Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.
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Article de méthode
Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum
Dans cet article
Résumé
Résumé
Chez les plantes à fleurs, la croissance et le guidage du tube pollinique (gamétophyte mâle) dans le pistil et la réception du tube pollinique par le gamétophyte femelle sont essentiels pour la double fécondation et le développement ultérieur des graines. Les interactions entre les gamétophytes mâles et femelles lors de la réception du tube pollinique aboutissent à la rupture du tube pollinique et à la libération de deux spermatozoïdes pour effectuer une double fécondation. Comme la croissance des tubes polliniques et la double fécondation sont profondément cachées dans les tissus de la fleur, ce processus est difficile à observer in vivo.
Une méthode semi-in vitro (SIV) pour l’imagerie de la fécondation sur cellules vivantes dans la plante modèle Arabidopsis thaliana a été développée et mise en œuvre dans plusieurs études. Ces études ont permis d’élucider les caractéristiques fondamentales de la façon dont le processus de fécondation se produit chez les plantes à fleurs et quels changements cellulaires et moléculaires se produisent lors de l’interaction des gamétophytes mâles et femelles. Cependant, comme ces expériences d’imagerie de cellules vivantes impliquent l’excision d’ovules individuels, elles sont limitées à un faible nombre d’observations par séance d’imagerie, ce qui rend cette approche fastidieuse et très longue. Entre autres difficultés techniques, une défaillance des tubes polliniques pour féconder les ovules in vitro est souvent signalée, ce qui complique gravement de telles analyses.
Ici, un protocole vidéo détaillé pour l’imagerie de la réception et de la fécondation des tubes polliniques de manière automatisée et à haut débit est fourni, permettant jusqu’à 40 observations de la réception et de la rupture du tube pollinique par séance d’imagerie. Couplée à l’utilisation de biocapteurs génétiquement codés et de lignes de marqueurs, cette méthode permet de générer des échantillons de grande taille avec un investissement en temps réduit. Les nuances et les points critiques de la technique, y compris la mise en scène des fleurs, la dissection, la préparation du milieu et l’imagerie, sont clairement détaillés sous forme vidéo pour faciliter les recherches futures sur la dynamique du guidage, de la réception et de la double fécondation du tube pollinique.
Introduction
La génération d’une progéniture génétiquement unique dans les organismes à reproduction sexuée dépend de la fusion réussie des gamètes mâles et femelles. Chez les plantes à fleurs, l’interaction de deux gamètes mâles (spermatozoïdes) avec deux gamètes femelles (ovule et cellule centrale) lors de la double fécondation dépend de la libération de spermatozoïdes par le tube pollinique (le gamétophyte mâle). Ce processus, appelé réception du tube pollinique, est largement contrôlé par les cellules synergiques qui résident dans le sac embryonnaire (le gamétophyte femelle)1,2. Comme la réception du tube pollinique a ....
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Protocole
NOTA : Voir le tableau des matériaux pour une liste des matériaux et de l’équipement utilisés dans ce protocole.
1. Considérations relatives à la conception de l’expérience d’imagerie
- Prédéterminer la durée d’imagerie et la fréquence d’échantillonnage requises pour capturer le phénomène souhaité à observer. Par exemple, selon le théorème d’échantillonnage de Nyquist, la fréquence d’échantillonnage doit être supérieure à deux fois la fréquence la plus élevée de l’échantillon d’entrée. Par conséquent, pour capturer avec précision les oscillations synergiques [Ca2+]cyt , effectu....
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Résultats
Pour évaluer le moment de la dégénérescence nucléaire dans la synergide réceptive par rapport à la rupture du tube pollinique chez Arabidopsis , ainsi que pour observer si le synergide gauche ou droit est prédestiné à devenir le synergide réceptif, la méthode SIV cum septum décrite ici a été utilisée en utilisant un marqueur nucléaire gamétophyte femelle empilé avec un marqueur cytosolique synergide (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) en tant que donneur de septum et marqueur gamétophyte.......
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Discussion
Ce manuscrit présente un protocole efficace pour l’imagerie de la réception du tube pollinique et de la double fécondation chez Arabidopsis. La méthode améliorée, SIV cum septum, augmente considérablement le pourcentage et le nombre total d’événements de réception réussie du tube pollinique qui sont observables par séance d’imagerie. Les résultats représentatifs présentés ici démontrent une séance d’imagerie avec 41 événements de réception réussie du tube pollinique et 10 ovules présentant des défauts d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions Sara Simonini et Stefano Bencivenga pour le don de la construction pFG:roGFP2-ORP1-NLS et Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter et Celia Baroux pour leurs conseils sur la microscopie. Nous remercions Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima et tous les autres participants à la Conférence internationale sur la reproduction sexuée des plantes 2022 qui ont manifesté leur intérêt pour un protocole sur le VIS cum septum. Ces travaux ont été soutenus par l’Université de Zurich et des subventions du Fonds national suisse à U.G.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Glissière en verre de 1 mm ; | Epredia ; | ||
| plat à fond en verre de 35 mm (puits de 14 mm) | Mattek ; | P35G-1.5-14-C | |
| Chlorure de calcium ; | Roth ; | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) ; | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donneur | |
| Dissecting Scope ; | Olympe ; | SZX2-ILLT | |
| Aiguille à insuline (0,3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) ; | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum | |
| donneur Sulfate de magnésium | Merck | 5886 | |
| Chlorure de potassium | Roth | 6781.1 | |
| Lame de rasoir | Beldura | 7026797 | |
| Scotch ruban adhésif double face ; | Scotch | 768720 | Moins épais et bon pour la dissection |
| stigmates Chlorure de sodium ; | Roth | 3957.1 | |
| Réactifs Sucrose | ITW | A2211,1000 | |
| Tesa ruban adhésif double face ; | Tesa | 05681-00018 | Très collant et bon pour la dissection du septum |
| Agarose à très basse température de gélification | FMC SeaPrep | 50302 |
Références
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control ....
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Réimpressions et autorisations
