Article de méthode

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

DOI :

10.3791/65181

⸱

21 avril 2023

 ,  , 
1Chinese Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le colliculus supérieur (SC), une structure du mésencéphale conservée au cours de l’évolution chez tous les vertébrés, est le centre visuel le plus sophistiqué avant l’émergence du cortex cérébral. Il reçoit des entrées directes de ~30 types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC), chacune codant pour une caractéristique visuelle spécifique. Il reste difficile de savoir si le CS hérite simplement des caractéristiques rétiniennes ou si un traitement supplémentaire et potentiellement de novo se produit dans le CS. Pour révéler le codage neuronal de l’information visuelle dans le SC, nous fournissons ici un protocole détaillé pour enregistrer optiquement les réponses visuelles avec deux méthodes complémentaires chez les souris éveillées. Une méthode utilise la microscopie à deux photons pour imager l’activité du calcium à une seule résolution cellulaire sans ablation du cortex superposé, tandis que l’autre utilise la microscopie à grand champ pour imager l’ensemble du SC d’une souris mutante dont le cortex est en grande partie sous-développé. Ce protocole détaille ces deux méthodes, y compris la préparation des animaux, l’injection virale, l’implantation de la plaque de tête, l’implantation du bouchon, l’acquisition de données et l’analyse des données. Les résultats représentatifs montrent que l’imagerie calcique à deux photons révèle des réponses neuronales évoquées visuellement à une résolution unicellulaire, et que l’imagerie calcique à grand champ révèle une activité neuronale dans l’ensemble du SC. En combinant ces deux méthodes, on peut révéler le codage neuronal dans le CS à différentes échelles, et une telle combinaison peut également être appliquée à d’autres régions du cerveau.

Introduction

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Le colliculus supérieur (SC) est un centre visuel important chez tous les vertébrés. Chez les mammifères, il reçoit des entrées directes de la rétine et du cortex visuel1. Alors que l’enregistrement optique a été largement appliqué au cortex 2,3,4,5, son application dans le SC est entravée par de mauvais accès optiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives sur le bien-être animal et approuvées par l’IACUC de l’Institut chinois de recherche sur le cerveau de Beijing.

REMARQUE : L’échéancier de ce protocole est le suivant : 1) faire la ventouse ; 2) injecter le virus ; 3) implanter la plaque de tête ; 4) après 3 semaines, implantez le bouchon ; 5) Après une récupération et une accoutumance de ~3 jours sur le tapis roulant, effectuez une imagerie à deux photons/grand champ.

1. Préparation d’une ventouse (Figure 1A)

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    Résultats

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    Les figures 1A et B montrent comment fabriquer respectivement la ventouse et les bouchons. La figure 2 montre comment implanter le bouchon avec succès. Après l’implantation du bouchon, le CS postérieur-médial est exposé, comme le montre la figure 2D. La figure 3 montre les réponses calciques des neurones SC d’un exemple de souris de type sauvage imagé à l’aide de la microscopie à deux p.......

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Étapes critiques du protocole
    L’étape la plus critique est la craniotomie aux étapes 5.2 et 5.3. Tout d’abord, l’os à 0,5 mm en arrière de la lambda est épais et contient des vaisseaux sanguins, ce qui peut provoquer des saignements pendant le processus de forage. Une mousse de gel adéquate doit être préparée pour arrêter le saignement. Deuxièmement, il y a un bon risque d’angiorrhexie lors de l’ablation de l’os juste au-dessus du sinus transverse. Pour le dépannage, une autre approche consiste à amin.......

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    Déclarations de divulgation

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ces travaux sont soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32271060). Y.-t.L. a conçu la recherche, réalisé l’expérience, analysé les données et rédigé le manuscrit. Z.L. et R.W. ont réalisé l’expérience.

    ....

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    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Objectif 16xObjectif Nikon
    50 mmComputarM5018-MP2
    Lamelle de protection 5 mmWarner instrumentsCS-5R
    Filtre passe-bandeChroma TechnologyHQ575/250 m-2p
    cyanoacrylate de butyleVetbond, World Precision Instruments
    Caméra pour la surveillance de la pupilleFLIRBFS-U3-04S2M-CS
    caméra pour l’imagerie grand champBasleracA2000-165µ ; m
    traitement coronaElectro-Technic ProductsBD-20AC
    dichroïqueChroma TechnologyT600/200dcrb  ;
    galvanomètresCambridge Technology
    stérilisateur à billes de verreRWDRS1502
    microdrillRWD78001
    micromanipulateurSutter InstrumentsQUAD
    photomultiplicateurtube HamamatsuR3896
    codeur rotoryUSdigitalMA3-A10-125-N
    résine adhésif dentaire autopolymérisant  ;SuperBond C& B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japon
    coussin chauffant thermostatiqueRWD69020
    Ti :Sapphire laserSpectra-PhysicsMai Tai HP DeepSee
    adhésif silicone translucide  ;Kwik-Sil, World Precision Instruments
    tapis roulantXinglin Biology
    Virus Strains
    rAAV2/9-hsyn-Gcamp6mVector Core à l’Institut chinois de recherche sur le
    Animals
    C57BL/6J typesauvageCentre de ressources sur les animaux de laboratoire de l’Institut chinois de recherche sur le cerveau, Pékin
    Emx1-CreLe Laboratoire Jackson.5628
    Pals1flox/wtChristopher A. Walsh Lab
    Software
    ImageJNIH Image
    LabviewNational Instruments
    MATLABMathworks
    ciment cerveau, Pékin

    Références

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
    2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).

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    Réimpressions et autorisations

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    Mots-clés

    Microscopie biphotoniquemicroscopie en champ largecodage neuraltraitement visuelcellules ganglionnaires de la r tineimplantation d une plaque cr nienneinjection viraleimagerie du cerveau de souris

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