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Article de méthode

Lésion non invasive du ligament croisé antérieur (LCA) induite par compression et imagerie in vivo de l’activité de la protéase chez la souris

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DOI :

10.3791/65249

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29 septembre 2023

 , 
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Dans cet article

Résumé

La lésion non invasive du LCA est une méthode fiable et cliniquement pertinente pour initier l’arthrose post-traumatique (PTOA) chez la souris. Cette méthode permet également de quantifier in vivo l’activité de la protéase dans l’articulation à des moments précoces après la blessure à l’aide de sondes proches infrarouges activables par protéase et d’imagerie par réflectance de fluorescence.

Résumé

Les blessures articulaires traumatiques telles que la rupture du ligament croisé antérieur (LCA) ou les déchirures du ménisque entraînent généralement une arthrose post-traumatique (PTOA) dans les 10 à 20 ans suivant la blessure. Comprendre les processus biologiques précoces initiés par les lésions articulaires (par exemple, l’inflammation, les métalloprotéinases matricielles (MMP), les protéases de cathepsine, la résorption osseuse) est crucial pour comprendre l’étiologie de la PTOA. Cependant, il existe peu d’options pour la mesure in vivo de ces processus biologiques, et les réponses biologiques précoces peuvent être faussées si des techniques chirurgicales invasives ou des injections sont utilisées pour initier l’arthrose. Dans nos études sur la PTOA, nous avons utilisé des sondes activables de protéase dans le proche infrarouge disponibles dans le commerce combinées à l’imagerie par réflectance de fluorescence (IRF) pour quantifier l’activité de la protéase in vivo après une lésion non invasive du LCA induite par compression chez la souris. Cette méthode non invasive de lésion du LCA récapitule fidèlement les conditions de blessure cliniquement pertinentes et est complètement aseptique car elle n’implique pas de perturber la peau ou la capsule articulaire. La combinaison de ces méthodes de blessure et d’imagerie nous permet d’étudier l’évolution temporelle de l’activité de la protéase à plusieurs moments après une blessure articulaire traumatique.

Introduction

L’arthrose est un problème de santé omniprésent qui touche des millions de personnes aux États-Unis1. L’arthrose post-traumatique (PTOA) est un sous-ensemble de l’arthrose qui est initié par une blessure articulaire telle qu’une rupture du ligament croisé antérieur (LCA), une lésion du ménisque ou une fracture intra-articulaire2. La proportion de patients atteints d’arthrose symptomatique pouvant être classés comme PTOA est d’au moins 12 %3, et cette étiologie affecte généralement une population plus jeune que l’arthrose idiopathique4. Les modèles murins d’arthrose sont des outils cruciaux pour étudier l’étiologie de la maladie et les traitements potentiels de l’arthrose dans un délai beaucoup plus court (4 à 12 semaines chez les modèles murins contre 10 à 20 ans chez l’homme). Cependant, les méthodes pour initier l’arthrose chez la souris impliquent généralement des techniques chirurgicales invasives telles que la transsection du LCA 5,6, l’ablation ou la déstabilisation du ménisque médial 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, ou une combinaison des deux 17,18,19, qui ne reproduisent pas les conditions de blessure cliniquement pertinentes. Les modèles chirurgicaux exacerbent également l’inflammation de l’articulation en raison de la perturbation de la capsule articulaire, ce qui pourrait accélérer la progression de l’arthrose.

Les modèles murins non invasifs de blessures au genou offrent la possibilité d’étudier les changements biologiques et biomécaniques à des moments précoces après la blessure et peuvent donner des résultats plus pertinents sur le plan clinique20. Notre laboratoire a établi un modèle de blessure non invasif qui utilise une seule surcharge de compression tibiale appliquée de l’extérieur pour induire une rupture du ligament croisé antérieur (LCA) chez la souris 21,22,23,24. Cette méthode de blessure non invasive est capable de produire une blessure articulaire aseptique sans perturber la peau ou la capsule articulaire.

L’imagerie par réflectance de fluorescence (IRF) est une méthode d’imagerie optique qui consiste à exciter une cible avec de la lumière infrarouge à une longueur d’onde spécifique et à quantifier la lumière réfléchie émise à une autre longueur d’onde. Des sondes spécifiques à la protéase disponibles dans le commerce peuvent être injectées dans des modèles animaux et l’IRF peut ensuite être utilisée pour quantifier l’activité de la protéase à des sites spécifiques tels que l’articulation du genou. Cette méthode a été largement utilisée pour la détection in vivo d’activités biologiques telles que l’inflammation. Les sondes utilisées pour cette application sont trempées par fluorescence jusqu’à ce qu’elles rencontrent des protéases pertinentes. Ces protéases briseront ensuite un site de clivage enzymatique sur les sondes, après quoi elles produiront un signal fluorescent proche infrarouge. Ces sondes et cette méthode d’imagerie ont été largement validées et utilisées dans des études sur le cancer 25,26,27,28 et l’athérosclérose 29,30,31,32, et notre groupe les a utilisées pour des études du système musculo-squelettique afin de mesurer les marqueurs de l’inflammation et de la dégradation de la matrice 23,24,33.

Ensemble, les lésions articulaires non invasives combinées à l’IRF in vivo et aux sondes activables par protéase offrent une capacité unique à suivre l’inflammation et l’activité de la protéase après une blessure articulaire traumatique. Cette analyse peut être effectuée dès des heures, voire quelques minutes après la blessure, et le même animal peut être évalué plusieurs fois pour étudier l’évolution de l’activité de la protéase dans l’articulation. Il est important de noter que cette méthode d’imagerie peut ne pas être réalisable lorsqu’elle est combinée à des modèles chirurgicaux d’arthrose, car la perturbation de la peau et de la capsule articulaire entraîne un signal de fluorescence qui confondrait le signal de l’intérieur de l’articulation.

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Protocole

Toutes les procédures décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis. Des souris C57BL/6J mâles de 3 mois ont été utilisées pour la présente étude.

1. Lésion non invasive du LCA

REMARQUE : La lésion du LCA produite par une charge de compression appliquée de l’extérieur est une méthode simple et reproductible qui récapitule fidèlement les conditions de lésion du LCA chez l’homme. Ce protocole est écrit pour un instrument de cadre de charge disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux), mais pourrait être adapté à des systèmes similaires.

  1. Ouvrez le logiciel compatible avec l’instrument de cadre de charge (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez un fichier de contrôle existant ou créez un nouveau fichier.
  2. Mettez l’actionneur sous tension.
  3. Dans le menu d’étalonnage, tarez la lecture de la force du capteur de pesage et réglez le déplacement de l’actionneur sur 0.
  4. Utilisez de l’isoflurane inhalé de 1 % à 4 % dans de l’oxygène pour anesthésier les souris et assurez-vous que les animaux sont complètement anesthésiés par pincement des orteils et/ou de la queue.
  5. Placez la souris en position couchée sur la plate-forme. Placez la jambe inférieure verticalement entre deux dispositifs de chargement (Figure 1) (voir le tableau des matériaux). Insérez le pied dans la découpe de l’appareil supérieur et le genou dans la coupe de l’appareil inférieur.
  6. Ajustez manuellement la hauteur du dispositif inférieur pour appliquer une précharge de 1-2 N (surveillée en temps réel sur l’écran de l’ordinateur) et serrez la vis de réglage pour maintenir la position. La précharge est nécessaire pour maintenir la jambe dans la bonne position avant d’appliquer la charge de blessure.
  7. Appliquez une seule charge de compression à une force cible (~12-15 N) ou à un déplacement cible (~1,5-2,0 mm).
    REMARQUE : L’application de la charge à un taux de charge plus lent (~1 mm/s) fournira un plus grand niveau de surveillance et de contrôle en temps réel, mais entraînera probablement une défaillance par avulsion de l’ACL. L’application d’un taux de charge plus rapide (~200 mm/s) sera plus susceptible de produire une lésion du LCA à mi-substance22. S’il est déterminé qu’une fracture du tibia ou une autre blessure excessive s’est produite, euthanasier l’animal en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC avant que l’animal ne se remette de l’anesthésie.
    1. Définissez le taux de chargement dans le fichier de contrôle du logiciel et confirmez à l’aide des données force-déplacement.
      REMARQUE : La fracture osseuse lors de la charge de compression tibiale n’est généralement pas un problème car la force de fracture (~20 N) est considérablement plus élevée que la force de blessure du LCA. Cependant, cela doit être surveillé par palpation, et l’imagerie (c’est-à-dire la radiographie) peut être utilisée pour confirmer qu’aucune fracture du tibia ne s’est produite.
  8. La blessure est généralement indiquée par un son (« clic » ou « craquement ») et un relâchement de force identifiable sur les graphiques force-déplacement (Figure 1C). Si un taux de charge plus lent est utilisé, arrêtez la charge de compression immédiatement après la blessure pour éviter une charge supplémentaire et d’éventuels dommages aux autres tissus articulaires.
    REMARQUE : La lésion du LCA survient généralement à 8-15 N selon la masse corporelle34. Il est important de fixer une force cible supérieure à la force de blessure prévue du LCA.
  9. Confirmez la lésion du LCA à l’aide d’un test de tiroir antéro-postérieur35,36 ou d’une évaluation comparable de l’instabilité articulaire.
  10. Administrer une dose dépendante du poids de l’animal (p. ex., 0,05 à 0,1 mg/kg de SC ou IP de buprénorphine, voir le tableau des matières) aux souris après la blessure, avec une durée et une dose recommandées et approuvées par l’établissement d’origine, l’IACUC.
    REMARQUE : Les AINS peuvent modifier la progression de la PTOA après une blessure, il n’est donc pas recommandé d’utiliser des AINS pour la gestion de la douleur dans ce modèle de blessure, sauf s’il s’agit d’un objectif spécifique de l’étude.

2. Préparation des animaux pour l’imagerie IRF

REMARQUE : Pour l’imagerie optique, la fourrure animale (en particulier la fourrure foncée) est très efficace pour bloquer, absorber et diffuser la lumière, par conséquent, la fourrure doit être retirée autant que possible de la zone autour des articulations du genou avant l’imagerie. Une crème dépilatoire est généralement plus efficace pour l’épilation que les tondeuses. Les souris nues ou sans poils n’ont pas besoin d’être enlevées. Cependant, l’épilation est nécessaire pour les souches de souris les plus couramment utilisées (p. ex., C57BL/6). Si possible, nourrissez les souris avec des aliments purifiés à faible fluorescence avant l’imagerie. La nourriture standard de souris contient de la chlorophylle, qui s’auto-fluoresse avec une longueur d’onde d’environ 700 nm et peut affecter la collecte de données à partir du système IRF proche infrarouge.

  1. Anesthésier les souris avec 1 à 4 % d’isoflurane inhalé dans de l’oxygène. Gardez les souris sur un coussin chauffant autant que possible et appliquez une pommade pour les yeux pour éviter l’irritation des yeux.
  2. Utilisez un coton-tige pour appliquer la crème dépilatoire (voir le tableau des matières) sur la face antérieure (crânienne) des pattes des souris autour de l’articulation du genou.
  3. Laissez reposer la crème pendant ~1 min, puis utilisez des lingettes pour retirer la crème et la fourrure de la jambe. Répétez si nécessaire.
  4. Une fois que les articulations du genou sont complètement exposées sans qu’aucune fourrure ne recouvre la zone, nettoyez les jambes avec des lingettes imbibées d’alcool pour éliminer toute crème dépilatoire restante.
    REMARQUE : La crème dépilatoire peut être utilisée sur les mêmes souris plusieurs fois au cours d’une étude, mais ces applications doivent être espacées d’au moins une semaine pour éviter une irritation inutile de la peau.

3. Préparation de la solution de sonde

  1. Si nécessaire, diluer la sonde activable par fluorescence selon les instructions du fabricant dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile 1x. Un flacon de la sonde disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) contient généralement 20 nmol dans 0,15 mL de 1x PBS. Pour diluer la solution dans le flacon, ajouter 1,35 mL de 1x PBS pour obtenir 20 nmol dans 1,5 mL de 1x PBS.
    REMARQUE : Après dilution, un flacon peut être utilisé pour imager dix souris lors de l’injection de 0,15 mL par souris.
  2. Agiter la solution avec une vitesse minimale (~2000 tr/min) pendant 30 s pour s’assurer que la sonde est dissoute dans la solution, puis centrifuger brièvement pour s’assurer que tout le liquide est sorti du couvercle.
    REMARQUE : La solution peut être conservée à une température de 2 à 8 °C dans un endroit protégé de la lumière jusqu’à 12 mois.

4. Injection rétro-orbitale

REMARQUE : Se référer à Yardeni et al. pour les détails de cette procédure37.

  1. Utilisez de l’isoflurane inhalé de 1 % à 4 % dans de l’oxygène pour anesthésier les souris et placez la souris sur le côté avec le museau dans un cône nasal.
  2. Utilisez des seringues à insuline de ~29 G pour l’injection de la solution de sonde (préparée à l’étape 3).
  3. Gardez la seringue couverte avant utilisation pour éviter toute exposition à la lumière.
  4. Lors de l’administration de l’injection :
    1. Injecter à l’intérieur de l’œil (caroncule lacrymale) et s’assurer que le biseau de la seringue est incliné vers l’œil. Pour les droitiers, il est recommandé d’injecter dans l’œil droit de la souris avec l’animal tourné vers la droite.
    2. Avec la main non injectable, tirez doucement la peau autour de l’œil vers l’arrière pour stabiliser la tête et faire saillir l’œil.
    3. Inclinez la seringue parallèlement au corps de la souris.
    4. Avancez doucement la seringue au-delà de l’œil jusqu’à ce qu’elle rencontre une résistance rigide ; N’essayez pas de pousser au-delà de ce point.
    5. Injectez lentement la solution de sonde dans le sinus rétro-orbitaire, puis retirez lentement l’aiguille de l’orbite. Si aucune solution ne sort avec l’aiguille, l’injection réussit.
    6. Appliquez une solution saline ou une pommade oculaire sur l’œil injecté.
      REMARQUE : D’après la documentation fournie avec les sondes d’imagerie, le temps d’imagerie optimal est généralement compris entre 1 et 2 jours après l’injection de la solution de sonde. Si possible, il est recommandé de faire un dépistage initial pour déterminer le temps d’imagerie optimal pour chaque application spécifique. Les souris métabolisent la sonde injectée dans un délai d’environ 7 jours, après quoi une nouvelle dose de solution de sonde devra être injectée si des points de temps supplémentaires sont souhaités.

5. Imagerie par réflectance de fluorescence

REMARQUE : Les procédures de cette section sont spécifiques à un système d’imagerie optique disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Des images similaires peuvent être réalisées avec des systèmes comparables.

  1. Anesthésier des souris avec de l’isoflurane inhalé à 1 % à 4 % dans de l’oxygène et placer l’animal en décubitus dorsal dans le système d’imagerie avec le museau dans un cône nasal.
  2. Positionnez la souris avec le bas des jambes tendues de manière à ce que les genoux soient légèrement pointés en l’air (il peut être nécessaire de coller les pieds avec du ruban adhésif). Il est essentiel qu’un positionnement cohérent soit utilisé pour tous les animaux.
  3. Ouvrez le logiciel compatible (voir Tableau des matériaux) sur l’ordinateur du système d’imagerie ; le « Panneau de contrôle d’acquisition » apparaîtra.
  4. Pour réchauffer le système, cliquez sur Initialiser et attendez que le voyant de température devienne vert.
  5. Cliquez sur Assistant d’imagerie et assurez-vous que la fenêtre « Assistant d’imagerie » apparaîtra.
  6. Cliquez sur Paire de filtres et assurez-vous que le paramètre est sur « Epi-Illumination », puis appuyez sur Suivant.
  7. Pour sélectionner les paramètres d’excitation/émission corrects, recherchez la sonde qui vous intéresse dans la liste déroulante. Si l’on ne trouve pas la bonne sonde, trouvez le nom « Input Ex/Em » et saisissez manuellement la valeur de Pic d’excitation et Pic d’émission en fonction de la propriété de la sonde à utiliser (par exemple, pour Pic d’excitation, entrez 675 et pour Pic d’émission, entrez 720). Cliquez sur Suivant.
  8. Choisissez la souris pour « Sujet d’image ». Dans « Paramètres d’exposition », assurez-vous que les paramètres automatiques sont cochés et que les options Fluorescent et Photographie sont sélectionnées. Sélectionnez D-22,6 cm dans la liste de contrôle du « Champ de vision ». Appuyez sur Suivant.
  9. Le réglage de l’image peut être vu et modifié sur le panneau de droite du « Panneau de contrôle d’acquisition ». Assurez-vous que tous les paramètres sont corrects et appuyez sur le bouton Acquérir la séquence . Une fois l’image affichée, vérifiez que l’image a eu une exposition adéquate. Si ce n’est pas le cas, modifiez le paramètre de temps d’exposition et cliquez à nouveau sur Acquérir la séquence .
  10. Pour analyser l’image, positionnez un cercle de région d’intérêt (ROI) de taille constante sur chaque articulation du genou sur l’image en noir et blanc (cela évite un positionnement biaisé basé sur les zones de signal fluorescent).
  11. Calculer l’efficacité radiante totale et/ou l’efficacité radiante moyenne pour chaque articulation du genou. Si l’efficacité radiante est également calculée sur les jambes controlatérales, normalisez les données en divisant la mesure de l’efficacité radiante de la jambe blessée par la mesure de l’efficacité radiante de la jambe controlatérale.
    REMARQUE : Si une région d’intérêt avec une surface constante est utilisée pour tous les genoux, l’efficacité radiante totale et l’efficacité radiante moyenne donneront des résultats similaires. L’utilisation d’une efficacité radiante moyenne est recommandée si des régions d’intérêt de tailles différentes sont utilisées. La normalisation des données sur l’efficacité radiante de l’articulation blessée avec les données du genou controlatéral non blessé fournira un contrôle interne pour tenir compte de toute différence dans la quantité de sonde injectée et l’efficacité de l’administration entre les différents animaux.

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Résultats

Après l’application d’une seule force de compression (1 mm/s jusqu’à la blessure) sur le bas des pattes de souris mâles C57BL/6J âgées de 3 mois, une lésion du LCA a été systématiquement induite chez toutes les souris. La force de compression moyenne lors d’une blessure au genou était d’environ 10 N (figure 1).

L’analyse FRI a montré une activité protéase significativement plus élevée dans les articulations blessées des souris soumises à une lésion non invasive du...

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Discussion

Ce protocole a établi et décrit rigoureusement une méthode reproductible et non invasive pour induire des lésions du LCA chez la souris 20,21,24,33. Cette méthode simple et efficace peut être réalisée en quelques minutes seulement, ce qui facilite les études à haut débit de la PTOA. Cette méthode récapitule également de près les conditions de blessure pertinentes pour les lésions du LCA chez l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les recherches présentées dans cette publication ont été soutenues par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, qui fait partie des National Institutes of Health, sous le numéro de prix R01 AR075013.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x Vaporisateur de tissu salin tamponné au phosphateProtechPBS01-32Rou équivalent
d’anesthésieavec chambre d’induction et cône nasal
BuprénorphineAnalgésique post-blessure  ;
Crème dépilatoireVeetB001KYPZ4Gou équivalente
Fixation sur mesure pour le genou, la cheville et la plate-forme
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262Peut également utiliser un système d’imagerie optique comparable
KimwipesKimberly-Clark Corporation06-666ou un logiciel Living
Image équivalent.Perkin Elmer
  ;TA InstrumentsElectroforce 3200 ou équivalent
ProSense680Perkin ElmerNEV10003Peut également utiliser d’autres sondes telles que OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Seringue stérile avec spectre d’aiguilleChemical Mfg. Corp.550-82231-CSSeringue Covidien 1 mL TB avec 28 g x 1/2 po. Capteur de pesage uniaxial à aiguille, stérile ou équivalent
TA InstrumentsCapacité 20 N
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc.SI-0236ou
logiciel WinTest équivalent  ;TA Instrumentscompatible avec Electroforce 3200
Système par air Systèmes d’essai des matériaux

Références

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Lésion non invasive du ligament croisé antérieur (LCA) induite par compression et imagerie in vivo de l’activité de la protéase chez la souris
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