Method Article

Automatisation du traitement des bourgeons d’agrumes pour la détection des agents pathogènes en aval grâce à l’ingénierie des instruments

DOI:

10.3791/65159

⸱

April 21st, 2023

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1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons conçu, fabriqué et validé un instrument qui traite rapidement les tissus de bourgeons d’agrumes riches en phloème. Par rapport aux méthodes actuelles, l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) a permis d’augmenter le débit d’échantillons et de réduire les coûts de main-d’œuvre et d’équipement requis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les agents pathogènes des agrumes transmissibles par les greffons et limités par le phloème, tels que les virus, les viroïdes et les bactéries, sont responsables d’épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans le monde entier. Par exemple, le virus de la tristeza des agrumes a tué plus de 100 millions d’agrumes dans le monde, tandis que « Candidatus Liberibacter asiaticus » a coûté 9 milliards de dollars à la Floride. L’utilisation de bourgeons d’agrumes testés pour la propagation des arbres est essentielle pour la gestion de ces agents pathogènes. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside utilise des tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour tester des milliers d’échantillons d’arbres sources de bourgeons d’agrumes chaque année afin de protéger les agrumes de Californie et de fournir des unités de propagation propres au National Clean Plant Network. Un goulot d’étranglement important dans la détection moléculaire à haut débit des virus et des viroïdes des agrumes est l’étape de traitement des tissus végétaux.

Une bonne préparation des tissus est essentielle pour l’extraction d’acides nucléiques de qualité et l’utilisation en aval dans les tests PCR. Le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation des tissus végétaux à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Cet article présente la validation d’un instrument spécialisé conçu pour traiter rapidement les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeon d’agrumes, appelé extracteur de tissu de bourgeon (BTE). Le contour d’oreille augmente le débit d’échantillons de 100 % par rapport aux méthodes actuelles. De plus, cela diminue la main-d’œuvre et le coût de l’équipement. Dans ce travail, les échantillons de contours d’oreille avaient un rendement en ADN (80,25 ng/μL) comparable au protocole de hachage manuel du CCPP (77,84 ng/μL). Cet instrument et le protocole de traitement rapide des tissus végétaux peuvent bénéficier à plusieurs laboratoires et programmes de diagnostic des agrumes en Californie et devenir un système modèle pour le traitement des tissus pour d’autres cultures ligneuses vivaces dans le monde entier.

Introduction

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Les agents pathogènes des agrumes limités par le phloème transmissibles par les greffons, tels que les viroïdes, les virus et les bactéries, ont provoqué des épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans toutes les régions productrices d’agrumes du monde. Les viroïdes d’agrumes sont des facteurs de production limitants en raison des maladies exocortis et de cachexie qu’ils causent dans les types d’agrumes économiquement importants, tels que les hybrides trifoliés, les mandarines, les clémentines et les mandarines 1,2,3. En Californie, ces types d’agrumes sensibles aux viroïdes sont à la base du marché croissant et rentable des « éplucheurs faciles », suivant la tendance changeante de la préférence des consommateurs pour les fruits faciles à peler, segmentés et sans pépins 4,5,6. Ainsi, les viroïdes d’agrumes sont réglementés par le Département de l’alimentation et de l’agriculture de Californie (CDFA) « Programme de propreté des ravageurs du matériel de pépinière d’agrumes – Projet de loi 140 du Sénat », et les laboratoires de la Direction du diagnostic des ravageurs des plantes du CDFA effectuent des milliers de tests de viroïdes d’agrumes chaque année 7,8,9,10 . Le virus de la tristeza des agrumes (CTV) a été responsable de la mort de plus de 100 millions d’agrumes depuis le début de l’épidémie mondiale dans les années 1930 3,9,10,11. En Californie, les isolats du virus résistants à la piqûre de la tige et à la rupture trifoliée constituent une menace sérieuse pour l’industrie californienne des agrumes, dont le chiffre d’affaires s’élève à 3,6 milliards de dollars. Par conséquent, le CDFA classe le CTV comme un phytoravageur réglementé de classe A, et le laboratoire de l’Agence d’éradication de la tristeza de Californie centrale (CCTEA) effectue des enquêtes approfondies sur le terrain et des milliers de tests de dépistage du virus chaque année15,16. On estime que la bactérie « Candidatus Liberibacter asiaticus » (CLas) et la maladie du huanglongbing (HLB) ont causé près de 9 milliards de dollars de dommages économiques à la Floride en raison d’une réduction de 40 % de la superficie d’agrumes, d’une diminution de 57 % des opérations d’agrumes et d’une perte de près de 8 000 emplois17,18. En Californie, une hypothétique réduction de 20 % de la superficie d’agrumes due au HLB devrait entraîner plus de 8 200 pertes d’emplois et une réduction de plus d’un demi-milliard de dollars du produit intérieur brut de l’État. Par conséquent, le programme de prévention des ravageurs et des maladies des agrumes dépense plus de 40 millions de dollars par an pour des enquêtes visant à tester, détecter et éradiquer les CLas de Californie14,17,19,20.

Un élément clé de la lutte contre les viroïdes, les virus et les bactéries des agrumes est l’utilisation de matériaux de multiplication testés par des agents pathogènes (c.-à-d. le bois de bourgeon) pour la production d’arbres. Le bois de bourgeon d’agrumes testé contre les agents pathogènes est produit et maintenu dans le cadre de programmes de quarantaine complets qui utilisent des techniques avancées d’élimination et de détection des agents pathogènes10,21. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside teste chaque année des milliers d’échantillons de bourgeons provenant de variétés d’agrumes nouvellement importées dans l’État et aux États-Unis, ainsi que d’arbres sources de bourgeons d’agrumes, afin de protéger les agrumes de Californie et de soutenir les fonctions du National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Pour gérer le grand volume d’analyses d’agrumes, des tests de détection d’agents pathogènes à haut débit, fiables et rentables sont un élément fondamental pour le succès de programmes tels que le CCPP 7,10,22.

Bien que les tests de détection d’agents pathogènes moléculaires tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) aient permis d’augmenter considérablement le débit dans les laboratoires de diagnostic des plantes, d’après notre expérience, l’un des goulots d’étranglement les plus critiques dans la mise en œuvre de protocoles à haut débit est l’étape de traitement des échantillons de tissus végétaux. Cela est particulièrement vrai pour les agrumes, car les protocoles actuellement disponibles pour le traitement des tissus riches en phloèmes tels que les pétioles des feuilles et l’écorce des bourgeons demandent beaucoup de main-d’œuvre, prennent du temps et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Ces protocoles nécessitent le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques 8,23,24. Par exemple, au laboratoire de diagnostic du CCPP, le traitement des échantillons comprend (i) le hachage manuel (6 à 9 échantillons/h/opérateur), (ii) la lyophilisation (16 à 24 h), (iii) la pulvérisation (30 à 60 s) et (iv) la centrifugation (1 à 2 h). Le processus nécessite également des fournitures spécialisées (p. ex., des tubes robustes à verrouillage de sécurité, des billes de broyage en acier inoxydable, des adaptateurs, des lames, des gants) et de multiples pièces d’équipement de laboratoire coûteuses (p. ex., congélateur à ultra-basse température, lyophilisateur, pulvérisateur de tissus, station de cryostation d’azote liquide, centrifugeuse réfrigérée).

Comme dans toute industrie, l’ingénierie des équipements et l’automatisation des processus sont essentielles pour réduire les coûts, augmenter le rendement et fournir des produits et des services uniformes et de haute qualité. L’industrie des agrumes a besoin d’instruments de traitement des tissus à faible coût qui nécessitent un minimum de compétences pour fonctionner et, en tant que tels, sont faciles à transférer aux laboratoires de diagnostic et aux opérations sur le terrain pour permettre une grande capacité de traitement des échantillons pour une détection rapide des agents pathogènes en aval. Technology Evolving Solutions (TES) et le CCPP ont mis au point (c.-à-d. conçu et fabriqué) et validé (c.-à-d. testé avec des échantillons d’agrumes et comparé aux procédures de laboratoire standard) un instrument peu coûteux (c.-à-d. éliminé le besoin d’équipement de laboratoire spécialisé) pour le traitement rapide des tissus d’agrumes riches en phloème (c.-à-d. le bois de bourgeon), appelé extracteur de tissus de bourgeon (BTE). Comme le montre la figure 1, le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour dépouiller les tissus d’écorce riches en phloème du bourgeon d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue contenant un tampon d’extraction, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire (figure 1). Le système contour d’oreille comprend également une application de suivi des échantillons sans papier et une application de pesage intégrée, qui enregistrent les informations de traitement des échantillons dans une base de données en ligne en temps réel.

Le système BTE a augmenté la capacité de diagnostic de laboratoire du CCPP de plus de 100 % et a toujours produit des extraits de tissus d’agrumes adaptés à la purification d’acides nucléiques de haute qualité et à la détection en aval d’agents pathogènes d’agrumes transmissibles par greffe à l’aide de tests PCR. Plus précisément, le contour d’oreille a réduit le temps de traitement des tissus de plus de 24 h à ~3 minutes par échantillon, a remplacé les instruments de laboratoire coûtant plus de 60 000 $ (figure 2, étapes 2 à 4) et a permis le traitement d’échantillons de plus grande taille.

Cet article présente les données de validation du traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit du contour d’oreille, de l’extraction des acides nucléiques et de la détection des agents pathogènes avec des échantillons de bourgeons d’agrumes provenant d’arbres sources, y compris tous les contrôles positifs et négatifs appropriés de l’installation de quarantaine de Rubidoux et de l’installation de la Fondation Lindcove, respectivement. Nous présentons également les changements de débit et de temps de traitement par rapport à la procédure de laboratoire actuelle (Figure 2). De plus, ce travail fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour les laboratoires d’analyse des agents pathogènes des agrumes et démontre comment le contour d’oreille peut soutenir les fonctions du matériel de pépinière, de l’enquête et des programmes d’éradication des agents pathogènes.

figure-introduction-1
Figure 1 : Extracteur de tissus de bourgeons. Le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour décaper les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeons d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire. Abréviation : BTE = extracteur de tissus de bourgeons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-introduction-2
Figure 2 : Comparaison étape par étape entre la procédure conventionnelle de hachage manuel en laboratoire et le traitement des contours d’oreille. Le traitement des contours d’oreille implique le traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit, l’extraction des acides nucléiques et la détection des agents pathogènes. Le temps de chaque étape est indiqué entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

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1. Collecte des échantillons de bourgeons d’agrumes à expédier

  1. Envoyez à Technology Evolving Solutions une feuille de calcul contenant des informations sur les arbres pour qu’ils puissent les charger sur leur serveur Web (éventuellement, l’utilisateur créera de nouveaux arbres).
  2. Utilisez le tracker TES de l’application téléphonique pour sélectionner un arbre et tenez une étiquette de collier de communication en champ proche (NFC) sur le téléphone pour charger les informations de l’arbre sur l’étiquette.
  3. Insérez trois à quatre échantillons de bourgeons d’agrumes dans le porte-sac en plastique compatible avec le contour d’oreille et fermez avec le couvercle.
    1. Assurez-vous que la longueur du bourgeon ne dépasse pas 8 po et n’est pas inférieure à 5 po.
      1. Si la longueur est supérieure à 8 po, utilisez une lame de rasoir jetable stérile ou un sécateur décontaminé avec une solution d’eau de Javel à 10 % (hypochlorite de sodium à 1 %) pour le raccourcir.
      2. Si la longueur est inférieure à 5 po, prélevez un autre échantillon de bois de bourgeon pour le mettre dans le sac.
    2. Assurez-vous que toute excroissance axillaire ou grosse épine est enlevée à la main ou à l’aide d’outils de coupe désinfectés à 10 % d’eau de Javel (hypochlorite de sodium à 1 %).
      REMARQUE: Cette étape est importante pour que le bourgeon soit plus facile à manœuvrer dans l’ouverture de la chambre.
    3. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’échantillons de bourgeons qui ont des caractéristiques incurvées. Si c’est le cas, retirez-les à l’aide d’outils de coupe désinfectés à 10 % d’eau de Javel (hypochlorite de sodium à 1 %) et placez dans les sacs contour d’oreille uniquement les parties droites de l’échantillon.
      REMARQUE: Le bois de bourgeon incurvé est très difficile à manœuvrer dans l’instrument, ce qui entraîne des rayures d’écorce inégales.
  4. Utilisez le tracker TES de l’application téléphonique pour scanner l’étiquette du collier NFC de l’arbre et la lier à l’étiquette de clip NFC sur le sac d’échantillons.
  5. Faites attention à l’épaisseur du bourgeon car cela détermine la façon dont l’opérateur décapera l’écorce de bourgeon riche en phloème à l’intérieur de la chambre du contour d’oreille.
    1. Si le bourgeon a une épaisseur inférieure à 0,20 po, soyez prudent lorsque vous décapage le bourgeon car les fils de rotation à grande vitesse dans la chambre pulvériseront le bourgeon entier jusqu’à son noyau, au-delà de la couche d’écorce et dans les tissus non riches en phloème du bois et de la moelle.
    2. Choisissez des bourgeons plus épais car il est plus facile de décaper les tissus de l’écorce tout en évitant les tissus de bourgeons non riches en phloème.
  6. Placez les échantillons dans un conteneur d’expédition isotherme avec quelques blocs réfrigérants.

2. Installation dans la hotte

REMARQUE: Il est préférable de faire fonctionner le contour d’oreille à l’intérieur d’une hotte. Cela réduira le risque de contamination croisée des tissus végétaux et de contamination des laboratoires.

  1. Désinfecter à l’aide d’un vaporisateur à 10 % (hypochlorite de sodium à 1 %).
    1. Vaporisez la surface de la hotte et laissez l’eau de Javel reposer pendant environ 1 minute avant de l’essuyer avec une serviette en papier.
    2. Vaporisez une serviette en papier avec la solution d’eau de Javel. Essuyez la base TE, les composants de la balance (balance, bouclier d’air et tour) et un marqueur.
  2. Déballez un ensemble de seringues pour le nombre d’échantillons à traiter et placez-les dans une boîte en carton couverte.
  3. Ayez un paquet d’écouvillons à portée de main à l’extérieur de la hotte au cas où vous en auriez besoin.
  4. Préparez la balance.
    1. Retirez la tour de musculation de la balance et maintenez le bouton d’alimentation enfoncé pour l’allumer. Placez la tour au centre de l’échelle une fois que l’échelle affiche 0.
    2. Faites glisser le bouclier d’air de la balance sur l’avant de la balance.
  5. Préparez la base de l’extracteur de tissus en actionnant l’interrupteur situé à l’arrière. Assurez-vous que l’interrupteur sur le côté gauche de la boîte est enfoncé sur le dessus. Attendez qu’une LED verte clignote, qui indique que la chambre est prête.

3. Installez les stations de nettoyage (figure supplémentaire S1).

  1. Placez 1 L d’eau dans le nettoyeur à ultrasons.
  2. Enroulez deux sacs poubelle sur le dessus du nettoyeur à ultrasons.
  3. Versez ~5 L d’eau de Javel à 10 % (solution d’hypochlorite de sodium à 1 %) dans le nettoyeur à ultrasons.
  4. Remplissez le réservoir d’eau avec suffisamment d’eau pour immerger une chambre.
  5. Allumez le compresseur d’air et ouvrez la vanne.
  6. Installez une toile de fond pour récupérer le liquide pendant que la chambre sèche.

4. Traitement du matériau pour le contour d’oreille pour le décapage de l’écorce de bourgeon d’agrumes

  1. Chargez la chambre sur la base du contour d’oreille.
    1. Préparez la chambre du contour d’oreille.
      1. Fixez un sac d’échantillon vide à l’arrière de la chambre. Utilisez deux joints toriques pour fixer le sac vide à la buse arrière de la chambre du contour d’oreille.
      2. Inspectez la lame pour détecter des signes d’usure ou de dommages, tels que des coupures qui se forment sur la lame à l’endroit où elle continue dans le plastique ou des coupures qui se forment sur la pointe. Assurez-vous que la flèche sur la lame est alignée avec le symbole de verrouillage unique.
      3. Assurez-vous que le dégagement d’air au fond de la chambre est tourné vers le symbole O . Placez le couvercle transparent sur l’ouverture de la chambre et faites glisser la glissière BTE transparente sur la chambre à l’aide du rail situé à droite de la chambre. Poussez le verrou au fond de la chambre aussi loin que possible dans la glissière. Assurez-vous que le capuchon du piston est monté sur le dessus de la glissière.
    2. Placez la chambre sur la base du contour d’oreille avec la buse de la base du contour d’oreille dépassant à l’arrière de la chambre. Attendez que la LED bleue clignote, indiquant que le placement est réussi.
  2. Chargez l’échantillon sur la base du contour d’oreille en déplaçant l’autocollant blanc sur l’étiquette de clip NFC vers un Z sur le côté droit de la boîte. Déplacez la balise dans un lent mouvement circulaire sur Z jusqu’à ce que le voyant jaune commence à clignoter. Fixez l’échantillon à la base du contour d’oreille et assurez-vous que le sac d’échantillon n’est pas troué. S’il y a un trou, réparez-le avec du ruban adhésif. Placez le joint torique sur le sac d’échantillon pour le fixer à l’avant de la buse BTE.
  3. Chargez le jeu de seringues inutilisé.
    1. Tarer le jeu de seringues. Placez la seringue inutilisée sur la tour de la balance. Retirez le jeu de seringues lorsqu’un voyant rouge commence à clignoter ou que la balance affiche 0.
    2. Retirez le piston de la seringue avec le filtre. Assurez-vous que le liquide se trouve dans la seringue inférieure (sans filtre). Placez le piston de côté sur une serviette en papier ou sur la tour où le piston noir ne touche aucune surface.
    3. Fixez la seringue à l’orifice de sortie coulissant en appuyant sur l’orifice de sortie dans la seringue et en le tournant à 90°.
  4. Traitez l’échantillon de bois de bourgeon.
    ATTENTION : Le contour d’oreille a des pièces mobiles à grande vitesse. Toutes les opérations doivent se dérouler à l’intérieur d’une hotte. Tous les utilisateurs doivent utiliser des lunettes de protection, des cache-oreilles (bouchons d’oreille) et tout autre équipement de protection individuelle (EPI), tel que des gants et des blouses de laboratoire.
    1. Appuyez sur le bouton noir supérieur pour démarrer la machine. Appuyez une deuxième fois pour arrêter le moteur à tout moment pendant le traitement.
      REMARQUE: La boîte est dotée d’une détection de vitesse et de température pour garantir son bon fonctionnement.
    2. Saisissez un bâton de budwood dans le sac et passez-le dans le haut de la buse BTE.
    3. Saisissez le bâton de bourgeon de l’autre côté de la chambre avec l’autre main et descendez lentement dans la lame. Écoutez un léger bourdonnement indiquant que le bourgeon est dépouillé de son écorce. Déplacez lentement le bois de bourgeon d’avant en arrière tout en le faisant tourner.
      1. Si vous entendez un bruit de hachage fort et agressif, déplacez rapidement la branche vers le haut et/ou appuyez sur le bouton supérieur pour arrêter le moteur. Pour arrêter le moteur, utilisez l’interrupteur de droite pour terminer le traitement (voir étape 4.4.3.2).
      2. Si aucun matériau ne sort de la sortie lors de la coupe, la chambre est obstruée. Éteignez le moteur, retirez le capuchon du piston coulissant et utilisez le plastique de l’écouvillon pour pousser le bouchon vers la sortie de la machine. Utilisez l’interrupteur de droite pour terminer le traitement : Haut = Coupe vers l’avant ; Milieu = Moteur éteint ; Vers le bas = Coupe inversée.
    4. Répétez les étapes 4.4.2 et 4.4.3 pour les branches restantes.
      REMARQUE: Un indicateur général qu’une quantité suffisante d’écorce de bourgeon a été enlevée est lorsque 25% de la seringue a été remplie de tissu végétal. Les agents pathogènes des agrumes transmissibles par les greffons pourraient être répartis de manière inégale dans l’arbre. Par conséquent, trois à quatre échantillons de bourgeons sont prélevés autour de la canopée des agrumes. Il est important que chaque échantillon de bourgeon dans le sac de transport du contour d’oreille contribue à l’échantillon final de tissu broyé afin de s’assurer qu’un échantillon complet représentatif de l’arbre sera analysé pour détecter les agents pathogènes.
    5. Appuyez sur le bouton noir supérieur pour arrêter le traitement. Attendez que le voyant recommence à clignoter en jaune.
  5. Vérifiez le poids de l’échantillon.
    1. Faites pivoter la seringue de 90° et tirez-la vers le bas pour la détacher. Replacez le piston sur la seringue et placez la seringue sur la tour.
    2. Attendez que la balance détecte automatiquement l’échantillon et déterminez s’il se situe dans la plage de poids appropriée (0,25 ± 0,05 g). Si le poids de l’échantillon est trop faible (<0,20 g), répétez l’étape 4.4 ; la LED rouge commencera à clignoter. Si le poids de l’échantillon est trop élevé (>0,30 g), retirez une partie de l’échantillon ; la LED jaune commencera à clignoter plus lentement. Si l’échantillon se trouve dans la plage, la LED verte commencera à clignoter.
  6. Homogénéisation de l’échantillon de bourgeon
    1. Retirez le piston de la seringue contenant l’échantillon, poussez le liquide dans la seringue contenant l’échantillon et rajoutez le piston. Le piston pousse le tampon et la sève de la plante à travers le filtre à mailles (en retenant les gros morceaux de tissu d’écorce) et via le tube en caoutchouc dans la seringue vide.
    2. Mélangez l’échantillon en poussant le tampon et la sève de la plante d’avant en arrière d’une seringue à l’autre. Répétez ~3x-4x et jusqu’à ce que l’échantillon devienne un mélange liquide vert homogène.
    3. Une fois bien homogénéisé, poussez l’échantillon de sève végétale dans la seringue sans le filtre à mailles, et détachez le tube en caoutchouc et la seringue avec le filtre de la seringue avec l’échantillon.
    4. Expulser l’échantillon de sève végétale de la seringue dans un tube de microcentrifugation stérile de 2 ml et conserver à −20 °C jusqu’à nouvel usage. Utilisez un marqueur permanent pour étiqueter l’échantillon avec le numéro du sac.
      REMARQUE : La sève de l’échantillon végétal de l’étape 4.6.5 peut maintenant être traitée avec n’importe laquelle des méthodes d’extraction d’acides nucléiques, d’ARN ou d’ADN disponibles, à base de phénol-chloroforme, de colonne de silice ou de billes magnétiques 9,25,26,27 pour l’extraction et la purification des acides nucléiques (voir l’étape 7) et la détection en aval des agents pathogènes des agrumes transmissibles par le greffon (voir l’étape 8).

5. Assainissement de la chambre amovible du contour d’oreille

ATTENTION: Si le tampon de l’ensemble de seringues entre en contact avec la chambre ou la glissière, rincez et suivez toutes les règles de sécurité du laboratoire avant de nettoyer. Le set de seringues contient du thiocyanate de guanidine. Si le tampon de la seringue entre en contact avec de l’eau de Javel, il créera du cyanure gazeux.

  1. Effectuez les étapes suivantes après le traitement du 10e échantillon dans la chambre. Notez que la LED verte continuera à clignoter au lieu de passer au bleu clignotant.
  2. Démontez la chambre du contour d’oreille pour nettoyer tous les contaminants possibles; Retirez le couvercle en plastique transparent, dégagez la glissière de la chambre et dégagez l’orifice d’obstruction de la glissière de la chambre.
  3. Tournez la soupape de décharge d’air au fond de la chambre en position ouverte (marque de cadenas ouverte). Placez les composants de la chambre dans le nettoyeur à ultrasons configuré (voir étape 3.1). Placez le couvercle sous la chambre pour l’empêcher de flotter. Faites fonctionner le nettoyeur à ultrasons pendant 15 min.
    REMARQUE: Le bain de nettoyage par ultrasons (5 L) peut contenir jusqu’à deux chambres.
  4. Rincez les composants de la chambre au bain-marie (étape 3.4) pendant au moins 30 s. Déplacez les composants de la chambre vers la station de séchage.
    ATTENTION: Le séchage provoquera des pièces en mouvement rapide dans la chambre, des bruits forts (~85 décibels [dB]) et des éclaboussures possibles. Tous les utilisateurs doivent utiliser des lunettes de protection, des cache-oreilles (bouchons d’oreilles), des blouses de laboratoire et tout autre EPI comme l’exigent les règles de sécurité du laboratoire d’opération.
  5. Séchez la chambre du contour d’oreille.
    1. Positionnez le pistolet à air comprimé dans l’axe de la rainure de l’ouverture supérieure de la chambre (là où se trouve généralement la glissière). Appuyez sur la gâchette du pistolet pour distribuer de l’air pendant ~30 s.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’ouverture est éloignée de l’utilisateur vers la toile de fond. Cela devrait faire tourner le jeu de lames pour éliminer le liquide emprisonné en dessous.
    2. Positionnez le pistolet à air comprimé vers les buses supérieures de la chambre. Appuyez sur la gâchette du pistolet à air comprimé et tracez lentement trois cercles complets de chaque entrée de buse.
    3. Positionnez le pistolet à air comprimé au centre du contour d’oreille. En partant du point le plus intérieur, maintenez la gâchette enfoncée et déplacez-vous jusqu’à ce que le pistolet à air comprimé pointe vers l’endroit où se trouverait la glissière.
    4. Faites passer rapidement de l’air sur toute la chambre, à l’avant et à l’arrière, pour évacuer l’eau de surface de l’extérieur.
  6. Séchez la lame BTE.
    1. Positionnez le pistolet à air comprimé dans la fente du piston de la glissière et appuyez sur la gâchette pour éjecter l’eau de la sortie de la glissière.
    2. Passez un pistolet à air comprimé le long de la surface intérieure de la glissière pour la sécher.
    3. Passez un pistolet à air comprimé le long de la rainure de la glissière pour faire sortir l’eau.
    4. Faites rapidement couler de l’air sur tout l’extérieur pour en évacuer l’eau de surface.
  7. Séchez les composants.
    1. Tenez le capuchon du piston coulissant et les joints toriques dans la main, puis appuyez sur la gâchette.
    2. Passez un pistolet à air comprimé sur la surface intérieure du couvercle.
    3. Placez les composants dans la chambre et faites-les glisser pour continuer à les sécher ou les remonter.
      REMARQUE: Pour un environnement de traitement des tissus élevé avec plusieurs contours d’oreille fonctionnels, un système d’assainissement par lots capable de décontaminer 10 chambres simultanément peut être fourni.

6. Mise au rebut et désinfection

  1. Jetez les seringues et les tubes en caoutchouc dans le conteneur à déchets de guanidine prévu à cet effet.
  2. Jetez toute matière végétale dans le conteneur de déchets biologiques dangereux.
  3. Retirez la chambre du contour d’oreille de la base du contour d’oreille.
  4. Démontez la chambre contour d’oreille et procédez à leur décontamination, comme décrit à l’étape 5.

7. Évaluation du traitement tissulaire et de la qualité de l’ARN purifié à partir des extraits de bourgeons d’agrumes BTE

REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 255 agrumes pour comparer le temps nécessaire au traitement des tissus de bourgeons d’agrumes et la qualité de l’ARN purifié à partir d’extraits de tissus d’écorce préparés par BTE (Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6) par rapport à celui préparé selon la méthode de traitement des tissus de bourgeons d’agrumes approuvée par la réglementation utilisant l’épluchage et le hachage à la main. la lyophilisation, la pulvérisation et la centrifugation du tissu de l’écorce, telles que décrites par Dang et al.23 (figure 2, côté gauche, étapes 1 à 6).

  1. Procédure de laboratoire actuelle : Préparer les échantillons de bois de bourgeon pour le traitement des tissus conformément à la méthode approuvée par la réglementation23.
    1. Procéder à l’épluchage et au hachage à la main du tissu de l’écorce, à la lyophilisation, à la pulvérisation, à la centrifugation et au transfert de la sève de la plante dans le tube d’extraction de l’ARN, comme décrit par Dang et al.23 (figure 2, côté gauche, étapes 1 à 6).
    2. Après avoir pelé à la main les trois à quatre échantillons de bourgeons de chaque arbre testé, placez tout le bois de bourgeons dans un porte-sac en plastique compatible avec les contours d’oreille et conservez-les à 4 °C jusqu’au traitement des contours d’oreille (étape 7.2).
  2. Procédure de contour d’oreille : Lancer le traitement des tissus de bourgeons d’agrumes d’ATB (section 4, étapes 4.1 à 4.6; Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6).
    1. Utilisez les échantillons de bois de bourgeon stockés à l’intérieur des sacs de transport du contour d’oreille de l’étape 7.1.2.
  3. Extraire et purifier l’ARN de la sève de la plante obtenue à partir de la procédure de laboratoire actuelle (étape 7.1.1) et de la procédure BTE (étape 7.2.2) à l’aide de la méthode semi-automatisée à base de billes magnétiquesapprouvée par la réglementation 8,23,28.
  4. Évaluer la qualité de l’ARN en mesurant sa concentration, sa pureté et son intégrité 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Pour calculer la concentration, utilisez la spectrophotométrie et la densité optique (OD) à une longueur d’onde de 260 nm.
    2. Pour évaluer la pureté, utilisez un rapport spectrophotométrique OD de 260/280.
    3. Pour vérifier l’intégrité, utilisez la réaction quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) à transcription inverse (RT) ciblant l’ARNm du gène24,32 de la NADH déshydrogénase des agrumes.

8. Évaluation de la contamination croisée et détection des virus et des viroïdes d’agrumes à l’aide d’ARN purifié à partir d’extraits de bourgeons d’agrumes BTE

REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 72 agrumes non infectés et d’un mélange d’arbres infectés par des virus et des viroïdes pour évaluer le potentiel de contamination croisée entre les échantillons lorsqu’ils sont traités par BTE (Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6) et la pertinence de l’ARN purifié à partir d’extraits de tissus d’écorce préparés par BTE pour être utilisé comme modèle pour la détection RT-qPCR des virus et des viroïdes des agrumes.

  1. Premier traitement de l’échantillon de contour d’oreille : Effectuez une expérience de base avec 72 échantillons non infectés.
    1. Préparez trois chambres de BTE (A-C) (étape 4.1.1).
    2. Préparez tous les échantillons de bourgeons d’agrumes non infectés (1 à 72) dans des sacs de transport d’ATB et préparez-en un nombre égal (72) dans le système de prélèvement d’échantillons d’ébouillons à deux seringues, avec un système de seringues pour chaque échantillon (étape 2.4).
    3. Séparez les sacs de transport d’échantillons et les seringues de prélèvement d’échantillons en six lots (I-VI) de 12 échantillons chacun.
    4. Amorcer le traitement des tissus du bourgeon d’agrumes du contour d’oreille (étape 4) en suivant la séquence ci-dessous (étapes 8.1.4.1 à 8.1.4.6) (voir le tableau 1, Traitement du premier échantillon de contour d’être).
      1. Pour le lot I/échantillons 1 à 12, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre A. Désinfecter la chambre A après l’échantillon 12 (étape 5).
      2. Pour le lot II/échantillons 13-24, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre B. Désinfecter la chambre B après l’échantillon 24 (étape 5).
      3. Pour le lot III/échantillons 25-36, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre C. Désinfecter la chambre C après l’échantillon 36 (étape 5).
      4. Pour le lot IV/échantillons 37-48, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée A (étape 8.1.4.1).
      5. Pour le lot V/échantillons 49 à 60, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée B (étape 8.1.4.2).
      6. Pour le lot VI/échantillons 60-72, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée C (étape 8.1.4.3).
    5. Conservez les sacs de transport contour d’oreille avec tous les échantillons à 4 °C jusqu’à l’utilisation à l’étape 8.2.
    6. Extraire et purifier l’ARN des 72 échantillons de sève végétale générés aux étapes 8.1.4.1 à 8.1.4.6 à l’aide de la méthode semi-automatisée à base de billes magnétiques 8,23,28 approuvée par la réglementation.
    7. Effectuer la RT-qPCR pour la détection des virus et des viroïdes des agrumes, comme décrit précédemment 8,33.
  2. Pour le deuxième traitement d’échantillons d’objets contours d’oreille, effectuez une expérience de contamination croisée avec 70 échantillons non infectés et deux échantillons infectés mixtes.
    1. Préparez trois chambres de BTE (A-C) (étape 4.1.1).
    2. Préparer l’échantillon de bourgeons d’agrumes infectés par le mélange (73) dans deux sacs de transport d’ETC (étape 1.3) pour un nombre total de deux échantillons infectés.
    3. Rassemblez les sacs de transport du contour d’oreille avec les échantillons de bourgeons d’agrumes non infectés de l’étape 8.1.5, à l’exception de l’échantillon 3-lot I et de l’échantillon 51-lot V (voir le remplacement de l’échantillon à l’étape 8.2.4), pour un nombre total de 70 échantillons non infectés.
    4. Inclure le premier sac de transport du contour d’oreille avec l’échantillon 73 infecté par le mélange à la place de l’échantillon 3 dans le lot I et le second à la place de l’échantillon 51 dans le lot V pour un nombre total de 72 échantillons.
    5. Préparez un nombre égal (72) dans le système de prélèvement d’échantillons contour d’oreille à deux seringues, avec un système à double seringue pour chaque échantillon (étape 2.4).
    6. Séparez les 72 sacs de transport d’échantillons et les seringues de prélèvement d’échantillons en six lots (I-VI) de 12 échantillons chacun.
    7. Lancer le traitement des tissus du bourgeon d’agrumes BTE (étape 4), en suivant la même séquence qu’aux étapes 8.1.4.1-8.1.4.6.
      REMARQUE : La seule différence est le remplacement de l’échantillon 3 du lot I et de l’échantillon 51 du lot V par l’échantillon 73 infecté (étape 8.2.4) (Tableau 1, Traitement du deuxième échantillon d’objet contour d’oreille).
    8. Extraire et purifier l’ARN des 72 échantillons de sève végétale générés à l’étape 8.2.7 comme à l’étape 8.1.6.
    9. Effectuez une RT-qPCR pour la détection des virus et des viroïdes des agrumes, comme à l’étape 8.1.7.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extraction, purification et qualité de l’ARN à l’aide de tissus d’agrumes de bourgeons traités par BTE et évaluation du temps de traitement des tissus
Nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 255 agrumes représentatifs pour ce test afin de comparer la qualité de l’ARN du contour d’oreille par rapport à la procédure standard. Les échantillons ont été traités à l’aide de l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) (étapes 4.1 à 4.6 du protocole et figure 2, côté droit, étapes 1, 5 et ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avec l’avènement de la maladie HLB des agrumes, pour réduire les pertes, l’industrie des agrumes, les organismes de réglementation et les laboratoires de diagnostic ont été invités à s’appuyer sur des méthodes d’extraction d’acides nucléiques à haut débit combinées à des tests manuels de traitement des échantillons et de détection d’agents pathogènes à faible débit tels que la qPCR34 pour tester des arbres individuels, en combinaison avec des pratiques de gestion des maladies35

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent le peuple Cahuilla comme les gardiens traditionnels de la terre sur laquelle les travaux expérimentaux ont été achevés. Nous sommes reconnaissants au professeur Norman Ellstrand de l’Université de Californie, Riverside, d’avoir fourni un espace de laboratoire pour mener des activités de recherche dans le cadre de ce projet dans le cadre de l’initiative UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Cette recherche a été financée par le Programme de subventions globales pour les cultures spéciales (subvention no 18-0001-055-SC). Un soutien supplémentaire a également été fourni par le projet CRB 6100; Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, projet Hatch 1020106; et le National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) décerné à Georgios Vidalakis.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fil de coupe hexagonale de 0,08 poPowerCareFPRO07065nécessaire pour remplacer les lames.
Compresseur d’air de 1 hp, 8 galCalifornia Air Tools8010Chambres à séchage rapide après rinçage
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLGlobe Scientific111558BStocker l’échantillon après le rinçage avec des seringues
Technologie de seringue de 10 mL SolutionsévolutivesTE006-F1-10A-G1000-E1Le matériau de la seringue est coupé. Flacon de 1 L avec tampon thiocyanate de guanidine. AVERTISSEMENT - contient du thiocyanate de guanidine, des déchets dangereux service requis - ne pas mélanger avec de l’eau de Javel
12" RulerWestcott&lrm ; 16012Pour mesurer le fil de coupe avant de couper
l’hypochlorite de sodium à 12 %Hasa1041Désinfecte les chambres après le
traitement-20 C CongélateurInsigniaNS-CZ70WH0Stocker l’échantillon après le traitement
Sacs en plastique de 4 po x 12 poPlymorFP20-4x12-10Sacs pour retenir les branches pendant le transport. Les joints toriques fixent le sac à la chambre BTE pour sceller 6
" Coton-tigePuritan806-PCLÉcouvillon pour enlever les obstructions
Fourre-tout de rangement de 7 gallonsHDX206152Contient une solution d’hypochlorite de sodium pour désinfecter les chambres et de l’eau pour rincer les chambres Soufflette
airJASTIND&lrm ; JTABG103ADirige l’air dans les chambres à haute pression
Black SharpieSharpie  ; S-19421Marquez les tubes de 1,5 ml afin que vous puissiez identifier l’échantillon plus tard
Dispensateur de marqueZ627569de bouteille réglable pour distribuer de la guandine dans la seringue
chambre BTESolutions évolutivesTE002BB-A05-E1Utilisé pour traiter le bois de bourgeon. Comprend des joints toriques, une glissière BTE, un piston coulissant, une soupape de vidange, un couvercle, un jeu de lames et un outil de retrait
du jeu de lames Savon à vaisselleDawn57445CTSurfectant pour améliorer la pénétration de l’hypochlorite de sodium dans la chambre
Hotte avec filtre hepaAir ScienceP5-36XT-AHotte avec filtre hepa (ASTS-030) pour limiter la contamination possible et protéger contre les déversements de produits chimiques
Conteneurd’expédition en mousse isoléPolarTech261/J50CConteneur d’expédition isolé pour expédier des échantillons sur de la glace après leur collecte
Blouse de laboratoireRed KapKP14WH LN 46Blouse de laboratoire pour limiter les contaminations possibles et protéger contre les déversements de produits chimiques
Ordinateur portablecompatible MicrosoftSurfaceWifi pour exécuter TES GUI. Nécessaire pour la configuration initiale et fournit des informations plus approfondies sur la base de traitement des tissus
Téléphone compatible NFCTéléphone SamsungGalaxy S9pour télécharger et utiliser l’application téléphonique TES
étiquette de clip NFC Technologie, Solutions évolutivesTE005-Clip-E1Étiquette d’échantillon qui peut être liée à des arbres. Conçu pour fonctionner avec l’application téléphonique TES
Technologie NFC Collar TagSolutions évolutivesTE005-Collar-E1Étiquette attachée à un arbre. Conçu pour fonctionner avec l’application téléphonique TES
Gants en nitrileUsa Scientific3915-4400Gants pour limiter la contamination possible et protéger contre les déversements de produits chimiques
Casque antibruit3M90565-4DC-PSProtégez les oreilles pendant le fonctionnement du compresseur d’air et de la base de traitement des tissus
Tuyau d’air de recul en polyuréthaneFYPower&lrm ; 510019Fixe le pistolet à air comprimé au compresseur
Lunettes de sécuritéSolidworkSW8329-USProtégez les yeux contre les dangers chimiques et physiques
Flacon pulvérisateurJohnBeeB08QM81BJVVaporisez de l’eau de Javel sur les surfaces décollatinées
Extracteur de tissus Technologie de baseSolutions évolutivesTE001-A-E1Système de traitement des tissus végétaux. Nécessite des chambres BTE ou LTE pour fonctionner. Comprend un câble d’alimentation, un adaptateur de lame et une clé Allen 8/32
Balance de poids de base de traitement des tissusTechnologie des solutions évolutivesTE003-A05-200g-01-E1200 g, balance de poids de résolution 0,01 qui se connecte à la base de traitement des tissus pour appliquer des plages de poids et/ou lier les poids à l’échantillon. Comprend une balance, un câble d’alimentation, un câble de connexion, un porte-seringue de 5 ml, un bouclier d’air de tour.
VermiculiteEasyGoProductsB07WQDZGRPNécessaire pour transporter des déchets dangereux (guanidine thiocyanate) à l’aide d’un service d’élimination des déchets dangereux
Coupe-filBoenfu&lrm ; BOWC-06002-USCoupe-fil pour couper le fil de coupe
à Technologie de, "

References

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

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Citrus Budwood ProcessingPathogen DetectionBudwood Tissue ExtractorNucleic Acid ExtractionCitrus Virus DetectionHigh Throughput ScreeningPlant Tissue HomogenizationPCR AssaysPhloem Rich TissueMolecular Diagnostics

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