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Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique

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DOI :

10.3791/65206

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2 juin 2023

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1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

Dans cet article

Résumé

Ici, nous démontrons un protocole optimisé basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 pour la caractérisation des gouttelettes lipidiques dans le tissu hépatique. Grâce à l’utilisation de projections orthogonales et de reconstructions 3D, le fluorophore permet une discrimination réussie entre la stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques pour l’évaluation de la stéatose hépatique.

Résumé

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides et jouent un rôle très important dans la suppression de la lipotoxicité et la prévention du dysfonctionnement causé par les acides gras libres (AG). Le foie, compte tenu de son rôle essentiel dans le métabolisme des graisses du corps, est constamment menacé par l’accumulation intracellulaire de LD sous forme de stéatose hépatique microvésiculaire et macrovésiculaire. La caractérisation histologique des LD est généralement basée sur des colorants diazoélectriques liposolubles, tels que la coloration Oil Red O (ORO), mais un certain nombre d’inconvénients entravent systématiquement l’utilisation de cette analyse avec des échantillons de foie. Plus récemment, les fluorophores lipophiles 493/503 sont devenus populaires pour visualiser et localiser les LD en raison de leur absorption et de leur accumulation rapides dans le noyau de gouttelettes lipidiques neutres. Même si la plupart des applications sont bien décrites dans les cultures cellulaires, il y a moins de preuves démontrant l’utilisation fiable des sondes fluorophores lipophiles comme outil d’imagerie LD dans les échantillons de tissus. Nous proposons ici un protocole optimisé basé sur le dipyrrométène de bore (BODIPY) 493/503 pour l’évaluation des LD dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique induite par un régime riche en graisses (HFD). Ce protocole couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, la coloration BODIPY 493/503, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Nous démontrons une augmentation du nombre, de l’intensité, du rapport de surface et du diamètre des LD hépatiques lors de l’alimentation HFD. En utilisant des projections orthogonales et des reconstructions 3D, il a été possible d’observer la teneur complète en lipides neutres dans le noyau LD, qui apparaissait comme des gouttelettes presque sphériques. De plus, avec le fluorophore BODIPY 493/503, nous avons pu distinguer des microvésicules (1 μm < j ≤ 3 μm), des vésicules intermédiaires (3 μm < d ≤ 9 μm) et des macrovésicules (d > 9 μm), permettant la discrimination réussie de la stéatose microvésiculaire et macrovésiculaire. Dans l’ensemble, ce protocole basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 est un outil fiable et simple pour la caractérisation hépatique de la LD et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques.

Introduction

Les gouttelettes lipidiques (LD), classiquement considérées comme des dépôts d’énergie, sont des organites cellulaires spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides, et elles comprennent un noyau lipidique neutre hydrophobe, qui contient principalement des esters de cholestérol et des triglycérides (TG), encapsulés par une monocouche phospholipide 1,2,3.

La biogenèse de la LD se produit dans le réticulum endoplasmique (RE), en commençant par la synthèse du triacylglycérol (TAG) et des esters stéroliques. Les lipides neutres sont diffusés entre les folioles de la bicouche ER à de faibles concentrations, mais fusionnent en lentilles d’huile qui se développent et bourgeonnent en gouttelettes presque sphériques de la membrane ER lorsque leur concentration intracellulaire augmente4. Par la suite, les protéines de la bicouche ER et du cytosol, en particulier la famille des protéines perilipin (PLIN), se transloquent à la surface des LD pour faciliter le bourgeonnement 5,6,7,8,9.

Grâce à la synthèse de nouveaux acides gras et à la fusion ou à la coalescence des LD, les LD atteignent différentes tailles. Par conséquent, la taille et le nombre de TA diffèrent considérablement d’un type de cellules à l’autre. De petites gouttelettes (300-800 nm de diamètre), connues sous le nom de LD initiales (iLD), peuvent être formées par presque toutes les cellules4. Plus tard dans la formation de LD, la plupart des cellules sont capables de convertir certaines iLD en LD plus grandes en expansion (eLDs >1 μm de diamètre). Pourtant, seuls des types cellulaires spécifiques, tels que les adipocytes et les hépatocytes, ont la capacité de former des LD géantes ou surdimensionnées (jusqu’à des dizaines de microns de diamètre)4,10.

Les LD jouent un rôle très important dans la régulation du métabolisme des lipides cellulaires, la suppression de la lipotoxicité et la prévention du stress des urgences, du dysfonctionnement mitochondrial et, finalement, de la mort cellulaire causée par les acides gras libres (AG)11,12,13,14. En outre, les LD ont également été impliqués dans la régulation de l’expression génique, la séquestration des protéines de réplication virale et le trafic et la signalisationmembranaires 15,16,17. Par conséquent, la mauvaise régulation de la biogenèse de la ML est une caractéristique des maladies chroniques associées au syndrome métabolique, à l’obésité, au diabète sucré de type 2 (DT2) et / ou à l’artériosclérose, pour n’en nommer quequelques-unes 18,19,20.

Le foie, en tant que plaque tournante métabolique, est principalement responsable du métabolisme des lipides en stockant et en traitant les lipides et, par conséquent, il est constamment menacé par la lipotoxicité21. La stéatose hépatique (SH) est une caractéristique commune d’une série de maladies hépatiques progressives et se caractérise par une accumulation excessive de lipides intracellulaires sous forme de LD cytosoliques qui, en fin de compte, peuvent entraîner un dysfonctionnement métabolique hépatique, une inflammation et des formes avancées de stéatose hépatique non alcoolique22,23,24,25. L’HS se produit lorsque le taux d’oxydation et d’exportation des acides gras sous forme de triglycérides dans les lipoprotéines de très basse densité (VLDL) est inférieur au taux d’absorption hépatique des acides gras par le plasma et la synthèse de novo des acides gras26. L’accumulation hépatique de lipides se produit souvent sous deux formes - stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse - et celles-ci présentent des caractéristiques cytoarchitectoniques distinctes27. Typiquement, la stéatose microvésiculeuse est caractérisée par la présence de petites LD dispersées dans tout l’hépatocytes avec le noyau placé au centre, tandis que la stéatose macrovésiculeuse est caractérisée par la présence d’une seule grande LD qui occupe la plus grande partie de l’hépatocytes, poussant le noyau vers la périphérie28,29. Notamment, ces deux types de stéatose sont souvent trouvés ensemble, et on ne sait toujours pas comment ces deux modèles de LD influencent la pathogenèse de la maladie, car les preuves sont encore incohérentes 31,32,33,34. Pourtant, ce type d’analyse est souvent utilisé comme « norme de référence » dans les études précliniques et cliniques pour comprendre le comportement dynamique des TA et caractériser la stéatose hépatique 29,34,35,36.

Les biopsies hépatiques, l’étalon-or pour le diagnostic et le classement de l’HS, sont systématiquement évaluées par analyse histologique de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E), où les gouttelettes lipidiques sont évaluées comme des vacuoles non colorées dans les sections hépatiques colorées H & E37. Bien qu’acceptable pour l’évaluation de la stéatose macrovésiculaire, ce type de coloration restreint généralement l’évaluation de la stéatose microvésiculeuse38. Les colorants diazoélectriques liposolubles, tels que l’Oil Red O (ORO), sont classiquement combinés à la microscopie à fond clair pour analyser les réserves lipidiques intracellulaires, mais ceux-ci présentent encore un certain nombre d’inconvénients: (i) l’utilisation d’éthanol ou d’isopropanol dans le processus de coloration, ce qui provoque souvent la perturbation des LD natives et une fusion occasionnelle malgré la fixation des cellules39; ii) la nature longue, car la solution ORO nécessite la dissolution et la filtration de la poudre fraîche en raison de la durée de conservation limitée, ce qui contribue à des résultats moins cohérents; (iii) et le fait que l’ORO colore plus que de simples gouttelettes lipidiques et surestime souvent la stéatose hépatique38.

Par conséquent, des fluorophores lipophiles perméables aux cellules, tels que le rouge du Nil, ont été utilisés dans des échantillons vivants ou fixes pour surmonter certaines des limitations susmentionnées. Cependant, la nature non spécifique du marquage des organites lipidiques cellulaires rétrécit à plusieurs reprises les évaluations de la LD40. De plus, les propriétés spectrales du Rouge du Nil varient en fonction de la polarité de l’environnement, ce qui peut souvent conduire à des décalagesspectraux41.

La sonde fluorescente lipophile 1,3,5,7,8-pentaméthyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (longueur d’onde d’excitation : 480 nm ; émission maximale : 515 nm ; BODIPY 493/503) présente des caractéristiques d’hydrophobicité qui permettent son absorption rapide par les LD intracellulaires, s’accumule dans le noyau des gouttelettes lipidiques et, par la suite, émet une fluorescence vert vif12. Contrairement au Nile Red, BODIPY 493/503 est insensible à la polarité de l’environnement et s’est avéré plus sélectif, car il affiche une luminosité élevée pour l’imagerie LD. Afin de colorer les LD neutres, ce colorant peut être utilisé dans des cellules vivantes ou fixes et couplé avec succès à d’autres méthodes de coloration et/ou d’étiquetage42. Un autre avantage du colorant est qu’il nécessite peu d’effort pour être placé dans une solution et qu’il est stable, éliminant ainsi le besoin de le préparer fraîchement pour chaque expérience42. Même si la sonde BODIPY 493/503 a été utilisée avec succès pour visualiser la localisation et la dynamique des TA dans les cultures cellulaires, certains rapports ont également démontré l’utilisation fiable de ce colorant comme outil d’imagerie des LD dans les tissus, y compris le muscle vastus lateralis humain43, le muscle soléaire du rat 42 et l’intestin de souris44.

Ici, nous proposons un protocole optimisé basé sur BODIPY 493/503 comme approche analytique alternative pour l’évaluation du nombre de DL, de la surface et du diamètre dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique. Cette procédure couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, les conditions de coloration, l’acquisition d’images et l’analyse des données.

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Protocole

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par l’organisme de protection des animaux de l’Institut de recherche clinique et biomédicale de Coimbra (IBRC) (ORBEA, #9/2018) et étaient conformes aux directives nationales et européennes sur les soins aux animaux et aux directives ARRIVE.

1. Conception expérimentale

  1. Couple de rats Wistar mâles âgés de 13 semaines dans des cages ventilées dans des conditions environnementales contrôlées de température (22 °C ± 1 °C), d’humidité (50 % à 60 %) et de lumière (cycle lumière-obscurité de 12 h) et avec accès ad libitum à l’eau du robinet et à la nourriture standard pour rongeurs.
  2. Après une période d’acclimatation de 2 semaines, assignez arbitrairement les rats en deux groupes.
  3. Nourrissez les groupes témoins (CTRL, n = 6) et riches en graisses (HFD, n = 6) avec un régime standard et un régime riche en graisses (45% kcal / gras), respectivement, pendant 24 semaines.
  4. Surveillez le poids corporel (PC) chaque semaine. Consigner la consommation quotidienne d’aliments et de boissons par cage.

2. Préparation de l’échantillon de foie

  1. Curage hépatique
    1. Préparez la pompe péristaltique : Faites passer de l’éthanol à 70 % dans le tube, connectez une aiguille de 27 G à l’extrémité de sortie du tube et amorcez le tube avec une solution saline glacée (4 °C) 1x tamponnée au phosphate (PBS, pH ~ 7,4 ) (p. ex., 200 tr/min sur une pompe péristaltique avec un tube en silicium I.D. de 1,6 mm, un mini jeu de perfusion IV). Ajuster en fonction du poids corporel (p. ex., pour un rat de 100 à 150 g, utiliser un débit d’environ 10 à 12 mL/min).
    2. Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale à l’aide d’un protocole d’anesthésie (concentration finale de kétamine = 75 mg/kg, et concentration finale de médétomidine = 1 mg/kg).
      REMARQUE: Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié à l’aide de la méthode de réponse par pincement des orteils.
    3. Placez le rat sur le plateau de dissection.
    4. Désinfectez soigneusement la fourrure avec de l’éthanol à 70% et séchez-la avec une serviette en papier.
    5. À l’aide de ciseaux, faites une incision en forme de « U » à travers la peau et coupez sous le diaphragme. Ensuite, coupez la cage thoracique rostralement sur les bords pour exposer le cœur.
    6. Pendant que le PBS 1x fonctionne, passez l’aiguille à travers le ventricule gauche dans l’aorte ascendante et serrez. Ensuite, l’oreillette droite est coupée pour permettre le drainage une fois la perfusion commencée.
      REMARQUE: Le foie devrait commencer à blanchir car le sang est remplacé par du PBS.
    7. À l’aide de ciseaux et de pinces Dumont, retirez soigneusement le foie et rincez avec 1x PBS.
    8. Transférer le foie sur une boîte de Petri et peser.
    9. À l’aide d’un scalpel, prélever des échantillons de tissu hépatique de 5 mm d’épaisseur du côté latéral (1 cm du bord) du lobe gauche du foie pour le processus d’enrobage.
      NOTE Les tissus restants peuvent être conservés à −80 °C pour un stockage à long terme.
  2. Intégration du tissu hépatique
    1. Préparez un récipient de glace carbonique et étiquetez correctement les cryomoules avec l’ID et l’orientation de l’échantillon.
    2. Placez quelques gouttes de cryo-matrice d’incorporation sur le centre du cryomoule pour obtenir la température de coupe optimale (OCT).
    3. Assurez-vous que l’échantillon de tissu est correctement orienté pour une section transversale.
      REMARQUE: Assurez-vous que le côté touchant le fond du cryomoule est le côté qui sera sectionné en premier.
    4. Déposez délicatement plus d’OCT sur le cryomoule jusqu’à ce qu’il soit complètement recouvert. Essayez d’éviter la formation de bulles d’air. Si nécessaire, à l’aide d’une pince ordinaire, retirez les bulles à l’intérieur de l’OCT.
    5. Placez rapidement le cryomoule avec l’échantillon recouvert d’OCT dans un récipient de glace carbonique.
      REMARQUE: Les tissus peuvent être conservés à -80 ° C pendant 3 ans.

3. Sectionnement de tissus congelés

  1. Ajustez la température du cryostat (chambre : −21 °C ; échantillon : −18 °C) et insérez une nouvelle lame stérile.
  2. Placez les échantillons dans le cryostat pendant 30 minutes avant de laisser la température s’équilibrer.
  3. Faire une seule couche de TCO sur le disque de l’échantillon pour permettre l’adhésion de l’échantillon. Laissez l’OCT geler et montez l’échantillon de tissu dans l’orientation souhaitée.
    REMARQUE: La surface de coupe doit être parallèle à la lame. Pour maintenir une bonne adhérence, placez l’extracteur de chaleur sur le dessus de l’échantillon. Les étapes précédentes peuvent également être effectuées dans un récipient de glace carbonique avec de la glace sèche.
  4. Placez l’échantillon dans la tête de l’échantillon et coupez la surface du tissu (quelques sections d’échantillon de tissu de 30 μm).
  5. Une fois que la région d’intérêt est accessible pour le sectionnement, coupez des sections de 12 μm d’épaisseur et placez-les sur des lames de microscope étiquetées conservées à température ambiante (RT).
    REMARQUE: Pour recueillir la section, déplacez lentement la lame vers la section de tissu. Chaque lame peut recueillir deux sections de foie.
  6. Laisser sécher les lames pendant 10 min à la RT.
    REMARQUE: Les lames peuvent être conservées à -20 ° C pendant 6 à 12 mois ou à -80 ° C pendant 3 ans maximum.

4. Coloration BODIPY

  1. Décongeler les lames dans un système de coloration de glissière à TA pendant 30 min.
  2. Laver avec 1x PBS (3x pendant 5 min chacun).
  3. Encerclez la section avec une couche hydrophobe à l’aide d’un stylo-barrière.
  4. Préparer 500 μg/mL de solution mère BODIPY 493/503 : Dissoudre 1 mg de BODIPY 493/503 dans 2 mL de solvant (90 % de DMSO; 10 % 1x PBS). Protéger de la lumière. Sonifier dans un bain à ultrasons pendant 1 h (9,5-10 W) à 37 °C.
    REMARQUE: La solution peut être conservée à -20 ° C pendant au moins 30 jours.
  5. Préparer la solution de coloration BODIPY (1 μg/mL) en ajoutant 2 μL de solution mère BODIPY 493/503 et 0,1 μL de solution mère DAPI (5 mg/mL) à 997,9 μL de 1x PBS.
  6. Incuber les lames (75 μL/lame) avec BODIPY 493/503 (1 μg/mL) et DAPI (0,1 μg/mL) à TA pendant 40 min.
    REMARQUE: Gardez les diapositives dans l’obscurité à partir de cette étape.
  7. Lavez les lames avec 1x PBS (3x pendant 5 min chacune).
  8. Montez les lames avec des lamelles de couverture à l’aide d’un support de montage à fluorescence, laissez-les sécher pendant 30 minutes et scellez-les avec du vernis à ongles.
    REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à 4 ° C jusqu’à l’imagerie.

5. Quantification des lipides

  1. Mesurer les taux sériques de cholestérol total et de TG à l’aide d’une méthode et d’un équipement automatiques et validés.
  2. Mesurer les taux de TG hépatiques à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique des triglycérides (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant.

6. Acquisition d’images

  1. Placez la lame sur le support de lame de microscope confocal à balayage laser.
  2. Pour la visualisation et l’acquisition d’images, utilisez un microscope confocal avec une lentille d’objectif 20x (plan-apochromate : 20x/0,8).
  3. Pour éviter la diaphonie entre le BODIPY 493/503 et le DAPI, utilisez le mode de balayage séquentiel (meilleur signal) sur le logiciel confocale.
  4. Excitez le BODIPY 593/503 en utilisant la ligne laser argon 488 nm et le DAPI en utilisant la ligne laser 405 nm. Définissez les plages d’émission à 493-589 nm pour BODIPY 493/503 et à 410-464 nm pour DAPI.
  5. Utilisez les paramètres suivants : sténopé : 1 UA, résolution : 1 024 pixels x 1 024 pixels, profondeur de bits : 12, taille des pixels : 0,415 μm, mode bidirectionnel, vitesse de balayage : 7 (~1,58 μs/pixel pour un objectif 20x), moyenne linéaire : 2x et zoom numérique : 1.
    NOTE: Les paramètres de balayage mentionnés ci-dessus doivent être optimisés pour chaque microscope confocal et objectif utilisé.
  6. Réglez le gain et le gain numérique de manière appropriée afin qu’aucun pixel saturé ne soit détecté sur l’indicateur de portée.
    REMARQUE: Corrigez le signal d’arrière-plan en ajustant le décalage.
  7. Une fois les LD correctement identifiés, acquérir l’image avec les canaux BODIPY et DAPI.
    REMARQUE: Toutes les images doivent être acquises dans les mêmes conditions (exposition et paramètres généraux) pour chaque canal de couleur.
  8. Pour créer des images grand angle (Figure 2), remplacez l’objectif par un objectif a10x (plan-neofluar : 10x/0,3).
  9. Sélectionnez le mode Mosaïque et créez des mosaïques de 5 images pour 5.
    REMARQUE: Dans ce travail, chaque tuile avait un chevauchement de 10% afin de fusionner correctement les tuiles pour l’analyse.
  10. Pour créer des vues 3D et orthogonales (Figure 3A), placez une goutte d’huile d’immersion sur le dessus du verre de couverture et changez l’objectif pour une lentille d’objectif 40x (plan-neofluar : huile 40x/1,30).
  11. Sélectionnez le mode Z-Stack et, en ajustant le plan Z, définissez la première et la dernière position pour l’acquisition avec une tranche optique à une épaisseur optimale (~0,5 μm) pour vous assurer que toutes les gouttelettes sont capturées.
    REMARQUE: Pour accélérer l’acquisition de l’image et éviter le blanchiment, la tranche optique peut être ajustée à une taille sous-optimale, assurant un suréchantillonnage d’au moins 30% pour une bonne reconstruction 3D.
  12. Sélectionnez le module Ortho et créez des vues orthogonales.
  13. Acquérir des images 3D en sélectionnant le module 3D en suivant le mode de rendu de transparence avec le logiciel de microscope confocal.

7. Analyse des images

  1. Traitez et analysez les images monoplan (grossissement 20x) avec CellProfiler (version 4.2.5).
    REMARQUE : Le pipeline utilisé dans ce travail a été adapté d’Adomshick et al.45.
  2. Cliquez sur le module Images dans le coin supérieur gauche de la fenêtre CellProfiler et téléchargez les images sous forme de fichiers .tiff.
  3. Utilisez le module NamesAndTypes pour trier les images colorées BODIPY- (gouttelettes) et DAPI- (noyaux) en fonction des noms de fichiers. Effectuez l’analyse LD uniquement avec des images colorées BODIPY.
  4. Pour démarrer la construction du pipeline, cliquez sur Ajuster les modules et sélectionnez le module ColorToGray pour convertir les images en images en niveaux de gris.
    Remarque : Pour identifier les objets, des images en niveaux de gris sont requises.
  5. Identifiez les gouttelettes à l’aide du module IdentifyPrimaryObjects à l’aide de l’image en niveaux de gris.
    REMARQUE: Les paramètres de ce module doivent être ajustés pour obtenir une bonne identification LD. Dans ce travail, la définition des LD avec une taille comprise entre 6 pixels et 300 pixels et un facteur de correction de seuil de 1,0 a conduit à l’identification la plus précise.
  6. Pour mesurer l’intensité en pixels des gouttelettes lipidiques identifiées, ajoutez un module MeasureObjectIntensité .
  7. Ajouter un module FilterObjects supplémentaire pour s’assurer que seuls les signaux les plus forts sont quantifiés tandis que les signaux moins intenses sont exclus de l’analyse finale des gouttelettes lipidiques (intensité minimale : 0,15 ; intensité maximale : 1 unité arbitraire).
  8. Pour mesurer les LD liées aux données de sortie, ajoutez le module MeasureObjectSizeShape .
  9. Ajoutez un module OverlayOutline à ce stade pour superposer la gouttelette identifiée sur l’image d’origine et, ainsi, assurez-vous que la segmentation semble précise sur l’image non traitée.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative (contrôle qualité).
  10. Ajoutez un module ExportToSpreadsheet à la fin et cliquez sur le bouton Analyser les images dans le coin inférieur gauche.

8. Analyse statistique

  1. Exprimer les résultats sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (S.E.M.) à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse statistique.
    REMARQUE: Dans cette étude, le logiciel GraphPad a été utilisé pour l’analyse statistique.
  2. Analyser la distribution des valeurs à l’aide du test de Kolmogorov-Smirnov pour évaluer les écarts significatifs par rapport à la normalité. Analysez les données paramétriques à l’aide du test t non apparié du étudiant.
    REMARQUE : Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

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Résultats

L’exécution réussie de cette technique devrait entraîner une coloration claire des gouttelettes lipidiques pour la caractérisation simultanée de la morphologie LD (forme et densité du noyau lipidique basée sur la reconstruction 3D) ainsi que de leur distribution spatiale, de leur nombre par surface totale et de leur taille moyenne (évaluée avec le pipeline décrit ci-dessus, Figure 1).

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Discussion

Ce protocole BODIPY 493/503 basé sur la fluorescence pour l’évaluation de la LD visait à développer une nouvelle approche d’imagerie pour l’évaluation de la stéatose hépatique. Compte tenu de la forte corrélation entre l’obésité et la stéatose hépatique, le régime alimentaire riche en graisses de style occidental a été utilisé pour établir un modèle animal de stéatosehépatique 26. Une forte augmentation de la teneur en TG hépatique a été confirmée par un kit de dosage colorimétrique quantitatif de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par des fonds nationaux et européens via la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), le Fonds européen de développement régional (FEDER) et le Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) et POCI-01-0145-FEDER-007440. Les auteurs tiennent à remercier iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, une installation de la Faculté de médecine de l’Université de Coimbra et membre de l’infrastructure nationale PPBI-Plateforme portugaise de bioimagerie (POCI-01-0145-FEDER-022122), ainsi que le soutien de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubulure en silicone de 1,6 mm de diamètre intérieur, mini drip set I.VFisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD3922
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70 % éthanolHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Utilisé pour concevoir les chiffres
Analyseur automatique Hitachi 717Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Allemagne8177-30-0010
Stylo barrière (Liquid blocker super pap pen)Daido Sangyo Co., Ltd, Japon_
BladeLeica221052145Utilisé dans le cryostat
Cell Profiler version 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/Utilisé pour analyser les images
Lamelles de recouvrementMenzel-Glaser, Allemagne_
CryomoulesTissue-Tek_
Cryostat (y compris disque d’échantillon et extracteur de chaleur) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceD-8418Utilisé pour dissoudre Bodipy dans la solution mère à 5 mg/mL. ATTENTION : Toxique
et inflammable. Les vapeurs peuvent provoquer une irritation
. Manipulez dans une hotte < fuméebr/>. Évitez tout contact direct avec la peau.
Portez des gants en caoutchouc, des lunettes de protection
.
Récipient de glace carbonique (glacière en polystyrène)NovolabA26742
Pince DumontFine Science Tools, Allemagne11295-10
Boîte de Pétri en verre (H 25 mm, ø ;
150 mm)		Thermo Scientific150318Utilisé pour peser le foie après dissection
GlycergelDAKO OmnisS303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
Régime riche en graissesEnvigo, Barcelone, EspagneMD.08811
Kétamine (Nimatek  ; 100 mg/mL)Dechra791/01/14DFVPTUtilisé à une concentration finale de 75 mg/kg
Microscope confocal à balayage laser  ; (unité de détection QUASAR ; )Carl Zeiss, allemagneLSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sédateur 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTUtilisé à une concentration finale de 1 mg/kg
AiguilleBD microlance300635
N° 15 Scalpel stérile en acier au carbone
Lame		Swann-Morton205
Objectifs 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) et 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  ; Carl Zeiss, Allemagne
PinceauxVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  ; Utilisé pour la réalisation de cryosections
Pompe péristaltique (Minipuls 3)Gilson1004170
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH ~ 7,4)Sigma-Aldrich, Lyon, FranceP3813
Manche de scalpel, 125 mm (5"), n° 3Swann-Morton0208
Système de coloration sur lame StainTraySimport ScientificM920
Régime standard  ; Mucedola4RF21
Superfrost Plus lames de microscopeMenzel-Glaser, AllemagneJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT support de montageVWR CHEMICALS361603E
Kit de dosage colorimétrique des triglycéridesCayman Chemical10010303
Bain à ultrasonsBandelin Sonorex  ;TK 52
Ressort Vannas ciseaux - 3 mm
pointe		Fine Science Tools, Allemagne15000-00
ZEN Logiciel noirZeiss
acquises

Références

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