Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Résumé

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Résumé

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

Introduction

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme ^1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer³. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles à^traiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7

Protocole

1. Préparation du matériel

1. Culture de 2 x 10⁶ cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h.
2. Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 10⁷ cellules), sinon les étapes de fixation et de déshydratation suivantes ne fonctionneront pas bien.
3. Ajouter 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % comme fixateur pour fix....

Résultats

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL3⁴⁸ (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-1⁴⁹ (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 (figure supp.......

Discussion

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’une forte reproductibilité des .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acétone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging		2020.2
Acide aspartique	MCE	HY-42068
Dulbecco’s modified Eagle' s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatine-1	MCE	HY-100579
Sérum fœtal bovin	Gibco	10437010
Microscope électronique à balayage à émission de champ	HITACHI	SU8010
Glutaraldéhyde	Alfa Aesar	A10500.22
Plomb nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Tétroxyde d’osmium	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées  ;
Pénicilline-streptomycine	Biosharp	BL505A
Saline tamponnée au phosphate	Biosharp	BL302A
Pon 812 Résine époxy	SPI CHEM	GS02660
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Acétate d’uranyle	RHAWN	R032929

98102213 Ferrocyanure de potassium Macklin P816416