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Article de méthode

Un modèle d’infection à Candida albicans d’articulation périprothétique chez la souris

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DOI :

10.3791/65263

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2 février 2024

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1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Dans cet article

Résumé

L’infection de l’articulation périprothétique (PJI) causée par des agents pathogènes dangereux est fréquente en orthopédie clinique. Les modèles animaux existants ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI. Ici, nous avons établi un modèle murin de PJI associé au biofilm de Candida albicans pour la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la PJI.

Résumé

L’infection articulaire périprothétique (PJI) est l’une des infections courantes causées par Candida albicans (C. albicans), qui inquiète de plus en plus les chirurgiens et les scientifiques. En général, des biofilms qui peuvent protéger C. albicans des antibiotiques et de la clairance immunitaire se forment au site de l’infection. La chirurgie impliquant le retrait de l’implant infecté, le débridement, le traitement antimicrobien et la réimplantation est l’étalon-or pour le traitement de la PJI. Ainsi, l’établissement de modèles animaux de PJI est d’une grande importance pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments ou traitements pour la PJI. Dans cette étude, un fil lisse en alliage nickel-titane, un implant largement utilisé dans les cliniques orthopédiques, a été inséré dans l’articulation fémorale d’une souris C57BL/6 avant que C. albicans ne soit inoculé dans la cavité articulaire le long du fil. Après 14 jours, des biofilms matures et épais ont été observés à la surface des implants sous un microscope électronique à balayage (MEB). Une trabécula osseuse significativement réduite a été trouvée dans la coloration H&E des échantillons d’articulations infectés. En résumé, un modèle PJI murin présentant les avantages d’une utilisation facile, d’un taux de réussite élevé, d’une répétabilité élevée et d’une corrélation clinique élevée a été établi. On s’attend à ce qu’il s’agisse d’un modèle important pour les études cliniques sur la prévention de l’ICP liée au biofilm de C. albicans.

Introduction

Candida albicans (C. albicans) réside commensalement dans de nombreuses parties du corps humain1, qui est également l’agent pathogène opportuniste le plus courant qui provoque des infections fongiques invasives potentiellement mortelles, en particulier chez les patients immunodéprimés 2,3. C. albicans peut passer de l’état de levure à l’état de mycélium en tant que champignon polymorphe. L’état mycélium présente une virulence plus élevée, une adhérence plus forte et une invasion des cellules et des tissus 4,5. En outre, C. albicans peut former des biofilms sur les surfaces des matériaux biomédicaux tels que les prothèses dentaires, les cathéters et les stents 1,6,7. La structure tridimensionnelle dense des biofilms limite l’infiltration des médicaments antifongiques, exprime les gènes résistants aux médicaments et régule à la baisse le métabolisme des cellules fongiques pour résister à la clairance du système immunitaire 6,7. Par conséquent, les infections liées aux biofilms sont assez difficiles dans les cliniques8.

Staphylococcus aureus, staphylocoque à coagulase négative et entérobactérien sont les principaux agents pathogènes responsables de la PJI9. Bien que l’incidence de l’ICP fongique soit relativement faible (environ 1 %)10, le coût du traitement de l’ICP fongique est plus élevé11, le cycle de traitement est plus long11 et le taux de réussite du traitement est inférieur10 à celui de l’ICP bactérienne. Au cours des dernières années, l’incidence de l’IPAD fongique a augmenté d’année en année10. La PJI de Candida représente de 77 % à 84 % des PJI10,12 fongiques, et C. albicans est la plus fréquente chez Candida (54 %). Par conséquent, la PJI fongique doit être étudiée.

À l’heure actuelle, la PJI est traitée par chirurgie de révision par (1) le retrait de l’implant infecté, (2) le débridement, (3) le traitement antimicrobien et (4) la réimplantation. Après un débridement complet, un antibiotique contenant du ciment osseux est placé et le patient est traité avec des antibiotiques par voie systémique pendant plus de 6 semaines pour contrôler efficacement l’infection avant qu’un nouvel implant ne soit placé13. Cependant, cette méthode ne peut pas éliminer complètement les agents pathogènes dans les tissus, et les infections récurrentes traitées par un traitement antimicrobien à long terme sont très susceptibles de se développer dans les souches résistantes aux médicaments 14,15,16.

L’établissement de modèles animaux de PJI est important pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments ou traitements pour la PJI. Dans le développement de la PJI, de grands espaces morts se forment autour de la prothèse, conduisant à la formation d’hématomes, qui bloquent davantage l’approvisionnement en sang des tissus environnants et altèrent l’effet des antibiotiques11,15. En raison de la difficulté d’imiter l’environnement de la prothèse, les modèles animaux traditionnels ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI17,18.

Dans cet article, un modèle PJI associé au biofilm de C. albicans chez la souris a été construit en utilisant un fil de titane-nickel largement utilisé en clinique pour simuler des implants articulaires19,20. Ce modèle PJI présente les avantages d’une utilisation facile, d’un taux de réussite élevé, d’une répétabilité élevée et d’une corrélation clinique élevée. On s’attend à ce qu’il s’agisse d’un modèle important pour l’étude de la prévention et du traitement de la PJI liée au biofilm de C. albicans.

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Protocole

Les animaux ont été achetés à l’Université Jiaotong de Xi’an. Toutes les procédures d’expérimentation animale ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Université Jiaotong de Xi’an (numéro d’approbation : SCXK [Shaanxi] 2021-103). Les souris ont été gardées pendant une semaine avec 5 souris par cage. Ils ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau. Les animaux ont été maintenus à température ambiante (RT ; 24 °C ± 1 °C) et à un cycle lumière/obscurité (12 h/12 h) avant que l’étude ne soit réalisée.

1. Préparation du tampon et de l’équipement

  1. Culture cellulaire de C. albicans
    1. Inoculer une colonie monoclonale de C. albicans (SC5314) à partir d’un milieu en plaques de peptone dextrose (YPD) d’extrait de levure avec une boucle d’inoculation dans 5 mL de milieu liquide YPD (YPD + 50 μg/mL de carbénicilline).
    2. Agiter ensuite les cellules de C. albicans à une vitesse de 220 tr/min à 30 °C pendant la nuit.
    3. Centrifuger la suspension à 400 x g pendant 5 min à RT. Remettre en suspension les cellules de C. albicans dans une solution saline normale et diluer la concentration des cellules à 1 x 106 cellules/mL en ajustant visuellement la turbidité pour qu’elle soit la même qu’un McFarland de 0,5.
  2. Préparation d’une solution saline normale
    1. Peser 0,9 g de chlorure de sodium et le dissoudre dans 100 ml d’eau déminéralisée pour obtenir une solution saline normale à 0,9 %.
  3. Préparation des instruments chirurgicaux
    1. Autoclaver (121 °C, 30 min) les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces hémostatiques, porte-aiguilles, aiguilles de suture) et le fil en alliage titane-nickel (environ 0,5 mm de diamètre) avant utilisation.

2. Établissement d’un modèle PJI de souris

  1. Divisez au hasard 30 souris C57BL/6 (mâles, 15-20 g) en 3 groupes (10 souris/groupe), à savoir, le groupe témoin, le groupe d’implants vierges (implantation de fil de titane-nickel sans infection par C. albicans ) et le groupe PJI (implantation de fil de titane-nickel avec infection à C. albicans ).
  2. Anesthésiez les souris avec 1 à 4 % d’isoflurane par inhalation avant d’enlever les poils du membre postérieur gauche et de les désinfecter avec de l’iode. La perte du réflexe de redressement et l’absence de réponse à la stimulation des orteils confirment la profondeur de l’anesthésie. Pendant l’anesthésie, appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse cornéenne et pour reconstituer la chaleur pendant la chirurgie et la récupération.
  3. Pour les souris du groupe témoin, ne pas fournir de traitement. Donnez-leur un accès gratuit à l’eau et à la nourriture.
  4. Pour les souris du groupe implant vierge et du groupe PJI, faites une incision longitudinale de 5 mm sur le genou de chaque membre postérieur gauche avec une lame #10 ou un rasoir stérile pour exposer les articulations.
  5. Faire un trou de 5 mm de longueur dans le canal intramédullaire fémoral en insérant une aiguille de seringue stérile (26 G).
  6. Insérez un fil lisse en alliage nickel-titane (0,5 mm de diamètre, 5 mm de longueur) dans le trou avant de le couper avec des ciseaux (Figure 1).
  7. Pour les souris du groupe d’implants vierges, ajouter 2 μL de milieu YPD le long du fil en alliage nickel-titane goutte à goutte avant de refermer la plaie couche par couche à l’aide d’une suture en nylon (0,15 mm de diamètre).
  8. Pour les souris du groupe PJI, inoculez 2 μL de cellules de C. albicans (1 × 106 cellules/mL) dans l’espace articulaire des souris le long du fil en alliage nickel-titane goutte à goutte avant de refermer la plaie couche par couche à l’aide d’une suture en nylon.
  9. Hébergez les souris avec un accès gratuit à l’eau et à la nourriture pendant 14 jours. Administrer le méloxicam par injection sous-cutanée (4 mg/kg) toutes les 24 h pendant 3 jours maximum.
  10. Après 14 jours, anesthésiez les souris avec de l’isoflurane à 3 % avant d’euthanasier les souris par luxation cervicale.

3. Évaluation du modèle PJI

  1. Évaluation des infections dans les principaux organes
    1. Prélevez les reins, le foie et la rate des souris après les euthanasies.
    2. Ajouter 500 μL de sérum physiologique stérile dans chaque organe et broyer les tissus sur un homogénéisateur à 4 °C.
    3. Ajouter 100 μL de l’homogénat préparé à l’étape 3.1.2 dans une plaque YPD avant de l’étaler uniformément à l’aide d’une tige coudée.
    4. Placez les plaques YPD inversées dans un incubateur à 37 °C pendant 48 h.
    5. Observez et comptez visuellement le nombre de colonies.
  2. Observation de C. albicans et de biofilms sur les implants
    1. Coupez soigneusement la peau sur l’articulation des souris avec des ciseaux avant de récupérer l’implant avec une pince à épiler.
    2. Maintenir les implants immergés dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % pour la fixation à 4 °C pendant 48 h.
    3. Rincez trois fois les implants avec du PBS stérile avant de les immerger dans une solution d’acide d’osmium à 1 % pendant 3 h.
    4. Rincez les implants avec du PBS stérile trois fois avant de les immerger dans des solutions d’éthanol à 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 % pendant 15 minutes pour la déshydratation.
    5. Gardez les implants immergés dans du tert-butanol pendant 30 minutes trois fois avant de les lyophiliser.
    6. Fixez les échantillons d’implant à la platine d’échantillonnage, enduisez l’implant d’or (revêtement de 10 nm) et observez-le sous un microscope électronique à balayage (MEB) sous vide poussé et à 1,5 kV.
  3. Analyse pathologique des tissus du fémur
    1. Prélevez les tissus fémoraux avec des ciseaux après avoir euthanasié les souris.
    2. Immerger les tissus du fémur dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
    3. Placez les tissus du fémur dans du formol à 10% pendant 1 semaine.
    4. Déshydratez les tissus du fémur en les immergeant dans des solutions d’éthanol à 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 % pendant 15 minutes, respectivement.
    5. Intégrez les tissus déshydratés du fémur dans de la paraffine avant de les sectionner en échantillons de 4 μm à l’aide d’un microtome.
    6. Colorer les coupes de fémur avec de l’hématoxyline et de l’éosine en suivant un protocole standard avant l’analyse pathologique21.

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Résultats

Le transfert des échantillons sur un milieu plaque et le comptage des colonies après une nuit d’incubation sont couramment utilisés pour évaluer la charge pathogène locale près de la lésion22,23. Dans notre étude, la culture microbienne d’échantillons de foie, de rein et de rate était négative, ce qui indique que le modèle de cette étude n’a conduit qu’à une infection locale au lieu d’une infection systémique chez les souris23.

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Discussion

L’infection causée par la contamination des instruments chirurgicaux ou de l’environnement chirurgical pendant la chirurgie est la principale raison de la plupart des infections implantaires 24,25,26,27. Par conséquent, un modèle PJI lié au biofilm de C. albicans de souris a été construit dans cette étude. Par rapport au modèle PJI traditionnel dans lequel des particules d’acier inoxyd...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants du soutien financier de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shaanxi (numéro de subvention 2021SF-118) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81973409, 82204631).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 ° ; C réfrigérateurElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Balances analytiquesShimadzuATX124
Autoclaves StérilisateurSANYOMLS-3750
CarbenicillineAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon microscope optique droit  ;NikonEclipse Ts2-FL
GlucoseMacklin  ;
Anneau d’inoculationThermo Scientific251586
IsofluraneRWD20210103
NaClXi’an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldéhydeBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Appareil d’anesthésie multicanal pour petits animaux RWD R550RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubateur de températureShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Générateur d’eau d’eau ultrapureHeal ForceNW20VF
ÉchographeDo-ChromDS10260D
Extrait de levureThermo Scientific  ; OxoidLP0021B
D823520

Références

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