Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Résumé

Le protocole actuel met à jour les protocoles précédents et intègre des approches relativement simples pour la culture d’explants cochléaires de haute qualité. Cela permet une acquisition de données fiable et une imagerie haute résolution dans les cellules vivantes et fixes. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle à l’étude des cellules de l’oreille interne.

Résumé

La perte auditive non traitée impose des coûts importants au système de santé mondial et nuit à la qualité de vie des individus. La surdité neurosensorielle se caractérise par la perte cumulative et irréversible des cellules ciliées sensorielles et des nerfs auditifs de la cochlée. Les explants cochléaires entiers et vitaux sont l’un des outils fondamentaux de la recherche sur l’audition pour détecter la perte de cellules ciliées et caractériser les mécanismes moléculaires des cellules de l’oreille interne. Il y a de nombreuses années, un protocole d’isolement cochléaire néonatal a été mis au point et, bien qu’il ait été modifié au fil du temps, il présente encore un potentiel d’amélioration.

Cet article présente un protocole optimisé pour l’isolement et la culture d’explants cochléaires néonatals entiers dans des chambres de culture multi-puits qui permet l’étude des cellules ciliées et des cellules neuronales ganglionnaires spiralées sur toute la longueur de la cochlée. Le protocole a été testé à l’aide d’explants cochléaires de souris et de rats. Des explants cochléaires sains ont été obtenus pour étudier l’interaction entre les cellules ciliées, les cellules neuronales ganglionnaires spirales et les cellules de soutien environnantes.

L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle simplifie les étapes de culture d’organes sans compromettre la qualité des explants. Les trois tours de l’organe de Corti sont fixés au fond de la chambre, ce qui facilite les expériences in vitro et l’analyse complète des explants. Nous fournissons quelques exemples d’images cochléaires issues de différentes expériences avec des explants vivants et fixés, démontrant que les explants conservent leur structure malgré l’exposition à des médicaments ototoxiques. Ce protocole optimisé peut être largement utilisé pour l’analyse intégrative de la cochlée des mammifères.

Introduction

La plupart des cas de surdité neurosensorielle sont dus à la dégénérescence des cellules ciliées sensorielles, des cellules nerveuses auditives et/ou des synapses auditives¹. Ce processus dégénératif dans les cellules sensorielles est progressif et généralement irréversible, entraînant ainsi une perte auditive². Par conséquent, les informations sur la viabilité des cellules sensorielles et les changements dans les voies de signalisation dans des conditions de stress sont essentielles pour protéger les cellules contre les dommages et, par conséquent, la perte. L’étude des explants cochléaires en culture permet la récapitulation du complexe tissulaire et le maintien d’un réseau cellulaire-cellulaire normal, ce qui permet une meilleure description des processus de signalisation. Pour établir des modèles expérimentaux d’ototoxicité, l’antibiotique gentamicine et l’agent chimiothérapeutique cisplatine ont souvent été utilisés, car ils sont connus pour avoir des effets secondaires ototoxiques³.

Des systèmes de culture in vitro d’explants cochléaires ont été développés et modifiés au fil du temps ; Cependant, une description du protocole par étapes pour la culture d’explants cochléaires entiers est souvent absente dans plusieurs publications. L’un des premiers protocoles vidéo pour la culture primaire de l’organe murin de Corti a été publié par Parker et al., dans lequel les auteurs décrivaient les étapes de l’isolement de l’épithélium sensoriel, de la culture sur des lamelles de verre et de l’électroporation d’explants pour des expériences de transfection⁴. Un autre protocole utilisant des lamelles de verre a également été publié précédemment, dans lequel l’organisation de la structure cellulaire dans l’oreille interne a été considérée^{comme 5}. Un protocole alternatif utilisant la membrane Millicell pour la culture d’explants murins de l’organe de Corti et de l’organe vestibulaire a été rapporté⁶. Ces reportages vidéo ont contribué à l’amélioration de la méthode, mais il reste encore des défis à résoudre. Pour résoudre un certain nombre de problèmes découlant de l’utilisation de lamelles et d’inserts en verre, le présent protocole vise à rationaliser les étapes de culture d’organes et à cultiver des organes de haute qualité pour obtenir des données fiables. Ceci est réalisé en minimisant la manipulation directe de l’organe pendant les procédures expérimentales et en évitant le transfert d’organes avant d’obtenir des images haute résolution des cellules vivantes et fixes.

Le présent protocole met à jour les systèmes de culture in vitro précédemment publiés et introduit plusieurs optimisations dans l’isolement de l’organe de Corti et le transfert vers les chambres de culture, ainsi que l’intégration d’une nouvelle chambre de glissement pour améliorer les conditions de culture et une analyse plus approfondie. Ce protocole optimisé réduit le risque d’endommager l’organe, ce qui peut se produire lors de l’utilisation de lamelles en verre lors du changement de milieu ou lors du transfert de l’organe à partir de lamelles ou de membranes pour une analyse plus approfondie ^4,5,6. Les lamelles en verre ont un meilleur indice réfléchissant que celles en plastique ; Ils sont cependant fragiles et peuvent se casser plus facilement. Les chambres multipuits utilisées ici sont fixées à une lame de microscope, ce qui est bien adapté à la culture d’organes et à l’imagerie à haute résolution. Le transfert des organes isolés est effectué à l’aide d’une spatule, ce qui permet d’amener l’organe dans la bonne orientation et de le glisser dans la chambre, plutôt que d’appliquer une force avec une pipette comme recommandé précédemment ^4,5,6.

Les chambres multipuits revêtues de poly-D-lysine, qui doivent contenir suffisamment de milieu, facilitent le transfert d’organes et le bon positionnement des explants sans appliquer de pression adhésive et tout en évitant le chevauchement des organes, comme mentionné précédemment⁶. De plus, les chevauchements accidentels d’organes et les structures inégales sont résolus à l’aide d’un empilement confocal en Z. Ce protocole a été optimisé pour diverses applications, telles que les explants de souris et de rats, les explants de l’organe de Corti et de la cochlée, la culture dans un milieu contenant et sans sérum, les évaluations ototoxiques et les expériences générales de réponse médicamenteuse. Les explants cochléaires sont montés et incubés dans des chambres avec un fond de lamelles, ce qui facilite l’adhérence des explants cochléaires aux chambres pour une manipulation optimale lors des expériences in vitro , du post-traitement des explants et de l’imagerie des explants cochléaires vivants et fixes. La visualisation de toute la longueur de l’organe de Corti et la quantification des cellules ciliées sont rationalisées. De plus, les évaluations des cellules de soutien, des cellules neuronales ganglionnaires spirales et des neurites sont précises. Par conséquent, ce protocole peut être utilisé pour une analyse complète des cellules cochléaires des mammifères.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux directives et règlements du Comité de protection des animaux du canton de Bâle-Ville, en Suisse. Des souris postnatales C57BL/6JR, des rats Wistar et des souris déficientes en STAT1 (mixtes C57BL/6-129/SvEv)⁷ âgées de 3 à 5 jours et des deux sexes ont été utilisées pour les expériences.

1. Revêtement des chambres multi-puits

1. Préparer le milieu de culture complet.
   1. Pour les explants d’organes de Corti, préparer un milieu contenant du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 25 mM HEPES et 30 U/mL de pénicilline.
   2. Pour les explants d’organes de Corti et les explants cochléaires, préparez un milieu contenant du DMEM/F12, 1 supplément de N2, 1 x B27 moins d’antioxydants et 30 U/mL de pénicilline.
2. Préparer une solution mère de poly-D-lysine en ajoutant 10 mL d’eau de culture cellulaire à 5 mg de poly-D-lysine dans une hotte laminaire. La concentration finale de poly-D-lysine est de 0,5 mg/mL.
   REMARQUE : Aliquoter le reste de la solution mère et conserver à −20 °C.
   1. Préparer les solutions de travail de poly-D-lysine en diluant la solution mère 1 :10 dans de l’eau stérile.
3. Enduire une chambre à 8 puits de 150 μL/puits de solution de travail de poly-D-lysine et incuber pendant 30 min à température ambiante.
   REMARQUE : Si une chambre à 4 puits est utilisée, enduire de 300 μL/puits de solution de travail de poly-D-lysine.
4. Aspirer la solution par aspiration ou pipetage.
5. Laver 2 fois avec 200 μL d’eau stérile et une fois avec 200 μL de milieu de culture complet ou DMEM.
6. Ajouter 150 μL de milieu de culture complet dans chaque puits.
   REMARQUE : Si une chambre à 4 puits est utilisée, ajouter 250 μL/puits de milieu de culture complet.
7. Placez la chambre dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 30 min avant de placer un explant.

2. Dissection de l’os temporal

1. Désinfectez la table d’opération avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez tous les instruments dans un stérilisateur à microsphères en verre.
2. Placez une boîte de Pétri stérile de 60 mm sur un seau contenant de la glace.
3. Versez quelques millilitres de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x et conservez-la sur de la glace.
   REMARQUE : Utilisez 30 U/mL de pénicilline dans 1x PBS pour éviter la contamination bactérienne.
4. Placez un tampon stérile sur un plateau stérile et décapitez rapidement le chiot avec des ciseaux d’opération. Immergez la tête dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 secondes, si la contamination est fréquente.
   REMARQUE : Ce protocole a été testé sur des souris et des rats âgés de P3 à P5. Les tissus cochléaires sont plus difficiles à disséquer chez les souris et les rats plus âgés, et la survie des explants en culture est limitée.
5. Placez la tête de l’animal sur un tampon stérile. Retirez la mandibule. Soulevez la peau et décollez-la du crâne.
6. Tenez le crâne en plaçant la pince dans les cavités orbitaires.
7. Coupez soigneusement le crâne le long de la suture sagittale, puis coupez dans la zone de suture coronale avec une lame de scalpel tranchante sans endommager la cochlée.
   REMARQUE : Évitez d’appliquer trop de pression et évitez les mouvements vers l’avant et vers l’arrière avec le scalpel, car cela pourrait endommager l’os cochléaire et, par conséquent, le canal cochléaire.
8. Retirez délicatement le cerveau des deux moitiés du crâne.
9. Transférez les moitiés de crâne dans une boîte de Pétri de 60 mm avec le PBS glacé préparé à l’étape 2.3.

3. Isolement de la cochlée

1. Localisez la cochlée dans l’os temporal au microscope. Placez la pince dans le canal semi-circulaire supérieur.
2. Détachez le tissu environnant entre la cochlée et l’os temporal à l’aide d’une seringue à insuline (souris) ou d’une pince (rats).
3. Retirez délicatement l’os temporal de la cochlée, en gardant la cochlée attachée au vestibule avec l’os temporal. Assurez-vous que la cochlée est libre du tissu environnant avant de pousser l’os temporal de côté.
   REMARQUE : L’application d’une force trop forte endommagera le canal cochléaire.
4. Tenez la cochlée dans une position fixe et utilisez l’autre main pour retirer délicatement la capsule cochléaire cartilagineuse. Insérez délicatement les pointes de la pince dans la région de l’apex ou entre les spires (visibles sous forme de ligne blanche) et retirez la capsule morceau par morceau. Exposer le canal cochléaire.
5. Placez délicatement la pince sous la cochlée et détachez-la de l’organe vestibulaire et de l’os temporal.
6. Transférez la cochlée dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant du PBS glacé.
7. Ajustez le grossissement du microscope pour mieux visualiser les explants.
8. Suivez les étapes suivantes pour les explants d’organes de Corti :
   1. Tenez l’organe à la base avec des pinces. Retirez délicatement le canal cochléaire en le saisissant avec une pince au niveau de la région du crochet basal.
   2. Déroulez le canal cochléaire du modiolus sans le déchirer.
   3. Retirez délicatement le ligament spiral avec la strie vasculaire en tenant l’organe à la base et en les éloignant.
      REMARQUE : La séparation des tissus peut également être réalisée en tenant la région apex au lieu de la région de base. Cela peut être utile lors de la dissection d’organes de rats ou de souriceaux plus âgés (>P5).
   4. Retirez délicatement la membrane de Reissner en tenant l’organe à la base et en le retirant morceau par morceau.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative car la membrane de Reissner n’interfère pas avec l’acquisition de l’imagerie.
9. Suivez les étapes suivantes pour les explants cochléaires :
   1. Détachez le ganglion spiralé de la lame spirale osseuse à l’aide d’une seringue à insuline (souris) ou d’une pince (rats).
   2. Déroulez doucement le modiolus pendant le détachement.
      REMARQUE : Les explants peuvent être divisés en deux morceaux pour une meilleure manipulation.
   3. Saisissez la région du crochet avec une pince.
   4. Retirez délicatement le ligament spiral avec la strie vasculaire en le tirant.
   5. Retirez délicatement la membrane de Reissner en tenant l’organe à la base et en le retirant morceau par morceau.
      REMARQUE : Cette étape est recommandée, car la membrane de Reissner se plie et recouvre généralement les filaments neuronaux et, par conséquent, peut affecter les expériences.

4. Culture d’explants cochléaires

1. Transférez les explants de la boîte de Pétri dans les chambres à plusieurs puits. Soulevez les explants avec les cellules ciliées vers le haut à l’aide d’une spatule de laboratoire. Incluez quelques microlitres de 1x PBS pour éviter que les échantillons ne collent à la spatule.
   REMARQUE : Les explants gravement endommagés colleront à la spatule.
2. Laissez les explants glisser de la spatule dans la chambre en agitant doucement la spatule dans le milieu. Placez un explant par puits d’une lame de chambre à 8 puits.
   REMARQUE : Si l’explant colle à la spatule, tenez la spatule dans le milieu et utilisez la pince pour détacher les explants. Placez toujours la pince sur le bord intérieur de l’explant (loin des cellules ciliées).
3. Vérifier au microscope que les explants ont été transférés dans la bonne orientation et placés au centre des puits.
   REMARQUE : Les explants mal orientés avec les cellules ciliées tournées vers le bas ont tendance à montrer une forme de U vers le haut sur leur largeur. Corrigez leur orientation en déplaçant les explants vers les coins des chambres (plus de milieu est disponible) et dirigez-les vers la rotation.
4. Retirez 80 μL du milieu à l’aide d’une pipette de 100 μL et jetez-le.
5. Vérifiez au microscope si les cellules ciliées et les cellules neuronales ganglionnaires spirales sont visibles. Si nécessaire, utilisez une pince pour écarter doucement certains tissus qui se chevauchent.
6. Retirez le reste du milieu et attendez ~10 s.
7. Pipeter le dos moyen. Ajouter une ou deux gouttes de milieu à côté de l’explant et le reste du milieu à une certaine distance de l’explant pour éviter que l’explant ne se détache.
   REMARQUE : Même si les explants sont fixés aux chambres, le milieu doit toujours être ajouté en premier en pipetant une à deux gouttes à côté des explants. De cette façon, les explants ne seront pas soulevés lorsque le milieu complet restant sera ajouté.
8. Remettez la chambre dans l’incubateur et incubez pendant 2 h pour permettre aux organes de se fixer fermement au fond de la chambre.
9. Retirez le milieu et ajoutez délicatement 300 μL de milieu complet frais préchauffé à l’aide d’une pipette de 100 μL ou de 200 μL. N’utilisez pas de pipette de 1 ml.
   REMARQUE : Si un prétraitement est souhaité, après 2 h de fixation, ajouter 300 μL de milieu complet contenant la substance d’intérêt. Si une chambre à 4 puits est utilisée, utilisez jusqu’à 500 μL/puits.
10. Remettez les chambres dans l’incubateur.

5. Test des agents ototoxiques

1. Laissez les explants toute la nuit pour qu’ils s’adaptent aux conditions de culture et qu’ils se rétablissent.
2. Préparez différentes concentrations d’agents ototoxiques pour trouver la concentration appropriée afin d’établir un modèle ototoxique avec une perte de cellules ciliées d’environ 50 %. Utiliser entre 50 μM et 250 μM pour la gentamicine et entre 40 μM et 320 μM pour le cisplatine. Préparez les solutions de cisplatine fraîches et protégez-les de la lumière.
3. Retirez le milieu et ajoutez délicatement 300 μL de milieu contenant le médicament ototoxique souhaité.
4. Incuber les explants avec de la gentamicine et du cisplatine à 37 °C pendant 24 h à 48 h pour déterminer la survie des cellules ciliées.
   REMARQUE : Les concentrations de médicament et la durée d’exposition sont choisies en fonction de l’objectif de l’étude. La conservation des explants a été testée ici jusqu’à 72 h. N’utilisez pas de sérum si vous prévoyez d’effectuer une culture à long terme.
5. Suivez la section suivante pour colorer les cellules cochléaires.

6. Fixation et immunofluorescence

1. Jetez le milieu à la fin de l’expérience et lavez immédiatement les explants avec 200 μL de PBS 1x préchauffé.
2. Fixez les explants avec 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min sous une hotte chimique.
   ATTENTION : Le PFA est un produit chimique dangereux ; lire la fiche signalétique (FDS) avant de travailler avec PFA pour la première fois.
3. Lavez les explants deux fois avec 200 μL de 1x PBS. Conservez les explants dans 1x PBS à 4 °C au cas où les procédures de coloration devraient être reportées.
4. Préparez la solution de perméabilisation composée de 1x PBS et de 1%-5% de Triton-X100.
5. Jeter le 1x PBS, ajouter 200 μL de solution de perméabilisation et incuber les explants pendant 15 min.
6. Préparez la solution de blocage.
   1. Pour les explants d’organes de Corti, préparer une solution bloquante composée de 1x PBS, de 10% de sérum de chèvre normal (NGS, pour les anticorps secondaires de chèvre, ou d’un autre sérum de la même espèce que les anticorps secondaires). Vous pouvez également utiliser de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % à 5 % si les cellules sont colorées uniquement avec de la phalloïdine.
   2. Pour les explants cochléaires, préparer une solution bloquante composée de 1 x PBS, de 10 % de NGS et d’un fragment Fab (fragment Fab d’IgG H+L de chèvre anti-souris, dilution de 1 :200) si vous utilisez des anticorps primaires de souris (par exemple, anti-TuJ1 de souris) pour colorer les cellules ganglionnaires spirales.
7. Ajouter 200 μL de solution de blocage et incuber les explants pendant 1 h.
8. Jetez la solution bloquante. Aux explants incubés avec Fab fragment, ajouter 200 μL de PFA à 4 % et incuber pendant 5 min.
9. Lavez les explants avec 1x PBS pendant 5 min.
10. Préparez une solution d’anticorps composée de 1 PBS, de 5 % de NGS et de 0,1 % à 0,25 % de Triton-X100.
11. Diluer l’anticorps primaire dans une solution d’anticorps - MYO7A (ab3481 à une dilution de 1 :500 ou MYO7A 138-1 à 1 :100) - pour marquer les cellules ciliées et TuJ1 (1 :400) pour marquer les neurones ganglionnaires spiralés.
    REMARQUE : Si les cellules ciliées ne sont marquées qu’avec de la phalloïdine, diluez la phalloïdine à 1 :150 dans 1x PBS, incubez pendant 40 min à 1 h à température ambiante et passez à l’étape 6.22.
12. Inclure un contrôle pour la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire en omettant l’anticorps primaire.
13. Ajouter 170 μL de la solution d’anticorps avec l’anticorps primaire dans le puits correspondant et incuber pendant une nuit à 4 °C en agitant doucement (40-60 tr/min).
14. Lavez les explants 4 fois pendant 5 min chacun avec 1 PBS.
15. Diluer l’anticorps secondaire dans une solution d’anticorps (par exemple, Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre ou Alexa Fluor 568 IgG anti-souris de chèvre à une dilution de 1 :500).
16. Ajouter 170 μL de la solution d’anticorps avec l’anticorps secondaire, et incuber pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : À partir de cette étape, protégez les explants d’une exposition prolongée à la lumière.
17. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS.
18. Passez à l’étape suivante pour le double étiquetage séquentiel des explants. Incuber avec un deuxième anticorps primaire d’intérêt (p. ex., MYO7A pour les cellules ciliées) pendant la nuit à 4 °C en agitant doucement (40-60 tr/min). Vous pouvez également incuber avec de la phalloïdine (1 :150) pendant 40 min à 1 h à température ambiante et passer à l’étape 6.22.
    REMARQUE : Effectuer un marquage séquentiel si les anticorps primaires proviennent de la même espèce hôte. Effectuez un marquage de la phalloïdine à la fin pour l’immunofluorescence multiplex.
19. Lavez les explants 4 fois pendant 5 min chacun avec 1 PBS.
20. Diluer l’anticorps secondaire dans une solution d’anticorps (par exemple, Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre ou Alexa Fluor 568 IgG anti-souris de chèvre à une dilution de 1 :500).
21. Ajouter 170 μL de l’anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à température ambiante.
22. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS.
23. Préparer une solution mère DAPI de 1 mg/mL et conserver à −20 °C. Diluer la solution mère DAPI 1 :10 pour préparer des solutions de travail de 0,1 mg/mL et conserver à 4 °C.
    REMARQUE : Ignorez l’étape 23 et passez à l’étape 26 si le support de montage contenant DAPI est utilisé.
24. Diluer la solution de travail DAPI 1 :100 dans 1x PBS et incuber les explants avec 200 μL de solution DAPI pendant 5 min.
25. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS.
26. Retirez le 1x PBS autant que possible pour permettre au fond de la chambre de sécher. Ne laissez pas sécher l’explant.
27. Attendez 2 à 5 s et ajoutez une goutte de produit de montage directement sur l’explant.
    REMARQUE : Le milieu de montage sur l’explant restera en place en raison de la tension superficielle. Un support de montage durcissant peut être utilisé.
28. Conservez les chambres à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

7. Immunofluorescence de cellules vivantes provenant d’explants

1. Utilisez les explants isolés après une nuit d’incubation.
2. Retirer le milieu et ajouter délicatement 300 μL de milieu contenant 125 μM de cisplatine.
3. Incuber les explants pendant 18 h pour mesurer le superoxyde mitochondrial dans les explants vivants.
4. Jetez le milieu à la fin de l’exposition au médicament.
5. Ajouter 300 μL d’une sonde perméable pour détecter les ROS cellulaires (p. ex., 250 nM de mito-hydroéthidine) et/ou la caspase-3 (p. ex., 2 μM de peptide DEVD conjugué à un colorant de liaison aux acides nucléiques).
6. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
7. Lavez délicatement les explants deux fois avec 200 μL de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) tiède ou un tampon approprié.
8. Imagez les cellules en moins de 2 h avec une excitation de fluorescence à 400 nm et une détection d’émission à 590 nm.
9. Jetez le milieu à la fin de l’expérience et lavez immédiatement les explants avec 200 μL de PBS 1x préchauffé.
10. Fixez les explants et colorez les cellules cochléaires comme décrit ci-dessus.

8. Visualisation par imagerie confocale

1. Imagez les explants à l’aide d’un microscope équipé d’une unité confocale à disque rotatif ou d’un microscope confocal équipé d’une unité confocale à balayage ponctuel.
2. Acquérez les images à l’aide d’un disque rotatif avec un objectif d’air 20x (ouverture numérique : 0,75) pour le comptage des cellules. Vous pouvez également acquérir les images à l’aide d’un microscope confocal à balayage ponctuel avec un objectif à air 40x (ouverture numérique : 0,95) ou un objectif à huile 100x (ouverture numérique : 1,45) pour visualiser et compter les synapses ou imager les stéréocils.
   REMARQUE : Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition pour chaque canal afin d’éviter la sursaturation et la sous-saturation des images. Appliquez les mêmes paramètres à tous les explants d’une même expérience.
3. Configurez le microscope pour capturer une image 3D de l’ensemble de l’explant cochléaire à l’aide d’un objectif pneumatique 20x, d’une pile z et d’outils d’assemblage automatique. Utilisez 3 x 3 champs adjacents avec un chevauchement de 15 % pour les explants de souris et 4 x 4 champs adjacents pour les explants de rats à coudre ensemble.
4. Ajustez les images à l’aide du logiciel du microscope ou du logiciel gratuit et open-source FIJI⁸.
   REMARQUE : La déconvolution, une technique de traitement d’image, peut être appliquée aux images confocaux pour améliorer leur contraste et leur résolution ^9-11.

Résultats

Le présent protocole a été testé sur la cochlée de souris et de rats nouveau-nés. Cet article présente des images d’explants issus de différentes expériences. Les explants de l’organe de Corti ont été exposés à la gentamicine ou au cisplatine, et la perte de cellules ciliées était visible. Les explants de l’organe de Corti ont conservé leur structure et leur longueur totale dans des conditions normales et de stress (Figure 1 et Figure 2). Les cellules ciliées survivantes sur toute la longueur des explants de rats précédemment exposés au cisplatine étaient détectables individuellement (Figure 1). En plus de la détection de cellules ciliées survivantes, des cellules ciliées subissant une apoptose ont également été détectées (Figure 2). Cette approche facilite la visualisation et le comptage des cellules survivantes, ce qui peut être effectué à l’aide d’une approche d’apprentissage profond, comme décrit précédemment¹². Il a également été possible de détecter les processus biologiques dans les cellules cochléaires vivantes à l’aide de sondes perméables aux cellules appropriées (Figure 3).

Dans le cas d’explants cochléaires contenant des neurones ganglionnaires spiralés, les explants peuvent être coupés en deux morceaux, ou la région apex peut être coupée pour fournir de meilleures conditions de culture. Ici, nous avons choisi de séparer la région apex, car elle est moins affectée dans des conditions de stress. La figure 4 montre les régions de base et médiale des explants cochléaires. Des cellules ciliées marquées avec le marqueur de cellules ciliées MYO7A ont été détectées. De même, des corps de cellules ganglionnaires spirales et des neurites sains et endommagés marqués avec le marqueur neuronal TuJ1 ont été identifiés. L’analyse des régions ganglionnaires spirales peut être effectuée manuellement ou à l’aide de logiciels open source tels que FIJI avec le plugin NeuronJ pour le traçage des neurites¹³ ou des extensions telles que TrackMate et Cellpose pour la segmentation morphologique^14,15. L’examen plus approfondi des explants de souris a révélé la haute résolution des cellules cochléaires et des stéréocils des cellules ciliées (Figure 5).

Figure 1 : Explants de l’organe de Corti de rats exposés à la gentamicine. Images représentatives (projection d’intensité maximale) d’explants témoins (A) et (B) exposés à la gentamicine (200 μM pendant 24 h). Les cellules ciliées sont marquées avec de la phalloïdine et peuvent être visualisées sur toute la longueur de la cochlée. Pour une meilleure illustration, l’image est dans des tons gris. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif 20x (ouverture numérique : 0,75). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Explants de l’organe de Corti de souris exposées au cisplatine. Images représentatives (projection d’intensité maximale) d’explants témoins (A) et (B) exposés au cisplatine (160 μM pendant 48 h). Les cellules ciliées sont marquées avec de la phalloïdine (rouge) et les cellules ciliées apoptotiques sont marquées avec de la fluorescine. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage ponctuel et d’un objectif 20x (ouverture numérique : 0,75). Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Explants de l’organe de Corti à partir d’expériences d’imagerie en direct. Images représentatives (projection d’intensité maximale) d’explants de souris de type sauvage montrant (A) des explants témoins et (B) des explants exposés à 125 μM de cisplatine pendant 18 h. Les cellules ciliées sont marquées avec de la mito-hydroéthidine et de la caspase-3. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif et d’un objectif 20x (ouverture numérique : 0,75). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Explants cochléaires de souris knock-out STAT1 exposées au cisplatine. Images représentatives (projection d’intensité maximale) d’explants témoins (A) et d’explants (D) exposés à 40 μM de cisplatine pendant 48 h. Les corps des cellules ciliées sont marqués avec l’anticorps MYO7A (vert) et les cellules ganglionnaires spirales avec l’anticorps TuJ1 (rouge) et le marquage nucléaire DAPI (bleu). Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage ponctuel et d’un objectif 20x (ouverture numérique : 0,75) avec un zoom supplémentaire de 2,15 (B,C,E,F). Barre d’échelle = (B,C,E,F) 50 μm et (A,D) 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Organe de souris d’explants de Corti. (A-D) Images représentatives (projection d’intensité maximale) d’explants pleine longueur de souris de type sauvage. (A,B) Les explants ont été marqués avec l’anticorps MYO7A, la phalloïdine et le marquage nucléaire DAPI. (B) Dans la vue d’ensemble agrandie, les corps cellulaires des cellules ciliées marquées avec l’anticorps MYO7A (vert) sont clairement visibles. (C,D) La phalloïdine marque les stéréocils et la plaque cuticulaire des cellules ciliées. Les explants ont été marqués avec de la phalloïdine. (D) Dans la vue d’ensemble agrandie, les images déconvolutées des stéréocils internes individuels des cellules ciliées sont bien identifiées (rangée inférieure), tandis que les stéréocils externes individuels des cellules ciliées sont plus difficiles à délimiter (rangée supérieure). Les images des panneaux A et C ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif 20x (ouverture numérique : 0,75). L’image du panneau B a été acquise avec le même microscope mais avec un objectif air 40x (ouverture numérique : 0,95). L’image du panneau D a été acquise à l’aide d’un microscope confocal à balayage ponctuel et d’un objectif à huile 100x (ouverture numérique : 1,45) avec un zoom supplémentaire de 3,46. La moyenne des balayages a été calculée quatre fois par section XY, et la taille des pixels était de 0,02 μm. Barres d’échelle = (D) 3 μm, (B) 100 μm et (A,C) 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’objectif de la mise à jour de ce protocole était de fluidifier les étapes allant de l’isolement des explants à l’imagerie des cellules cochléaires vivantes et fixes. Nous avons amélioré certaines étapes de l’isolement et introduit des outils innovants dans le but d’établir un protocole efficace et fluide pour obtenir des explants de haute qualité. La méthode décrite est un protocole optimisé des rapports précédents ^4,5. De plus, certaines études actuelles ne disposent pas d’un protocole mis à jour par étapes. Avec des étapes simplifiées de culture d’explants, ce protocole permet de manipuler facilement des explants bien conservés, ce qui est essentiel pour des données reproductibles. L’introduction de chambres multipuits avec une lamelle en polymère pour les explants de l’oreille interne améliore la fixation des organes et la préservation des explants intacts. Nous présentons ici plusieurs exemples d’expériences dans des conditions de stress pour démontrer que les organes en culture maintiennent leur organisation cellulaire malgré la perte de cellules ciliées et les dommages aux neurites.

L’un des défis de la culture des organes de l’oreille interne est d’éviter le décollement et la flottaison des organes, car cela affecte l’intégrité des explants, la réponse au traitement et les examens ultérieurs. Auparavant, les explants étaient cultivés sur des lamelles de verre ^4,5. Bien que la culture sur des surfaces en verre semble être une bonne alternative, le revêtement du verre prend du temps et les lamelles elles-mêmes sont fragiles et délicates. Un protocole alternatif utilisant des inserts de culture cellulaire Millicell tente de résoudre ce problème⁶. Cependant, la coupe et le transfert de la membrane avec les explants semblent être une étape délicate de ce protocole. De plus, les explants peuvent être endommagés lors du montage et de l’étanchéité de la lamelle. Dans l’approche que nous proposons, une fois que les explants sont transférés dans les chambres revêtues de poly-D-lysine et placés dans la bonne position, aucun autre transfert ou recouvrement avec des lamelles n’est nécessaire. Un autre avantage de ce protocole est l’utilisation de chambres avec une fine lamelle en polymère perméable aux gaz qui offre des conditions de culture optimales pour les explants d’organes. Ce polymère a une qualité optique similaire à celle du verre, ce qui le rend adapté à l’imagerie cellulaire en microscopie à haute résolution.

L’ajout de sérum au milieu est utilisé dans la plupart des protocoles de culture cellulaire et tissulaire, y compris la culture d’explants d’oreille interne avec 1 % à 10 % de FBS 4,5,6,16. La présence de sérum influe sur les conditions de culture des expériences ; Ainsi, dans certaines situations, la culture sans sérum est préférable. L’absence de sérum dans la culture d’explants cochléaires a été remplacée soit par l’ajout de N2 au DMEM, soit par l’ajout de N2 au milieu Neurobasal-A ^5,6. À cet égard, nous avons testé les conditions de culture des explants avec et sans sérum. Dans les deux cas, les cellules de l’oreille interne étaient vitales et répondaient aux conditions ototoxiques. Nous avons testé ces conditions pendant 72 h, mais les explants peuvent être maintenus en culture encore plus longtemps, en particulier lorsqu’ils sont incubés avec un milieu sans sérum avec N2, B27 et des facteurs de croissance, comme suggéré dans d’autres études ^5,16.

En plus des étapes critiques générales dans l’isolement des explants de l’oreille interne, telles que la durée de l’isolement de l’organe et l’antibiotique utilisé, il existe également certaines étapes critiques dans ce protocole, qui sont cependant gérables. L’une des étapes critiques de cette méthode est liée au volume de milieu qui reste dans la chambre après l’insertion de l’organe. Celui-ci a été optimisé pour maintenir les explants en vie et attachés à la surface inférieure. Une autre étape critique est liée au temps d’incubation nécessaire pour permettre aux explants de se fixer au fond de la chambre. Des temps d’incubation supérieurs à 2 h avec quelques microlitres de milieu pourraient affecter la santé des explants. Des temps d’incubation plus courts, tels que 1 h, peuvent également être utilisés, à condition de veiller à ne pas détacher les explants. Un autre aspect important est les résidus de poly-D-lysine. Les étapes de lavage de la poly-D-lysine doivent être strictement suivies, car les résidus du sel de bromure de la poly-D-lysine peuvent être toxiques pour les cellules. Une fois que les étapes de lavage ont été suivies avec précision, le revêtement avec de la poly-D-lysine facilite l’adhérence en douceur des explants aux chambres afin que la position puisse être corrigée avant qu’ils ne soient fermement fixés au fond de la chambre.

L’une des limites de cette méthode est l’imagerie des cellules à l’aide de la microscopie verticale. Cela pourrait être un problème important pour les laboratoires équipés de microscopes inversés. Les lames de verre avec chambres en silicone amovibles peuvent être utilisées pour la microscopie verticale et inversée ; cependant, nos conditions de revêtement avec de la poly-D-lysine doivent d’abord être testées. Une autre limitation est le stockage des chambres, car les inserts ne sont pas amovibles et la hauteur totale d’une chambre avec le couvercle est de près de 11 mm par rapport à la hauteur de 1 mm d’une lame de microscope standard. Cependant, la chambre à 8 puits utilise moins d’espace que les plaques à 4 puits suggérées avant¹⁶.

Nous présentons ici des images acquises avec deux microscopes. Alors que le microscope confocal à balayage ponctuel fournit des images haute résolution des tissus en raison de sa section optique mince, le microscope confocal à disque rotatif offre un temps d’imagerie plus rapide avec une bonne résolution. Les stéréocils des cellules ciliées internes (IHC) et des cellules ciliées externes (OHC) sont visualisés à l’aide de la microscopie confocale. Étant donné que les stéréocils des IHC sont plus grands que ceux des OHC, ils ont été bien visualisés à plusieurs reprises dans ce travail. Pour les stéréocils OHC, d’autres microscopes alternatifs peuvent améliorer la visualisation, tels que la microscopie à super-résolution (SRM). Les images d’explants acquises avec le microscope à disque rotatif sont suffisantes pour l’intégration facile du comptage automatisé des cellules ciliées à l’aide d’une approche d’apprentissage profond¹². De plus, le temps d’acquisition court est important pour les expériences avec des cellules et des tissus vivants. De plus, ce protocole ne se limite pas aux explants cochléaires néonatals. Avec quelques optimisations, d’autres explants tels que les organes vestibulaires ou les tissus embryonnaires peuvent également être cultivés.

La quantification in vitro des cellules cochléaires, telles que les cellules ciliées et les neurones, est importante pour évaluer la viabilité cellulaire et, par conséquent, le pourcentage de cellules endommagées ou perdues. L’étude des voies de signalisation et des fonctions cellulaires permet de révéler les mécanismes de la mort et de la survie. L’examen des tissus cochléaires embryonnaires et néonatals est utile pour étudier les stades de développement de la cochlée. Par conséquent, ce protocole permettra d’optimiser les études in vitro d’explants de l’oreille interne, par exemple, pour établir des modèles ototoxiques, étudier les stades de développement, évaluer les voies de signalisation et effectuer des études de dépistage de médicaments.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube conique en polypropylène haute clarté 15 mL 17 x 120 mm style	FALCON	352096
45° ; Pince coudée  ;	Fine Science Tools	11251-35
50 mL Tube conique en polypropylène 30 x 115 mm style	FALCON	352070
Antifade Montage Moyen	VECTASHIELD	H-1000
Alexa Fluor 568 Phalloïdine	Thermofisher	2151755
Anti-bêta III Anticorps anti-tubuline III [TUJ-1]	Abcam	ab14545
Antifade Montage Medium Avec DAPI	VECTASHIELD	H-1200
Anti-myosine VII lapin polyclonal	Abcam	ab3481
B-27 Supplément (50x), moins antioxydants	Thermofisher	10889038
ACIER CARBONE lames chirurgicales 23	Swann Moiton	210
CellEvent&trade ; Caspase-3/7 Green Réactif de détection	Thermofisher	C10723
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX	Thermofisher	31331028
Spatules doubles, une extrémité incurvée	VWR	RSGA038.150
Alcool éthylique 70 % V/V 1 000 mL	bichsel	160 0 106 00
Sérum de veau fœtal, certifié	Thermofisher	16000036
Solution fixatrice à 4 % de paraformaldéhyde préparée dans une	Thermofisher	201255309/201255305
	Intralux® ;   ;	5100
Huygens Version professionnelle 21.10			volumique scientifique
ibidi µ ;-Slide 8 puits	ibidi	80826
microscope	LEICA	M80
	microscope LEICA	MS5
MitoSOX&trade ; Indicateur de superoxyde mitochondrial rouge, pour l’imagerie de cellules vivantes	Thermofisher	M36008
N2 supplément (100x)	Thermofisher	17502048
microscope Nikon Eclipse Ti avec une unité confocale à disque rotatif Yokogawa CSU-W1 et une caméra Photometrics Prime 95B.	NIKON
Microscope Nikon Eclipse Ti avec une unité confocale à balayage de point A1	NIKON
Ciseaux opératoires	Outils pour les sciences fines	14005-16
Ciseaux opératoires	Outils pour les sciences fines	14088-10
Pince à épiler	Outils pour les sciences fines	11008-15
PBS pH 7,2 (1x), 500 ml	Thermofisher	20012-019
Pénicilline	Sigma-Aldrich	P3032
POLY-D-LYSINE HYDROBROMURE MOL WT GT 30	Sigma-Aldrich	P7405
Manche de scalpel #4	Outils de science fine	10004-13
Steri 250 Second stérilisateur	Simon Keller AG&	nbsp ; 031100
Stérilisateur, pastilles de dessiccateur	Simon Keller AG	31120
Boîte de culture tissulaire 60 x 15 mm	FALCON	353802
Boîte de culture tissulaire 60 x 15 mm	FALCON	353004
Trito  ; X-100	Sigma	T9284
Études de développement de la myosine-VIIa non conventionnelle	Banque d’hybridomes	138-1s
WFI pour la culture cellulaire[-]Antimicrobien, 500 mL	Thermofisher	A12873-01