Method Article

Utilisation du MouseWalker pour quantifier le dysfonctionnement locomoteur dans un modèle murin de lésion de la moelle épinière

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un pipeline expérimental pour décrire quantitativement le modèle locomoteur de souris marchant librement à l’aide de la boîte à outils MouseWalker (MW) est fourni, allant des enregistrements vidéo initiaux et du suivi à l’analyse post-quantification. Un modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris est utilisé pour démontrer l’utilité du système MW.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’exécution de programmes moteurs complexes et hautement coordonnés, tels que la marche et la course, dépend de l’activation rythmique des circuits rachidiens et supra-rachidiens. Après une lésion de la moelle épinière thoracique, la communication avec les circuits en amont est altérée. Ceci, à son tour, conduit à une perte de coordination, avec un potentiel de récupération limité. Par conséquent, pour mieux évaluer le degré de récupération après l’administration de médicaments ou de thérapies, il est nécessaire de disposer de nouveaux outils plus détaillés et plus précis pour quantifier la démarche, la coordination des membres et d’autres aspects fins du comportement locomoteur dans les modèles animaux de lésions de la moelle épinière. Plusieurs tests ont été développés au fil des ans pour évaluer quantitativement le comportement de marche libre chez les rongeurs; Cependant, ils manquent généralement de mesures directes liées aux stratégies de marche, aux modèles d’empreinte et à la coordination. Pour remédier à ces lacunes, une version mise à jour du MouseWalker, qui combine une passerelle de réflexion interne totale frustrée (fTIR) avec un logiciel de suivi et de quantification, est fournie. Ce système open-source a été adapté pour extraire plusieurs sorties graphiques et paramètres cinématiques, et un ensemble d’outils de post-quantification peut être pour analyser les données de sortie fournies. Ce manuscrit démontre également comment cette méthode, alliée à des tests comportementaux déjà établis, décrit quantitativement les déficits locomoteurs suite à une lésion de la moelle épinière.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coordination efficace de quatre membres n’est pas unique aux animaux quadrupèdes. La coordination des membres antérieurs et des membres postérieurs chez l’homme reste importante pour accomplir plusieurs tâches, telles que la natation et les modifications de la vitesse en marchant1. Divers circuits de rétroaction cinématiquedes membres 2 et moteurs 1,3,4, ainsi que les circuits de rétroaction proprioceptive5, sont conservés entre les humains et les autres mammifères et devraient être pris en compte lors de l’analyse des options thérapeutiques pour les troubles moteurs, tels que les lésions de la moelle épinière (LME)6,7,8.

Pour marcher, plusieurs connexions vertébrales des membres antérieurs et postérieurs doivent être correctement câblées et activées rythmiquement, ce qui nécessite des entrées du cerveau et une rétroaction du système somatosensoriel 2,9,10. Ces connexions culminent dans les générateurs centraux (CPG), qui sont situés au niveau cervical et lombaire pour les membres antérieurs et postérieurs, respectivement 1,9,10. Souvent, après une lésion médullaire, la perturbation de la connectivité neuronale et la formation d’une cicatrice gliale inhibitrice12 limitent la récupération de la fonction locomotrice, avec des résultats variant de la paralysie totale à la fonction restreinte d’un groupe de membres en fonction de la gravité de la blessure. Les outils permettant de quantifier précisément la fonction locomotrice après une lésion médullaire sont essentiels pour surveiller la récupération et évaluer les effets des traitements ou d’autres interventions cliniques6.

Le test métrique standard pour les modèles de contusion de souris de SCI est l’échelle de souris Basso (BMS)13,14, un score non paramétrique qui tient compte de la stabilité du tronc, de la position de la queue, du pas plantaire et de la coordination des membres antérieurs et postérieurs dans une arène en plein champ. Même si le BMS est extrêmement fiable dans la plupart des cas, il nécessite au moins deux évaluateurs expérimentés pour observer tous les angles de mouvement des animaux afin de tenir compte de la variabilité naturelle et de réduire le biais.

D’autres tests ont également été développés pour évaluer quantitativement les performances motrices après une lésion médullaire. Il s’agit notamment de l’essai rotarod, qui mesure le temps passé sur un cylindre rotatif15; l’échelle horizontale, qui mesure le nombre de garde-corps manqués et de poignées d’échelle positives16,17; et le test de marche à la poutre, qui mesure le temps qu’un animal prend et le nombre de défaillances qu’il fait lorsqu’il traverse une poutre étroite18. Bien qu’ils reflètent une combinaison de déficits moteurs, aucun de ces tests ne produit d’informations locomotrices directes sur la coordination des membres antérieurs et postérieurs.

Pour analyser spécifiquement et plus en profondeur le comportement de marche, d’autres tests ont été développés pour reconstruire les cycles de pas et les stratégies de démarche. Un exemple est le test d’empreinte, où les pattes encrées d’un animal dessinent un motif sur une feuille de papier blanc19. Bien que simple dans son exécution, l’extraction de paramètres cinématiques tels que la longueur de foulée est lourde et imprécise. De plus, l’absence de paramètres dynamiques, tels que la durée du cycle de pas ou la coordination jambe-temps, limite ses applications; En effet, ces paramètres dynamiques ne peuvent être acquis qu’en analysant des vidéos image par image de rongeurs marchant sur une surface transparente. Pour les études sur les LM, les chercheurs ont analysé le comportement de marche à partir d’une vue latérale à l’aide d’un tapis roulant, y compris la reconstruction du cycle des pas et la mesure des variations angulaires de chaque articulation de la jambe 4,20,21. Même si cette approche peut être extrêmement informative6, elle reste axée sur un ensemble spécifique de membres et manque de caractéristiques de démarche supplémentaires, telles que la coordination.

Pour combler ces lacunes, Hamers et ses collègues ont mis au point un test quantitatif basé sur un capteur tactile optique utilisant la réflexion interne totale frustrée (fTIR)22. Dans cette méthode, la lumière se propage à travers le verre par réflexion interne, se disperse lors de la pression de la patte et, finalement, est capturée par une caméra à haute vitesse. Plus récemment, une version open source de cette méthode, appelée MouseWalker, a été mise à disposition, et cette approche combine une passerelle fTIR avec un progiciel de suivi et de quantification23. En utilisant cette méthode, l’utilisateur peut extraire un grand ensemble de paramètres quantitatifs, y compris les modèles de pas, d’espace et de démarche, le positionnement de l’empreinte et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, ainsi que des sorties visuelles, telles que les motifs d’empreinte (imitant le test de la patte encrée6) ou les phases de position par rapport à l’axe du corps. Il est important de noter qu’en raison de sa nature open-source, de nouveaux paramètres peuvent être extraits en mettant à jour le package de script MATLAB.

Ici, l’assemblage précédemment publié du système MouseWalker23 est mis à jour. Une description de la façon de le configurer est fournie, avec toutes les étapes nécessaires pour obtenir la meilleure qualité vidéo, les meilleures conditions de suivi et l’acquisition des paramètres. Des outils de post-quantification supplémentaires sont également partagés pour améliorer l’analyse de l’ensemble de données de sortie MouseWalker (MW). Enfin, l’utilité de cet outil est démontrée par l’obtention de valeurs quantifiables pour la performance locomotrice générale, en particulier les cycles de pas et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, dans un contexte de lésion médullaire (LME).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de manipulation, de soins chirurgicaux et postopératoires ont été approuvées par le Comité Moléculaire interne de l’Instituto de Medicina (ORBEA) et le Comité portugais d’éthique animale (DGAV) conformément aux directives de la Communauté européenne (Directive 2010/63/UE) et à la loi portugaise sur les soins aux animaux (DL 113/2013) sous la licence 0421/000/000/2022. Des souris C57Bl/6J femelles âgées de 9 semaines ont été utilisées pour la présente étude. Tous les efforts ont été déployés pour minimiser le nombre d’animaux et diminuer la souffrance des animaux utilisés dans l’étude. Le script MATLAB et la version autonome du logiciel MW sont open-source et sont disponibles sur le GitHub
référentiel (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Bien que le logiciel MW ait été développé dans MATLAB R2012b, il a été adapté pour fonctionner dans MATLAB R2022b. La figure 1 illustre le flux de travail d’analyse du MW.

1. Mise en place de l’appareil MouseWalker (MW)

  1. Assembler l’appareil MW comme décrit précédemment23, ou l’adapter aux besoins spécifiques de la conception expérimentale (voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire 1 pour plus de détails sur la configuration).
    REMARQUE: L’arène de marche peut être élargie pour accueillir de plus gros animaux, tels que des rats.
  2. Vérifiez que le plexiglas où les animaux marchent est propre et exempt de rayures. Utilisez un chiffon de nettoyage lisse et minimisez l’utilisation de solvants organiques tels que l’ammoniac ou l’éthanol à des concentrations élevées, qui peuvent endommager le plexiglas (3% de peroxyde d’hydrogène, 7% d’éthanol ou tout désinfectant compatible et approprié pour plexiglas est recommandé). Si nécessaire, remplacez le plexiglas.
  3. Installez la caméra haute vitesse avec un objectif rapide et une grande ouverture (c’est-à-dire des valeurs d’arrêt F plus petites) pour capturer une grande quantité de lumière, car cela aide à enregistrer les signaux fTIR (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: L’objectif ne doit pas générer de distorsions optiques, en particulier sur les bords de l’image. Les distorsions optiques peuvent être testées en enregistrant un motif connu (par exemple, des bandes ou des carrés), puis en mesurant la taille des blocs sur ImageJ/FIJI24 (utilisez l’outil ligne, puis cliquez sur Analyser > mesurer). Par exemple, un carré de 1 cm doit avoir les mêmes dimensions en pixels au centre de l’image et sur les bords. Les variations doivent être inférieures à 5 %.
  4. Allumez la bande lumineuse LED multicolore à partir de la boîte lumineuse d’arrière-plan.
  5. Allumez la bande lumineuse LED blanche de la boîte à lumières de la passerelle.
    REMARQUE: Une LED colorée peut également être utilisée25 pour faciliter la distinction de l’empreinte / corps / arrière-plan.
  6. Une fois les lumières de la pièce éteintes, vérifiez l’intensité lumineuse de la boîte lumineuse d’arrière-plan et de la passerelle. Ajustez l’intensité, si nécessaire, à l’aide d’un potentiomètre ou d’un plastique semi-opaque. Ceux-ci doivent être optimisés pour que l’intensité des pixels augmente dans l’ordre suivant: le corps de l’animal < arrière-plan < les empreintes.
    1. Pour vérifier l’intensité en pixels du corps/arrière-plan/empreintes de l’animal, ouvrez la séquence d’images sur ImageJ/FIJI24 et cliquez sur Analyser > mesurer. Le signal d’empreinte ne doit pas être sursaturé, car cela empêcherait de définir les limites de l’empreinte (c.-à-d. les orteils et les repose-pieds) (figure supplémentaire 2).
  7. Ajustez le contraste d’image de la passerelle sur le logiciel d’enregistrement vidéo. Le contraste peut être ajusté de deux manières: en atténuant ou en augmentant l’éclairage sur la bande LED ou en ajustant l’ouverture de l’objectif de la caméra.
  8. Positionnez correctement la lentille pour qu’elle soit à la même hauteur et au centre du miroir réfléchissant à 45° et perpendiculaire (90°) à la passerelle. Cela générera une image constamment proportionnelle le long de la passerelle gauche-droite.
    REMARQUE: Évitez de modifier la position de la caméra (distance, hauteur et orientation) au cours des multiples sessions d’enregistrement. Si nécessaire, marquez le sol où le trépied doit être placé. Cela permettra de conserver les fonctionnalités de l’image.
  9. Focalisez la lentille sur la surface du plexiglas. Cela peut être testé en utilisant un objet non dommageable touchant la surface du plexiglas.
    REMARQUE: Avec des valeurs d’objectif F-stop inférieures, la profondeur de champ devient plus petite, ce qui rend la mise au point plus difficile.
  10. Assurez-vous que tous les paramètres restent inchangés pendant le test, car ils peuvent modifier l’intensité en pixels des vidéos enregistrées.

2. Acquisition vidéo

  1. Assurez-vous que les souris connaissent bien la pièce et l’appareil avant le test. Économisez au moins 1 jour pour l’accoutumance (jour 0). Pour éviter un entraînement excessif, effectuez le test MW un jour différent des autres tests comportementaux (de préférence le lendemain).
  2. Dans le logiciel d’enregistrement vidéo, assurez-vous qu’au moins 50 cm de la passerelle sont visibles.
  3. Ajustez les paramètres d’enregistrement pour tronquer la région de la passerelle. Cela réduira la taille de la vidéo et optimisera l’acquisition vidéo.
  4. Prenez une photo ou une courte vidéo d’une règle régulière avant chaque session. Le nombre de pixels par centimètre sera ensuite utilisé dans la « fenêtre des paramètres » pour calibrer les vidéos.
  5. Commencez l’acquisition vidéo et placez l’animal sur le bord de la passerelle en saisissant la base de la queue pour éviter les blessures. Assurez-vous que les animaux avancent jusqu’au bord extrême de la plate-forme. Effectuez les enregistrements vidéo avec au moins 100 images / s pour assurer des transitions de démarche en douceur.
    1. Si nécessaire, motivez les animaux à bouger en tapotant doucement le mur de la passerelle ou en claquant des doigts. Cependant, évitez les coups de pouce physiques, car cela pourrait affecter les résultats.
    2. Enregistrez les vidéos directement sous forme de séquences d’images au format TIFF (avec compression LZW), JPEG ou PNG. Dans le cas où la caméra enregistre en tant que fichier MOV brut, convertissez les vidéos en séquences d’images en ouvrant le fichier dans ImageJ / FIJI24 et en cliquant sur Fichier > Enregistrer en tant que séquence d’images > (ou en utilisant un autre logiciel, tel que LosslessCut25).
      NOTE: La plupart des animaux commencent à marcher immédiatement après avoir été mis dans la passerelle; Par conséquent, il est recommandé de commencer l’acquisition vidéo avant de placer l’animal.

3. Préparation des vidéos pour le logiciel de suivi MW

  1. Filmez suffisamment de séries complètes de chaque souris. Le nombre d’animaux à filmer par condition et le nombre de séries complètes doivent être déterminés en fonction de chaque plan expérimental. Une course complète se produit lorsque la souris parcourt les 50 cm de la passerelle sans arrêts prolongés (dans cette expérience, trois essais complets ont été sélectionnés).
    REMARQUE: Selon le logiciel d’acquisition d’images, les vidéos peuvent avoir besoin d’être recadrées au plus petit retour sur investissement. Cela augmentera la vitesse de suivi et de génération de sorties.
  2. Dans ImageJ/FIJI24, sélectionnez les images dans lesquelles la souris est à l’écran en cliquant sur Image > Stack > Tools > Créer une sous-pile. Le suivi sur le MW nécessite que la tête et la queue soient visibles dans tous les cadres. Il est toutefois possible de créer plusieurs sous-piles à partir d’un seul enregistrement vidéo, qui représentera plus tard chaque exécution.
  3. Enregistrez chaque sous-pile séparément dans différents dossiers en cliquant sur Fichier > Enregistrer en tant que séquence d’images >. Le logiciel MW crée ensuite automatiquement un sous-dossier dans chaque répertoire chaque fois que l’on commence à analyser une exécution.

4. Suivi

  1. Ouvrez MATLAB, ajoutez le dossier contenant le script MW au répertoire de travail et exécutez « MouseWalker.m » sur la ligne de commande principale.
    REMARQUE: L’utilisation du logiciel MW sous MATLAB permet d’afficher les messages d’erreur de suivi sur la console principale de MATLAB et de sélectionner les données de sortie souhaitées (en ouvrant le fichier de script principal « MouseEvaluate.m » et en changeant les sorties en 1 ou 0: le fichier Excel, les tracés de pas, les traces de position et les modèles de démarche).
  2. Chargez le dossier vidéo en tant que « Répertoire d’entrée ». On peut également choisir le dossier de sortie; cependant, ce n’est pas une exigence car le logiciel MW crée automatiquement un nouveau dossier appelé « Résultats » dans le « Répertoire d’entrée ».
  3. À l’aide des flèches « << », « < », « >> » et « > », vérifiez si les images vidéo sont toutes chargées correctement dans le logiciel MW.
  4. Allez dans la « fenêtre Paramètres » où se trouvent tous les paramètres d’étalonnage et de seuil. Ces paramètres peuvent changer en fonction de l’intensité en pixels de l’arrière-plan et des empreintes, ainsi que de la taille minimale du corps et des empreintes, entre autres facteurs (voir l’exemple dans la figure supplémentaire 2). Testez l’effet de la modification de certains paramètres en cliquant sur le bouton Aperçu .
    1. Utilisez les différents styles de tracé, y compris « corps + pieds + queue », « corps uniquement », « pieds seulement » et « queue uniquement », pour aider à distinguer les parties du corps après avoir ajusté les paramètres de seuil.
    2. Profitez des outils du panneau de droite pour prendre des mesures de luminosité ou de taille (en utilisant respectivement les boutons « luminosité » et « règle »). Tous les paramètres peuvent être enregistrés par défaut tant que la distance de la caméra reste la même.
  5. Après avoir ajusté les paramètres de seuil, vérifiez que la vidéo est prête pour le suivi automatisé. Accédez à la première image et cliquez sur Auto pour démarrer le suivi. Cette étape peut être suivie en temps réel, et cela prend quelques minutes, en fonction de la taille de la vidéo et des performances de l’ordinateur.
    1. Si le suivi automatique étiquette incorrectement les caractéristiques du corps, annulez le suivi automatique, entrez de nouveaux paramètres et redémarrez le processus.
  6. Une fois le suivi terminé, vérifiez si une correction manuelle est nécessaire. Pour corriger, utilisez le panneau du milieu pour sélectionner ou désélectionner, et indiquez l’emplacement des empreintes de pattes, de la tête, du nez, du corps (divisé en deux segments) et de la queue (divisée en quatre segments) à l’avant droit (RF), à l’arrière droit (RH), à l’avant gauche (LF) et à la postérieure gauche (divisée en quatre segments). Enregistrez les modifications en appuyant sur le bouton Enregistrer .
    REMARQUE: Tous les boutons et la plupart des commandes ont un raccourci clavier (consultez le manuel associé pour plus de détails23). Pour faciliter le défilement vidéo et l’exécution des raccourcis clavier, un contrôleur matériel avec des boutons programmables et une roue de navette comme le Contour ShuttlePro V2 peuvent être utilisés.
  7. Cliquez sur Évaluer pour générer les fichiers de sortie à partir de la vidéo suivie. Selon la sortie souhaitée sélectionnée (voir étape 4.1), cette étape peut prendre quelques minutes.
  8. Vérifiez que tous les graphiques de données de sortie sont enregistrés dans le dossier « Résultats ». Vérifiez l’exactitude du suivi en examinant certaines des sorties graphiques, telles que les « traces de position », où l’on peut vérifier si toutes les positions des pattes sont cohérentes.
    1. Si une erreur est identifiée, corrigez manuellement le suivi (si possible; sinon, éliminez le dossier « Résultats » et effectuez à nouveau le suivi automatique avec de nouveaux paramètres), puis cliquez à nouveau sur la commande Évaluer .
  9. Vérifiez que toutes les mesures quantitatives générées par le logiciel MW sont enregistrées sur une feuille de calcul Excel et résumées sur « 1. Info_Sheet ». Assurez-vous que les options Excel pour les délimitations de formule correspondent au script. Le séparateur décimal doit être « , », et les séparateurs de milliers doivent être « ; ».
  10. Utilisez le script « MouseMultiEvaluate.m » pour rassembler les mesures de toutes les exécutions dans un nouveau fichier pour analyse.
    1. Pour commencer, générez un fichier .txt contenant les chemins de dossier pour toutes les vidéos (par exemple, « Videofiles.txt »). Assurez-vous que chaque ligne correspond à une seule vidéo.
    2. Ensuite, écrivez « MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt') » dans la ligne de commande. Un fichier Excel nommé « ResultSummary.xls » sera généré dans le répertoire de travail (voir un exemple dans le référentiel GitHub).
      NOTE: La figure 2 représente les sorties graphiques obtenues par le logiciel MW à partir des vidéos d’un animal enregistré.

5. Flux de travail d’analyse des données cinématiques

  1. Modifiez la feuille Excel générée à l’étape 4.10, qui contient les données à traiter à l’aide des scripts Python fournis, selon les conditions préalables suivantes.
    1. Dans le premier en-tête de colonne, spécifiez la condition expérimentale. Nommez chaque ligne qui suit le nom du groupe/de la condition (les individus des mêmes groupes doivent avoir le même nom). Le premier groupe doit être le témoin ou la ligne de base (ceci n’est obligatoire que pour le traçage de la carte thermique, étape 5.6).
    2. Dans la deuxième colonne, spécifiez l’ID de l’animal. Ceci est obligatoire, bien que ces informations ne soient pas utilisées pour la génération de parcelles.
    3. Dans la troisième colonne et suivantes, choisissez les paramètres du moteur qui seront utilisés pour l’analyse. Assurez-vous que la première ligne est le nom du paramètre (ces noms apparaîtront ultérieurement dans les tracés).
  2. Ouvrez Anaconda Navigator et exécutez Spyder pour ouvrir les scripts Python fournis.
    REMARQUE: Tous les scripts ont été développés avec Python 3.9.13, ont été exécutés avec Spyder 5.2.2 dans Anaconda Navigator 2.1.4, et sont disponibles dans la Table of Materials et le dépôt GitHub (où des matériaux supplémentaires sont inclus, tels qu’un exemple vidéo, un fichier d’exemple Excel et un document FAQ). Il est possible d’exécuter les scripts en dehors de l’Anaconda Navigator ; Cependant, cette interface utilisateur graphique est plus conviviale.
  3. Utilisez le « Rawdata_PlotGenerator.py » pour générer les graphiques de données brutes. Cela permettra de visualiser chaque paramètre en fonction de la vitesse.
    1. Ouvrez « Rawdata_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
    2. Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
    3. Les graphiques de données brutes apparaîtront dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer les tracés, cliquez sur le bouton Enregistrer l’image ou Enregistrer toutes les images dans la console du tracé.
  4. Utilisez le script « Residuals_DataAnalysis » pour calculer les résidus pour l’analyse des données. Ce script générera un fichier CSV avec les calculs des résidus pour tous les paramètres du moteur.
    REMARQUE : Bon nombre des paramètres de marche mesurés extraits par le MW varient selon la vitesse (p. ex., vitesse de rotation, longueur de pas, durée de position, rectitude de position et indices de marche). Par conséquent, il est recommandé d’effectuer un modèle de régression le mieux ajusté de chaque paramètre individuel en fonction de la vitesse pour l’expérience de référence, puis de déterminer les valeurs résiduelles pour chaque groupe expérimental par rapport à ce modèle de régression. Les données sont ensuite exprimées sous forme de différence par rapport à la ligne26 normalisée résiduelle.
    1. Ouvrez « Residuals_DataAnalysis.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
    2. Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
    3. Enregistrez le fichier CSV dans le même dossier que les données. Il est obligatoire que le contrôle (ou ligne de base) soit le premier groupe du fichier Excel.
  5. Utilisez le script « PCA_PlotGenerator.py » pour effectuer une analyse en composantes principales (ACP).
    REMARQUE : Cette méthode de réduction de dimensionnalité non supervisée est utilisée pour générer une représentation plus succincte 27,28,29 des données (Figure 3A, B). Le script PCA comprend les étapes suivantes. Les données sont d’abord prétraitées par centrage et mise à l’échelle, après quoi l’algorithme PCA calcule la matrice de covariance pour déterminer les corrélations entre les variables et calculer les vecteurs propres et les valeurs propres de la matrice de covariance pour identifier les composantes principales. Les deux ou trois premières composantes principales sont choisies pour la représentation des données dans des tracés 2D ou 3D, respectivement. Chaque point des graphiques correspond à un animal et représente une variable abstraite différente. Des points codés par couleur sont utilisés pour distinguer les groupes spécifiques. En tant que tels, les groupes de points reflètent des modèles de marche similaires partagés par les individus correspondants.
    1. Ouvrez « PCA_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
    2. Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
    3. Assurez-vous que les tracés PCA 2D et 3D apparaissent dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Chaque couleur représente un groupe différent et la légende apparaît à côté de l’intrigue. Pour enregistrer le tracé, cliquez sur Enregistrer l’image dans la console du tracé.
  6. Utilisez « Heatmap_PlotGenerator.py » pour générer une carte thermique. Assurez-vous que le générateur de carte thermique crée un tableau montrant les différences statistiques entre le groupe de référence (ou groupe témoin) et les autres groupes pour chaque paramètre moteur27 (Figure 4). Chaque colonne représente un groupe et chaque ligne se rapporte à un paramètre moteur spécifique.
    REMARQUE : L’analyse statistique a été effectuée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey (pour les distributions normales) ou une ANOVA de Kruskal-Wallis suivie du test post hoc de Dunn (pour les distributions non normales). Les valeurs aberrantes ont été exclues de l’analyse. Les valeurs de p sont représentées par un code couleur, avec des nuances de rouge et de bleu indiquant une augmentation ou une diminution par rapport au contrôle (ou à la ligne de base), respectivement. La nuance de couleur représente la signification statistique, les couleurs plus foncées montrant une signification plus élevée et les couleurs plus claires montrant une signification inférieure. correspond à P < 0,001; ** correspond à P < 0,01; et * correspond à P < 0,05. Le blanc indique qu’il n’y a pas de variation.
    1. Ouvrez « Heatmap_PlotGenerator.py » dans Spyder, et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
    2. Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
    3. Sélectionnez le type de données dans la deuxième fenêtre automatique : données brutes ou données résiduelles. Si aucune option n’est sélectionnée, les données résiduelles sont les données par défaut.
    4. La carte thermique apparaîtra dans la console du tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer le tracé, cliquez sur Enregistrer l’image dans la console du tracé.
      Remarque : Il est obligatoire que le contrôle (ou ligne de base) est le premier groupe dans le fichier Excel.
  7. Utilisez « Boxplots_PlotGenerator.py » pour générer les boxplots. Cet outil permettra de générer des boxplots qui représentent la distribution des valeurs pour tous les paramètres moteurs de chaque groupe (Figure 5, Figure 6 et Figure 7).
    REMARQUE : Chaque case contient la médiane comme ligne médiane, et les bords inférieur et supérieur des cases représentent les quartiles de 25 % et de 75 %, respectivement. Les moustaches représentent la plage de l’ensemble complet des données, à l’exclusion des valeurs aberrantes. Les valeurs aberrantes sont définies comme toute valeur qui est 1,5 fois la plage interquartile inférieure ou supérieure aux quartiles de 25 % et de 75 %, respectivement.
    1. Ouvrez « Boxplots_PlotGenerator.py » dans Spyder et exécutez le code en cliquant sur le bouton Lecture .
    2. Sélectionnez le fichier Excel à analyser et le nom de la feuille dans la fenêtre automatique. Si le nom de la feuille n’a pas été modifié, écrivez « Sheet1 ».
    3. Sélectionnez le type de données dans la deuxième fenêtre automatique : données brutes ou données résiduelles. Si aucune option n’est sélectionnée, les données résiduelles sont les données par défaut.
    4. Les boxplots apparaîtront dans la console de tracé (panneau supérieur droit). Pour enregistrer les tracés, cliquez sur le bouton Enregistrer l’image ou Enregistrer toutes les images dans la console du tracé.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système BMS standard décrit les déficits moteurs bruts après SCI14. En raison de sa nature subjective, d’autres tests quantitatifs sont généralement effectués parallèlement au BMS pour produire une évaluation plus détaillée et plus fine de la locomotion. Cependant, ces tests ne montrent pas d’informations spécifiques sur les cycles de pas, les modèles de pas et la coordination des membres antérieurs et postérieurs, ce qui est extrêmement important pour comprendre comment les circuits rachidiens...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, le potentiel de la méthode MouseWalker est démontré en analysant le comportement locomoteur après une lésion médullaire. Il fournit de nouvelles informations sur des modifications spécifiques des modèles de pas, d’empreinte et de démarche qui seraient autrement manquées par d’autres tests standard. En plus de fournir une version mise à jour du package MW, les outils d’analyse de données sont également décrits à l’aide des scripts Python fournis (voir étape 5).

Comme le MW génère un grand ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Laura Tucker et Natasa Loncarevic pour leurs commentaires sur le manuscrit et le soutien apporté par le Rodent Facility de l’Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier de Prémios Santa Casa Neurociências - Prix Melo e Castro pour la recherche sur les lésions de la moelle épinière (MC-36/2020) à L.S. et C.S.M. Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 et UIDP/04462/2020), et LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) au C.S.M. L.S. a été soutenu par un contrat de chercheur principal individuel CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. a été soutenu par une bourse doctorale de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. a bénéficié d’une bourse doctorale de la FCT (/BD/128445/2017). I.M. a bénéficié d’une bourse postdoctorale de la FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. a été soutenu par une bourse doctorale de la FCT (SFRH/BD/138636/2018).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
45º ; Miroir  ;
2 extrusion d’aluminium (2 x 2 cm), 16 cm de hauteur, 1 de chaque côtéMisumi
2 extrusion d’aluminium (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° ; , 1 de chaque côtéMisumi
1 extrusion d’aluminium (2 x 2 cm), 83 cm de longMiroir Misumi
87 x 23 cm Fournisseurgénéral de verre  ;
Remplisseuse de carton noir  ;avons utilisé 2, l’un de 69 x 6 cm et l’autre de 69 x 3 cm pour limiter la réflexion sur le miroir
Arrière-plan rétroéclairé
109 x 23 cm plexiglas (0,9525 cm d’épaisseur)Fournisseur
2 extrusion latérale d’aluminium (4 x 4 cm), 20 cm de long, 1 de chaque côtéMisumi
bande LED multicoloreFournisseur général de quincaillerie Papier
opaque blanc pour couvrir le plexyglassFournisseur
fTIR Base de support et poteaux
2 extrusion d’aluminium (4 x 4 cm), 100 cm de hauteurMisumi
60 x 30 cm plaque d’essai métriqueEdmund Optics  ;#54-641
M6 12 mmvis Edmund Optics  ;
Écrous hexagonaux M6 et wahersEdmund Optics  ;
fTIR’sp ;
109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm d’épaisseur)Quincaillerie générale Fournisseur109 x 8,5 cm plexyglass (1,2 cm d’épaisseur)
109 cm de long Base-U-channel aluminium avec 1,6 cm de hauteur x 1,9 cm de profondeur plis épais (pour maintenir le plexyglass)Quincaillerie générale 2
extrusions latérales en aluminium (4 x 4 cm) 20 cm de longueur, 1 de chaque côtéMisumi
Remplisseuse de carton noir  ;général de papeterie, nous avons utilisé 2 charges de chaque côté pour couvrir les limites du plexyglass, en évitant les bords brillants
M6 12 mmvis Edmund Optics  ;
Appareil photo haute vitesse (sur trépied)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CIl s’agit d’une recommandation. L’exigence est d’enregistrer au moins 100 images par seconde
Impacteur à horizon infini ».
Impacteur à horizon infini »Systèmes et instrumentation de précision, LLC.#0400
Objectif
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Cet objectif est recommandé, mais d’autres objectifs peuvent être utilisés. Assurez-vous qu’il contient une grande ouverture (c’est-à-dire des valeurs F-stop plus petites) pour capturer les signaux fTIR
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13  ;Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5  ;du projet Spyder
Walkway wall  ;
2 grands acryliques rectangulaires de 100 x 15 cmTout magasin
2 latéraux acriliques trapéziens de 6 à 10 de longueur x 15 cm de hauteurTout magasin
GitHub Materials
Nom du dossierURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsScript pour créer des Boxplots
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsDocuments supplémentaires
Heatmaphttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsScript pour créer une carte thermique
Script Matlathttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker Script matlab
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript pour effectuer une analyse en composantes principales
Données brutes Tracéshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsScript pour créer des graphiques de données brutes
Analyse résiduellehttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisCode pour calculer les résidus à partir de données brutes
Nous général de quincaillerie général de papeterieFournisseur Contributeurs de bricolage de bricolage

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

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