (TBST) après le transfert.
    11. Placer la membrane PVDF dans une solution d’étanchéité (solution de lait écrémé en poudre à 5 %) et sceller pendant la nuit à 4 °C.
    12. Retirez la membrane PVDF et lavez trois fois avec TBST ou 10 minutes chacune.
    13. Incuber avec l’anticorps primaire (provenant de souris immunisées avec sérum positif). Diluer l’anticorps primaire11 (voir le tableau des matières) à tester 500 fois (100 fois) avec TBST. Placer la membrane PVDF bloquée dans l’anticorps primaire et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    14. Retirez la membrane PVDF et lavez trois fois avec TBST pendant 10 minutes chacune.
    15. Incuber avec l’anticorps secondaire (voir le tableau des matériaux). Diluer 5 000 fois l’anticorps secondaire anti-souris marqué à la phosphatase alcaline (AP) avec TBST. Placer la membrane PVDF dans l’anticorps secondaire et incuber à 37 °C pendant 40 min.
    16. Retirez la membrane PVDF et lavez quatre fois avec TBST pendant 10 minutes chacune.
    17. Immerger les membranes PVDF dans un mélange (juste assez pour faire tremper la membrane) du substrat AP nitro blue tetrazole (NBT) et BCIP (sel de 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine) (voir le tableau des matériaux) pour la coloration. Un résultat positif est violet.
      REMARQUE: Les résultats doivent être une bande violette claire, et la bandelette d’échantillon et le poids moléculaire de l’antigène doivent être à la même position marquée.

4. Évaluation de la réponse immunitaire des anticorps à ce vaccin après administration intramusculaire

REMARQUE : Les souris ont été immunisées par injection intramusculaire du vaccin à nanoémulsion à la suite d’un rapportpublié 11. Les souris ont reçu du PBS comme témoin négatif. À 1 semaine après la fin de trois immunisations, le sérum a été prélevé sur les souris11. Les taux sériques d’IgG et de sous-classes d’IgG1, IgG2a et IgG2b ont été déterminés quantitativement par dosage immunoenzymatique (ELISA).

  1. Revêtement antigénique : Diluer l’antigène de la protéine HI à 10 μg/mL avec une solution d’enrobage et l’ajouter à la plaque ELISA à 100 μL/puits. Incuber à 4 °C pendant une nuit.
    NOTE: La solution d’enrobage est préparée en dissolvant 1,6 g de carbonate de sodium anhydre et 2,9 g de bicarbonate de sodium dans 1 L d’eau désionisée.
  2. Étanchéité : Lavez la plaque (trois cycles, chaque cycle 300 μL). Ajouter 300 μL de solution d’étanchéité à chaque puits et sceller les puits pendant 2 h à 37 °C.
    NOTE: La solution d’étanchéité est préparée en ajoutant du Tween-20 et de l’albumine sérique bovine (BSA) au PBS. La teneur en BSA dans la solution PBST est de 1%.
  3. Dilution sérique : Diluer l’échantillon de sérum de souris 100 fois avec du PBST (prendre 3 μL de sérum et l’ajouter à 297 μL de PBST et de vortex) et utiliser 100 μL pour chaque échantillon de sérum. Diluer le sérum positif et le sérum témoin négatif 100 fois avec du PBST en ajoutant 4 μL à 396 μL de PBST, puis mélanger par vortex.
  4. Dilution à double rapport : Ajouter 200 μL du sérum expérimental dilué ci-dessus à la première rangée de la plaque ELISA revêtue et ajouter 100 μL de PBST à tous les puits, à l’exception de la première et de la 12erangée . Effectuer une dilution 1:2 successivement à partir de la première rangée : régler la pipette à 100 μL, transférer 100 μL de la première rangée à la deuxième rangée et mélanger 10 fois avec la pipette.
  5. Diluer le sérum à la rangée 11 à plusieurs rapports et jeter 100 μL de liquide.
  6. Ajouter le sérum négatif et positif dilué aux puits correspondants de la rangée 12 selon le modèle d’échantillon (voir le tableau 1)-100 μL/puits.
  7. Sceller les plaques ELISA avec une pellicule plastique et incuber à 37 °C pendant 1 h.
  8. Diluer l’anticorps secondaire anti-souris IgG-HRP (voir le tableau des matériaux) avec PBST à 1:10 000.
  9. Laver la plaque (trois cycles, chaque cycle 300 μL). Ensuite, ajouter 100 μL de l’anticorps secondaire dilué à chaque puits, et incuber la plaque à 37 °C pendant 40 min.
  10. Coloration et terminaison : Lavez la plaque (cinq cycles, chaque cycle 300 μL). Ajouter la solution de coloration à la 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) (100 μL; voir le tableau des matières) à chaque puits. Placer les plaques à 37 °C pendant 10 min à l’abri de la lumière, puis terminer immédiatement la réaction avec 50 μL de 2 MH2SO4.
  11. Détecter la valeur de densité optique (OD 450) par un marqueur enzymatique (lire la valeur OD450 dans les 15 minutes suivant la terminaison).

5. Évaluation des effets in vivo des nouveaux vaccins adjuvants

REMARQUE : L’effet protecteur de ce vaccin à nanoémulsion a été évalué dans un modèle murin létal MRSA252 obtenu commercialement (voir le tableau des matériaux). Selon les résultats précédents de notre groupe de recherche14, 1 x 108 unités formant colonies (UFC)/souris est la meilleure dose pour évaluer l’effet protecteur du modèle mortel d’infection bactérienne MRSA252.

  1. Récupération de la souche : Obtenir un tube de MRSA252 congelée, inoculer les bactéries sur des plaques de Mueller Hinton (MH) (A) (voir le tableau des matériaux) par la « méthode des trois lignes » et les cultiver pendant une nuit à 37 °C. Effectuez les étapes de la « méthode à trois lignes » comme mentionné ci-dessous :
    1. En tenant l’anneau d’inoculation dans la main droite, cautériser et refroidir pour obtenir un anneau de liquide bactérien.
    2. Tenez la plaque de gélose dans la main gauche (en gardant le couvercle sur la table) au-dessus de la zone avant gauche de la flamme de la lampe à alcool de sorte que la plaque fasse face à la flamme, empêchant les bactéries de pénétrer dans l’air. Avec la main droite, déplacer l’anneau d’inoculation des bactéries infectées d’avant en arrière sur la surface de la gélose d’une manière dense mais sans chevauchement, couvrant une zone d’environ 1/5-1/6 de la plaque entière, qui est la première zone.
      NOTA : L’anneau d’inoculation et la gélose doivent être en contact doux à un angle de 30°-40°; Endommager la gélose peut être évité en glissant avec la force du poignet.
    3. Cautériser l’excès de bactéries sur l’anneau d’inoculation (la cautérisation ou la stérilisation de chaque zone dépend de la quantité de bactéries dans l’échantillon). Après refroidissement, répétez l’avant-dernière rangée 2-3 à la fin et dessinez une deuxième zone (environ 1/4 de la surface de la plaque).
    4. Une fois la deuxième zone terminée, cautérisez l’anneau et dessinez la troisième zone de la même manière pour remplir toute la plaque.
    5. Une fois les lignes tracées, placez l’assiette sur le couvercle de la boîte, marquez l’assiette et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 18 à 24 h pour observer la répartition des colonies à la surface de la gélose. Concentrez-vous sur la question de savoir si une seule colonie est isolée et observez les caractéristiques de la colonie (telles que la taille, la forme, la transparence et la pigmentation).
  2. Activation bactérienne : Le lendemain, prenez deux flacons agitateurs de 50 ml et ajoutez 20 mL de milieu MH (B) (voir le tableau des matières) à chacun. Choisissez deux colonies simples avec un embout de pipette de 10 μL et ajoutez-les aux agitateurs. Incuber les colonies pendant une nuit à 220 tr/min à 37 °C.
  3. Activation secondaire : Le lendemain, prendre deux fioles agitatrices de 50 mL, chacune contenant 20 mL de milieu MH (B). Retirer 200 μL de solution bactérienne de l’agitateur contenant les premières bactéries activées, ajouter aux deux nouvelles fioles contenant 20 mL de milieu MH(B) et incuber à 37 °C et 220 rpm pendant 5 h.
  4. Prélever la deuxième solution bactérienne activée dans un tube à centrifuger de 50 mL, séparer à 3 000 x g pendant 20 minutes et jeter le surnageant.
  5. Remettez en suspension les bactéries précipitées dans 40 mL de solution saline.
  6. Mesurer la valeur OD600 de la solution bactérienne et ajuster à 1 avec une solution saline. À ce moment-là, la quantité bactérienne de MRSA252 dans notre expérience était de 2 x 109 UFC / mL.
  7. Diluer la solution bactérienne avec une DO600 de 1 à une concentration de 1 x 109 UFC/mL.
  8. Divisez au hasard 48 souris Balb/c en quatre groupes (n = 12).
    REMARQUE : Groupe I : Groupe PBS; Groupe II: groupe témoin de l’ENB; Groupe III : groupe des antigènes naïfs [protéine]; Groupe IV : groupe de vaccins adjuvants à base de nanoémulsion.
  9. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1%.
  10. Irradier les souris avec une lampe de physiothérapie infrarouge (voir le tableau des matériaux) pendant environ 1 min pour provoquer une vasodilatation de la veine de la queue.
  11. Défiez les souris avec l’injection de la solution bactérienne diluée (étape 5.7) dans la veine de la queue, 100 μL par souris.
  12. Placez les souris sous la lampe de physiothérapie infrarouge jusqu’à ce qu’elles puissent reprendre une activité normale.
  13. Observez et enregistrez la survie des souris toutes les 12 heures pendant 10 jours.
  14. Euthanasier les souris qui ont survécu à l’attaque par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %.

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Résultats

Le protocole de préparation du vaccin adjuvant de nanoémulsion et les tests in vitro et in vivo de ce vaccin ont été évalués. La MET, l’AFM et le DLS ont été utilisés pour déterminer les caractéristiques importantes du potentiel zêta et de la taille des particules à la surface de cet échantillon (figure 1). SDS-PAGE et Western blot ont montré que la quantité d’antigène dans le précipité et le surnageant ne se dégradait pas significativement après la centrifugation, ce qui i...

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Discussion

IsdB, une protéine de surface ancrée dans la paroi cellulaire bactérienne et régulée par le fer, joue un rôle important dans le processus d’obtention du fer hémique15. Hla, toxine alpha, est parmi les toxines bactériennes les plus efficaces connues dans le SARM, et peut former des pores dans les cellules eucaryotes et interférer avec l’adhésion et les cellules épithéliales16. Dans notre étude, une nouvelle protéine antigénique SARM (IH) de recombinaison a ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, n ° 32070924 et 32000651 du NSFC et le n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5424-Petite centrifugeuse à grande vitesseFA-45-24-11Eppendorf, Allemagne  ;
plaques à 96 puitsCorning Incorporated, États-UnisCLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Allemagne  ;
à alcoolShenzhen Yibaxun Technology Co., ChineYBS-AA-11408
Balb/c souris  ;Beijing HFK Bioscience Co. Ltd.
BCIP/NBTFuzhou Maixin Biotechnology Development Company, ChineBCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 lecteur de microplaquesBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21 Competent CellMerck millipore, Allemagne70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Centrifugeuse 5810 REppendorf, Allemagne  ;
Coomassie bleu vif G-250 solution de colorationMIKX, ChineDB236
Solution de décolorationBOSTER, ChineAR0163-2
Cultivateur électro-chauffant à température debout HH-B11-420Shanghai Yuejin Medical Device Factory, ChineAppareil
Beijing Liuyi Instrument Factory, ChineDYCZ-25D
Gel imageTanon, USAnull
Glutathion-Sepharose Résine GSTMei5bio, ChineRésine de chromatographie d’affinité
H2SO4Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, Chine7664-93-9
HI protéine recombinanteTroisième Université de médecine militaire, Chine110-27-0
HRP -Chèvre anti-sourisIgG Biodragon, ChineBF03001
HRP- Chèvre anti-souris IgG1Biodragon, ChineBF03002R
HRP- Chèvre anti-souris IgG2aBiodragon, ChineBF03003R
HRP- Chèvre anti-souris IgG2bBiodragon, ChineBF03004R
Boucle d’inoculationHaimen Feiyue Co.,LTD, ChineYR-JZH-1UL
Clones IsdB et HlaShanghai Jereh Biotechnology Co, Chinenull
Isopropyl nutmeg (adjuvant pharmaceutique)SEPPIC, Francenull
isopropyl- &beta ;-D-1-mercaptogalactopyranosidefdbio, ChineFD3278-1
LB bouillon culture-mediumBeijing AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chine02-136
Lampe de physiothérapie parfuméeGuangzhou Runman Medical Equipment Co., Chine7600
Centrifugeuse réfrigérée à basse températureEppendorf, Allemagne  ;
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., Royaume-Uninull
MH(A) moyenPékin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chine02-051
MH(B) moyenPékin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chine02-052
Micro machine à laver les plaques 405 LSRSBio Tek Instruments, Inc Highland  ; Park, USAnull
Mini-TBC Compact Film Transfer InstrumentBeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, Chine1658030
MMC packingTOSOH (SHANGHAI)CO., LTD
MRSA252États-Unis, ATCCnull
Nanodrop spectrophotomètre ultravioletThermo Scientific, USAnull
New FlashTM Protein any KD PAGE Kit de gel d’électrophorèse des protéinesDAKEWE, Chine8012011
PBSbiosharp, Chinenull
PCR, AmplifierThermal Cycler, États-Unisnul
pG-target gene recombinant plasmideShanghai Jereh Biotechnology Co, ChineB3528G
Acide phosphotungstiqueG-CLONE, ChineCS1231-25g
pipetteEppendorf, Allemagne  ;
huile de ricin polyoxyéthylée (adjuvant pharmaceutique)Aladdin, ChineK400327-1kg
Anticorps primaireLaboratoire fait maison :à partir de souris immunisées avec un sérum nulla référence 11 pour plus de détails
propylène glycol (adjuvant pharmaceutique)Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
Protein MarkerThermo Scientufuc, USA26616
PVDF MEMBRANE DE TRANSFERTInvitrogen, USA88518
Microscope électronique à balayageJEOL, JaponJSM-IT800
Pentobarbital de sodiumMerck, AllemagneTc-P8411
Talos L120C TEMThermo Fisher, USAnull
TMB solution de couleurTIAN GEN, ChinePA107-01
Kits de tortuesXiamen Bioendo Technology Co., LTDES80545
Tween-20Macklin, Chine9005-64-5
5424000495lampe nul 5811000398 d’électrophorèse nulle null 0022818 3120000844 Voir

Références

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