Isolement et culture de macrophages synoviaux primaires et de fibroblastes à partir de tissus arthritiques murins

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une hyperplasie de la synoviale, entraînant une destruction articulaire ^1,2. Les macrophages et les fibroblastes résidant dans les tissus sont présents dans la synoviale saine pour maintenir l’homéostasie articulaire. Chez les patients atteints de PR, les fibroblastes synoviaux (SF) prolifèrent et les cellules immunitaires, y compris les monocytes, s’infiltrent dans la synoviale et le liquide articulaire, processus associés à l’inflammation ^1,3,4. Les macrophages synoviaux (SM), qui comprennent les macrophages résidents et les macrophages dérivés de monocytes du sang périphérique, et les SF sont activés de manière aberrante et jouent un rôle important dans la pathogenèse de la PR. Des études récentes ont suggéré que les interactions cellule-cellule entre les SM et les SF contribuent à la fois à l’exacerbation et à la rémission de la PR ^5,6.

Pour comprendre la pathogenèse de la PR, plusieurs modèles d’arthrite inflammatoire chez les rongeurs ont été utilisés, notamment l’arthrite par transfert sérique K/BxN, l’arthrite induite par le collagène et l’arthrite induite par les anticorps anticollagène. Les tests cellulaires sont généralement nécessaires pour clarifier les fonctions moléculaires dans l’arthrite. Par conséquent, des cellules primaires provenant de modèles animaux d’arthrite ont été isolées. La méthode pour isoler les SF du tissu arthritique murin est bien établie, et ces cellules ont contribué à l’élucidation des mécanismes moléculaires dans la pathogenèse^de l’arthrite ^7,8. D’autre part, les macrophages dérivés de la moelle osseuse, les macrophages dérivés de monocytes sanguins et les lignées cellulaires de macrophages ont souvent été utilisés comme ressources en macrophages pour les études sur l’arthrite ^9,10. Étant donné que les macrophages peuvent acquérir des fonctions associées à leur microenvironnement, les sources générales de macrophages peuvent manquer de réponses spécifiques aux tissus arthritiques. De plus, il est difficile d’obtenir suffisamment de cellules synoviales par tri, car la synoviale murine est un très petit tissu, même dans les modèles d’arthrite. Le manque d’utilisation des macrophages synoviaux pour les études in vitro a été une limitation dans les études sur l’arthrite. L’établissement d’un protocole pour isoler et étendre les macrophages synoviaux serait un avantage pour l’élucidation des mécanismes pathologiques dans la PR.

Dans la méthode précédente d’isolement des FS, les SM étaient éliminés⁷. En outre, une méthode pour isoler et développer les macrophages résidents de certains organes a été signalée¹¹. Par conséquent, les protocoles existants ont été modifiés en combinaison. La modification vise à atteindre la culture primaire des SM et des SF avec une grande pureté. L’objectif global de cette méthode est d’isoler et d’étendre les SM et les SF à partir du tissu arthritique murin.

Les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’expérimentation animale de l’Université d’Ehime et ont été réalisées conformément aux directives de l’Université d’Ehime pour l’expérimentation animale (37A1-1 * 16).

1. Préparation des instruments, des réactifs et du milieu de culture

1. Préparer le milieu de culture comme suit: compléter le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution antibiotique-antimycotique (anti-anti-anti).
2. Préparer le milieu de digestion comme suit : compléter le milieu de culture avec 1 mg/mL de collagénase de type IV. Ajustez la concentration de collagénase juste avant utilisation.
3. Diluer le collagène de type I-C à une concentration de 0,15 mg/mL avec une solution de HCl de 1 mM. Cuves de culture d’inondation (diamètre de 40 ou 60 mm) avec la solution de collagène diluée. Après 6-12 h à température ambiante, retirer la solution de collagène de la vaisselle et sécher à température ambiante. La vaisselle enrobée de collagène peut être conservée à température ambiante pendant au moins 1 semaine. Laver la vaisselle pré-enduite avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un moyen avant utilisation.
4. Préparez des instruments chirurgicaux stériles, tels que des ciseaux, des pinces à épiler à extrémités dentelées et des pinces à pointe fine. Faire tremper dans de l’éthanol à 70% avant utilisation.

2. Préparation du tissu de synovite chez la souris ( Figure 1A)

1. Préparez une souris atteinte d’arthrite inflammatoire dans les pattes postérieures.
   REMARQUE: Des souris femelles C57BL / 6 (18-20 g), 7-8 semaines postnatales, atteintes d’arthrite induite par les anticorps de collagène (CAIA) ou d’arthrite par transfert sérique K / BxN (STA) ont été utilisées pour ce protocole⁸. Il peut être difficile d’isoler les SM des tissus non enflés (c.-à-d. sains), car le nombre de cellules est insuffisant.
2. Anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale de 80 mg/kg de kétamine et de 16 mg/kg de xylazine. Nettoyez les souris avec de l’éthanol à 70%.
3. Coupez la région pectorale avec des ciseaux pour exposer le cœur. Couper l’oreillette droite du cœur avec des ciseaux, puis enfoncer une aiguille papillon de 23 G dans le ventricule gauche via l’apex du cœur, suivi d’un reflux de 15 à 20 mL de PBS stérile à l’aide d’une seringue pour retirer manuellement le sang périphérique (environ 1 mL/2 s).
4. Décorticez les pattes postérieures en coupant la peau à l’aide de ciseaux et en tirant la peau à l’aide d’une pince à épiler à extrémités dentelées.
   REMARQUE: Après cette étape, l’utilisation de pincettes est recommandée pour la manipulation des échantillons. Ne touchez pas les tissus décortiqués avec les doigts, pour éviter la fixation des cheveux murins.
5. Disloquer les articulations métatarsophalangiennes en tirant, puis en coupant les ligaments des articulations à l’aide de ciseaux pour enlever les orteils.
6. Coupez les tendons des muscles de la jambe près de la cheville à l’aide de ciseaux. Saisissez le tendon avec une pince à épiler et pelez les muscles à proximité de la jambe inférieure pour exposer le tibia. Retirez le péroné.
7. Disloquez l’articulation du genou en tirant, puis en coupant les ligaments des articulations à l’aide de ciseaux pour détacher le tibia avec la patte postérieure enflée. Conserver les échantillons dans un milieu de culture glacée (0,3 mL/cm²) jusqu’à ce qu’ils passent à l’étape 3.1.

3. Digestion du tissu synovite ( Figure 1B)

1. Aspirer le milieu de culture en évitant l’échantillon, puis ajouter le milieu de culture frais (0,3 mL/cm²). Répétez le processus de lavage trois ou quatre fois.
   REMARQUE: À partir de cette étape, la manipulation des échantillons doit être effectuée de manière aseptique dans un banc propre ou une armoire de sécurité.
2. Disloquer toutes les articulations des échantillons en tirant à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine dans le milieu de culture sous un stéréomicroscope (grossissement de 10x-20x). Les pincettes à pointe fine sont pratiques dans cette étape. Enlevez le tibia et autant de vaisseaux, de tendons et de ligaments que possible. Veillez à ne pas casser les os lors de la délocalisation.
3. Préparer deux tubes de 15 mL par échantillon. Transférer les os disloqués avec les tissus mous dans le premier tube de 15 ml à l’aide d’une pince à épiler. Ajouter 4 mL de milieu de digestion par échantillon, obtenu à partir des deux pattes postérieures, dans le tube.
4. Pour prélever des cellules résiduelles et des fragments de tissus, transférer le milieu dans lequel l’échantillon a été contenu dans le deuxième tube de 15 mL. Centrifuger le milieu à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille avec 1 mL de milieu de digestion et transférer la solution de fragments de cellules et de tissus dans le premier tube de 15 mL contenant presque tout le tissu (total de 5 mL de milieu de digestion/pattes postérieures).
5. Digérer l’échantillon pendant 60-120 min à 37 °C en agitant dans une étuve d’hybridation.
   REMARQUE: Le moment optimal pour digérer les échantillons doit être décidé. Le temps dépend du degré de gonflement des chevilles et des collagénases. Dans la plupart des cas, 60-120 minutes suffisent. Après 60 min d’incubation, prélever une partie de l’échantillon digéré par pipetage, et observer au microscope. Si la digestion est insuffisante, l’incubation doit se poursuivre et la digestion doit être vérifiée toutes les 30 minutes.
6. Bien canaliser la solution. Filtrer la solution cellulaire à travers une crépine cellulaire (taille des pores de 40 μm) jusqu’à un tube de 50 mL.
7. Ajouter 10 mL de milieu de culture dans le tube de 50 mL à travers la passoire cellulaire. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
8. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension avec 10 ml de milieu de culture. Répétez la centrifugation. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension avec 2 ml de milieu de culture.

Figure 1 : Procédure d’échantillonnage des tissus arthritiques murins et digestion de la collagénase. (A) (i) Patte postérieure murine avec arthrite inflammatoire. ii) Enlèvement de la peau de la patte postérieure. iii) Luxation des articulations métatarsophalangiennes et ablation des orteils. iv) Incision des tendons de la cheville. v) Ablation des muscles de la partie inférieure des jambes. vi) Luxation de l’articulation du genou. b) à gauche; jambes excisées dans le milieu de culture. Droite; Tarse disloqué et métatarse dans le milieu de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Isolement des fibroblastes synoviaux ( Figure 2A)

1. Ensemencer toutes les suspensions cellulaires obtenues des deux chevilles sur le plat enrobé de collagène.
   REMARQUE: Si vous utilisez des chevilles avec un gonflement faible ou modéré pour obtenir les cellules, une antenne de 40 mm de diamètre est appliquée. La taille du plat enrobé de collagène peut être changée en une boîte de 60 mm de diamètre si les deux chevilles ont un gonflement sévère.
2. Ajouter le milieu de culture (environ 222 μL/^cm2). Incuber pendant 1 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO_2.
3. Recueillir les cellules non adhérentes à l’aide d’une pipette (utiliser à l’étape 5.1). Lavez le plat enrobé de collagène avec un milieu de culture et recueillez le milieu. Culture des cellules adhérentes en milieu frais (Figure 2B,i). La plupart des cellules qui adhèrent rapidement à la boîte recouverte de collagène présentent une morphologie fibroblastoïde (fuseau).
4. Passage des cellules sous-confluentes par traitement avec 0,05% de trypsine dans la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Dans cette méthode, la contamination des autres cellules est limitée, même lors de l’expansion initiale. Si davantage de cellules purifiées ressemblant à des fibroblastes sont nécessaires, effectuer des passages répétés pour permettre l’amélioration de la pureté; cependant, l’expansion du cytoplasme des cellules en adhérence est également observée (Figure 2B,ii). Étant donné que les passages excessifs affectent la perte de caractéristiques naïves dans les cellules, utilisez des cellules avec moins de 5 passages.

5. Isolement des macrophages synoviaux ( Figure 2A)

1. Ensemencer toutes les cellules non adhérentes de l’étape 4.4 sur des boîtes (diamètre de 40 ou 60 mm) qui n’ont pas été enrobées de collagène.
   REMARQUE: Les cellules non adhérentes comprennent les macrophages, d’autres lymphocytes et les fibroblastes résiduels du tissu de la synovite.
2. Culture des cellules en vrac pendant 1 jour à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂.
3. Pour éliminer les lymphocytes non adhérents, aspirez le milieu cultivé, puis ajoutez un milieu de culture frais. Répétez ce processus deux ou trois fois (Figure 2B,iii).
4. Culture des cellules adhérentes en vrac pendant 1-2 semaines dans un milieu de culture, avec des changements de milieu tous les 2 jours tout en maintenant la confluence (Figure 2B,iv).
   NOTE: Le nombre de SM augmente lentement dans des conditions de co-culture avec les SF. Ainsi, la période de co-culture devrait être ajustée au besoin.
5. Lavez avec PBS ou HBSS deux fois. Traiter avec 0,05% de trypsine dans HBSS (environ 55 μL/cm 2) pendant 3 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂. Les fibroblastes se détachent facilement de la boîte de culture par traitement à la trypsine, et les macrophages présentent une résistance au traitement à la trypsine. Utilisez cette propriété pour la sélection des macrophages synoviaux.
6. Ajouter doucement le milieu de culture (environ 222 μL/^cm2) à 0,05 % de trypsine dans l’HBSS. Après cette étape, ne versez pas le milieu directement sur les cellules.
7. Pour enlever les cellules détachées, aspirez le milieu cultivé, puis ajoutez doucement le milieu de culture frais. Répétez ce processus deux ou trois fois. Maintenir les cellules restantes sur la boîte dans un milieu de culture frais jusqu’à utilisation (Figure 2B,v).
   REMARQUE: Après le traitement par trypsine, les cellules adhérentes présentent des caractéristiques morphologiques de type macrophage.

Figure 2 : Séparation des fractions riches en macrophages et en fibroblastes du tissu arthritique inflammatoire. (A) Schéma de la procédure visant à séparer les cellules riches en macrophages et en fibroblastes des tissus arthritiques. (B) Images représentatives du contraste de phase des étapes de la procédure, (i) à (v) de la figure 2A. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les souris C57BL/6 femelles âgées de 7 à 8 semaines ont souffert d’arthrite induite par les anticorps anticollagène. Les cellules de type macrophage et les cellules de type fibroblaste ont été isolées indépendamment du tissu arthritique inflammatoire selon la procédure décrite ci-dessus (figure 2A,B). Des cellules de type macrophage ont été utilisées immédiatement après l’étape 5.7. Les cellules de type fibroblaste ont d’abord été cultivées pour être sous-confluentes après l’étape 4.4, puis passées à une nouvelle boîte de culture suivie d’une utilisation. Pour évaluer si les SM et les SF ont été isolés avec succès, les expériences suivantes ont été réalisées.

Pour évaluer la pureté des cellules isolées, l’expression de l’ARNm de divers marqueurs cellulaires a été analysée par RT-qPCR. Cd68, Emr1, Itgam et Csf1r ont été utilisés comme marqueurs pan-macrophages, et Cdh11, Col6a1, Csf1 et Vcam1 ont été utilisés comme marqueurs SF. Rplp0 a été utilisé comme gène de référence 6,8. Tous les gènes marqueurs ont été normalisés par l’expression de Rplp0. Les deux marqueurs de type cellulaire ont été analysés dans les cellules de type macrophage, et des cellules de type fibroblaste ont été obtenues à partir de tissus arthritiques. Les marqueurs SF ont été exprimés dans les cellules de type fibroblaste et les marqueurs pan-macrophages ont été exprimés dans les cellules de type macrophage, ce qui suggère que les fractions riches en macrophages et en fibroblastes ont été isolées du tissu de la synovite, respectivement (Figure 3A, B).

Pour établir la pureté des macrophages, les marqueurs protéiques de surface pour les macrophages et d’autres types de cellules ont été analysés par cytométrie de flux. F4/80 et CD11b ont été utilisés pour les marqueurs de macrophages, Ly6G pour un marqueur de neutrophiles et CD3 pour un marqueur de lymphocytes T6. La stratégie d’établissement de points de contrôle a été utilisée comme indiqué précédemment6. Plus de 90% des cellules exprimaient CD45, CD11b et F4/80, tandis que l’expression de Ly6G et CD3 était inférieure à 1% (Figure 4).

Figure 3 : expression de l’ARNm de marqueurs spécifiques au type cellulaire. (A) Expression de l’ARNm des marqueurs pan-macrophages (Cd68, Emr1, Itgam, Csf1r) dans les macrophages synoviaux (SM) et les fibroblastes synoviaux (SF) par RT-qPCR (n = 4). (B) Niveaux d’expression des marqueurs SF (Cdh11, Col6a1, Csf1, Vcam1) dans les SM et les SF (n = 4). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type. ** indique p < 0,01 par un test t non apparié. Les données ont été obtenues à partir de quatre expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Expression des protéines de surface cellulaire spécifiques au type cellulaire. Histogrammes représentatifs obtenus dans les analyses cytométriques en flux des marqueurs de surface leucocytaire (CD45, CD11b, F4/80, Ly6g, CD3) dans les macrophages synoviaux (SM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.