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Article de méthode

Mise en place d’un dispositif pour la privation de sommeil chez la souris

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DOI :

10.3791/65157

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22 septembre 2023

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1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode de mise en place d’un dispositif rentable basé sur une plate-forme à bascule utilisé pour induire une privation de sommeil chez la souris. Cet appareil s’est avéré efficace pour provoquer des perturbations dans les habitudes de sommeil mises en évidence par l’électroencéphalogramme (EEG), ainsi que pour induire des changements métaboliques et moléculaires associés à la privation de sommeil.

Résumé

La perturbation du rythme circadien fait référence à la désynchronisation entre l’environnement ou le comportement externe et l’horloge moléculaire endogène, ce qui nuit considérablement à la santé. La privation de sommeil est l’une des causes les plus fréquentes de perturbation du rythme circadien. Diverses modalités (par exemple, plates-formes sur l’eau, manipulation douce, chambres à barres coulissantes, tambours rotatifs, agitateurs orbitaux, etc.) ont été rapportées pour induire une privation de sommeil chez la souris afin d’étudier ses effets sur la santé. La présente étude présente une méthode alternative pour la privation de sommeil chez la souris. Un dispositif automatisé basé sur une plate-forme à bascule a été conçu pour être rentable et perturber efficacement le sommeil des souris hébergées en groupe à des intervalles de temps réglables. Cet appareil induit des changements caractéristiques de la privation de sommeil avec une réponse minimale au stress. Par conséquent, cette méthode peut s’avérer utile pour les chercheurs intéressés à étudier les effets et les mécanismes sous-jacents de la privation de sommeil sur la pathogenèse de plusieurs maladies. De plus, il offre une solution rentable, en particulier lorsque plusieurs dispositifs de privation de sommeil doivent fonctionner en parallèle.

Introduction

La perturbation du rythme circadien fait référence à la désynchronisation entre l’environnement ou le comportement externe et l’horloge biologique endogène. L’une des causes les plus courantes de perturbation du rythme circadien est la privation de sommeil1. La privation de sommeil affecte non seulement négativement la santé humaine, mais augmente également considérablement le risque de nombreuses maladies, notamment le cancer2 et les maladies cardiovasculaires3. Cependant, les mécanismes sous-jacents aux effets néfastes de la privation de sommeil restent largement inconnus, et l’établissement de modèles de privation de sommeil est essentiel pour améliorer notre compréhension à cet égard.

Diverses méthodes de privation de sommeil chez la souris ont été rapportées, telles que l’utilisation de plates-formes d’eau4, la manipulation douce5, les chambres à barres coulissantes6, les tambours rotatifs7 et les protocoles d’agitation de cage5, 8, 9. Les chambres à barres coulissantes balaient automatiquement les barres sur le fond de la cage, forçant les souris à marcher dessus et à rester éveillées. Les protocoles d’agitation des cages consistent à placer des cages sur des agitateurs orbitaux de laboratoire, ce qui entraîne une perturbation efficace du sommeil. Bien que ces méthodes soient automatiques et efficaces, elles peuvent être coûteuses lorsque plusieurs appareils doivent fonctionner en parallèle, en particulier pour des modèles d’étude spécifiques qui impliquent un grand nombre de souris privées de sommeil nécessaires au profilage génétique circadien. D’autre part, les plates-formes d’eau et les protocoles de manipulation douce sont des méthodes moins chères et plus simples couramment utilisées pour induire la privation de sommeil. Cependant, la plate-forme d’eau ne permet pas le contrôle automatique des cycles de privation-repos préspécifiés10,11, et une manipulation en douceur nécessite une vigilance continue de la part des chercheurs pour perturber le sommeil. De plus, d’autres modalités, comme la rotation des tambours, peuvent être perturbées par l’isolement social ou le stress12.

En nous inspirant de la méthode basée sur un agitateur orbital, nous visons à introduire un protocole pour l’établissement d’un dispositif basé sur une plate-forme à bascule pour la privation de sommeil chez la souris. Cette méthode est bon marché, efficace, peu stressante, contrôlable et automatisée. Le protocole actuel nous permet de créer un dispositif basé sur une plate-forme à bascule à un coût environ dix fois moins cher que celui des agitateurs orbitaux, en fonction de notre accessibilité. Ce dispositif a efficacement perturbé le sommeil chez les souris logées en groupe et a induit des changements caractéristiques de privation de sommeil avec une réponse minimale au stress. Il sera particulièrement utile pour les chercheurs intéressés à étudier les effets et les mécanismes sous-jacents de la privation de sommeil sur la pathogenèse de plusieurs maladies, en particulier lorsque l’étude implique une privation de sommeil en plusieurs groupes en parallèle.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux sur les animaux de cette étude ont été approuvés par le Comité d’éthique du bien-être des animaux de laboratoire de l’hôpital Renji, école de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai. Des souris mâles C57BL/6J, âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées dans l’étude. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Les principales pièces nécessaires à la mise en place de l’appareil sont répertoriées à la figure 1A.

1. Préparation du dispositif de privation de sommeil

  1. Fixez une extrémité d’un caniveau en acier fendu de 50 cm au milieu d’un caniveau en acier fendu de 40 cm à l’aide de vis (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une structure en forme de T ; répétez le processus et faites deux de ces structures en forme de T (Figure 1B-a).
  2. Placez les deux structures en forme de T vers le haut parallèlement à 30 cm l’une de l’autre et reliez le bas des deux structures en forme de T à l’aide d’un cylindre en acier de 30 cm compatible avec les vis (voir le tableau des matériaux) à l’aide de vis (figure 1B-b).
  3. Placez une plate-forme rectangulaire en acier (20 × 25 cm) (voir le tableau des matériaux) entre les deux structures en forme de T (figure 1B-c).
    REMARQUE : Si des plates-formes rectangulaires en acier prêtes à l’emploi de la taille spécifiée ne sont pas disponibles, on peut en fabriquer une en soudant des aciers plats de 2 mm d’épaisseur.
  4. Fixez chaque extrémité d’un cylindre d’acier de 30 cm compatible avec les vis fixé dans la plate-forme à deux roulements fixés sur chacune des structures en forme de T à 10 cm du haut (figure 1B-d).
  5. Fixez un support de moteur (voir le tableau des matériaux) sur l’une des structures en forme de T à 25 cm du haut à l’aide de vis (Figure 1B-e).
    REMARQUE : Alternativement, l’adhésif de construction peut être utilisé pour fixer le support du moteur sur la structure en forme de T au lieu des équipes.
  6. Installez un moteur (voir le tableau des matériaux) sur le support du moteur à l’aide de vis (Figure 1B-f).
  7. Fixez un ventilateur de refroidissement (voir le tableau des matériaux) à l’aide de bandes autobloquantes sur la structure en forme de T située sous le moteur (Figure 1B-g).
  8. Fixez l’extrémité du palier d’une bielle à un coin de plate-forme faisant face au moteur à l’aide de vis (Figure 1B-h).
  9. Fixez une autre extrémité de la bielle à l’arbre du moteur à l’aide de vis (Figure 1B-i).
  10. Percez deux trous de 4 mm à chacun des quatre coins d’un récipient en plastique ou d’une cage standard pour animaux (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une perceuse électrique, et percez deux trous de 4 mm et un trou inférieur de 6 mm sur le côté gauche de la cage (figure 1B-j).
  11. Fixez la cage sur la plate-forme rectangulaire à l’aide de bandes autobloquantes à travers les trous d’angle (Figure 1B-k).
  12. Percez un trou de 5 mm dans le bouchon d’un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une perceuse électrique et bouchez le trou à l’aide d’une longue buse munie d’un robinet à bille pour éviter les fuites d’eau.
    REMARQUE : L’hydrogel serait une option alternative pour l’approvisionnement en eau si la personnalisation des bouteilles d’eau est difficile.
  13. Fixez la bouteille d’eau personnalisée sur le côté gauche de la cage à l’aide de bandes autobloquantes à travers les deux trous de 4 mm, la buse passant par le trou de 6 mm (Figure 1B-l).
  14. Connectez les fils électriques de sortie de l’adaptateur bloc d’alimentation aux deux bornes du moteur (Figure 1B-l).
    REMARQUE : Il n’y a pas d’exigence de polarité spécifique pour connecter les fils aux bornes du moteur.
  15. Connectez les fils électriques d’entrée de l’adaptateur bloc d’alimentation au contacteur temporisé (Figure 1B-m).

2. Induction de la privation de sommeil

  1. Appuyez sur les boutons de signe plus les plus à droite sur les moitiés gauche et droite du contacteur de temps (voir Tableau des matériaux), respectivement, jusqu’à ce que « M » apparaisse sur les compteurs mécaniques des deux côtés (Figure 1C-a).
  2. Appuyez sur les boutons du signe plus du milieu sur les moitiés gauche et droite du contacteur de temps jusqu’à ce que « 5M » apparaisse sur les compteurs mécaniques des deux côtés (Figure 1C-b).
  3. Appuyez sur le bouton du signe plus le plus à gauche sur la moitié gauche du contacteur de temps jusqu’à ce que « 15M » apparaisse sur le compteur mécanique gauche (Figure 1C-c).
    REMARQUE : Le contacteur de temps sera alors allumé pendant 15 min et éteint pendant 5 min en mode cyclique.
  4. Mettez les souris dans la cage avec de l’eau et de la nourriture ad libitum.
  5. Alimentez le contacteur temporisé et le ventilateur de refroidissement en alimentation.
    REMARQUE : La plate-forme basculera maintenant à 10 tr/min.
  6. Pesez chaque souris à l’heure Zeitgeber 0 (ZT0) tous les jours.
    REMARQUE : La lumière est allumée de 8 h (ZT0) à 20 h (ZT12).

3. Test de tolérance au glucose par voie orale

  1. Mesurez la glycémie à jeun chez les souris à jeun en prélevant du sang dans les veines de la queue.
  2. Injecter une solution de glucose dans chaque souris (2 g/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale à l’aide de seringues de 1 ml.
  3. Prélevez des échantillons de sang dans la veine de la queue et testez la glycémie 15 min, 30 min, 60 min et 120 min après l’injection de glucose, respectivement.
  4. Remettez les souris dans la cage avec la nourriture et l’eau ad libitum après le test.

4. Prélèvement des tissus cérébraux

  1. Décapita les souris après une anesthésie adéquate en les exposant à l’isoflurane (2%) pendant 3 à 5 minutes.
  2. Exposez le crâne et faites une incision verticale de 1 cm au niveau du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
  3. Retirez le crâne à l’aide d’hémostatiques de moustiques (voir le tableau des matériaux) pour exposer le tissu cérébral.
  4. Déplacez doucement tout le cerveau hors de la cavité crânienne à l’aide d’une pince à épiler incurvée.
    REMARQUE : Le tissu cérébral doit être retiré conformément aux politiques locales.
  5. Lavez le tissu cérébral à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate froid (1x PBS, 4 °C).
  6. Congelez le tissu cérébral intact dans de l’azote liquide et transférez le tissu à -80 °C pour un stockage à long terme.
    REMARQUE : Lorsqu’il est stocké à -80°C, le tissu cérébral congelé est stable pendant au moins 6 mois.

5. Détection de l’expression génique par réaction en chaîne par polymérase (PCR)

  1. Décongeler les tissus cérébraux à 4 °C ou sur de la glace.
  2. Transférez le tissu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et extrayez l’ARN total à l’aide de la méthode à base de TRIzol13.
  3. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux) après extraction de l’ARN.
  4. Effectuer la transcription inverse de l’ARN total (1 μg) en ADN complémentaire (ADNc) à l’aide d’un kit commercial14.
  5. Mesurer les niveaux d’expression génique par réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse en temps réel15.

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Résultats

Le dispositif établi pour la privation de sommeil chez la souris est illustré à la figure 1D. Au jour 7 après le début de la privation de sommeil, la surveillance de l’électroencéphalogramme (EEG) et de l’électromyographie (EMG)16 a indiqué que l’appareil réduisait considérablement la durée du sommeil et augmentait la durée de l’éveil chez la souris (Figure 2A-D). Pendant ce temps, le protocole actuel a c...

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Discussion

Les modèles murins de privation de sommeil sont essentiels pour étudier les effets de la perturbation du sommeil sur diverses maladies, notamment les maladies cardiovasculaires21, les troubles psychiatriques22 et les troubles neurologiques23. Parmi les stratégies de privation de sommeil existantes chez la souris, les approches physiques qui impliquent des interruptions répétitives et à court terme du sommeil sont les plus couramment utilisées

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82230014, 81930007, 82270342), du Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), de la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), du Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030), du SHWSRS (2023-62), du Shanghai Clinical Research Center for Aging and Medicine (19MC1910500) et du programme d’innovation postdoctorale du Bengbu Medical College (Byycxz21075).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLAxygenMCT-150-C-S
Tube de centrifugeuse de 50 mL602002
Kit ELISA d’adénosineTechnologie RuifanRF8885
Cage animaleZeYa techMJ2
Lecteur de glycémieYuYue580
C57BL/6J SourisJieSiJie Animal de laboratoireN/AÂge : 8-10 semaines
BielleShengXiang TechN/ALongueur : 20 cm
Ventilateur de refroidissementLiMingEFB0805VHTension d’alimentation : 5 V ; Consommation électrique : 1,2 W ; Débit d’air : 26,92 cfm ; Dimensions : 40 mm * 40 mm * 56 mm
Corticostérone Kit ELISAElabscienceE-OSEL-M0001
Système d’enregistrement et d’analyse EEG/EMGPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
anti-moustiquesFST13011-12Instrument chirurgical
Moteur et support moteurMingYangMY36GP-555Tension d’alimentation : 24 V dc ; Diamètre de l’arbre : 8 mm ; Couple de sortie maximal : 100 Kgf.cm ; Vitesse de sortie maximale : 10 tr/min
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Adaptateur de brique d’alimentationMingYangQiYe-0243Tension d’entrée : 110-220V ac ; Tension de sortie : 24 V c.c. ; Courant de sortie : 2 A ; Longueur du câble : 2 m
Kit commercial qPCRVazymeQ711-02
Équipement de mesure qPCRRoche480
Plate-forme rectangulaire fixée par un cylindre en acier compatible avec les visPersonnaliséN/ALargeur : 20 cm ; longueur : 25 cm ; longueur du cylindre : 30 cm, épaisseur : 2 mm
Kit commercial ARN inverse vers ADNcVazymeR323-01
Vis et écrouGuwanjiN/ADiamètre intérieur : 6 mm, 12 mm
Cylindre en acier compatible avec les vis PersonnaliséN/ALongueur : 300 mm
Canaux en acier fendusPersonnaliséN/ALongueur : 400 mm ou 500 mm, épaisseur : 2 mm
Contacteur temporiséLiXiangDH48S-STension d’alimentation : 110-220 V ac ; Unités mesurées : heures, minutes, secondes ; Configuration du contact : DPDT
TRIzolVazymeR401-01
NEST

Références

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Réimpressions et autorisations

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