Method Article

Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

DOI:

10.3791/65290

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme 1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer3. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles àtraiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7, a été lié aux mécanismes de la maladie sous-jacents PC8. Les mitochondries sont également très dynamiques, ce qui se reflète dans les changements fréquents et dynamiques de leur connectivité réseau et de leur structurecritique 9. Le remodelage de la structure des cristae peut avoir un impact direct sur la fonction mitochondriale et l’état cellulaire 10,11, qui sont considérablement modifiés au cours de la croissance des cellules tumorales, des métastases et des changements du microenvironnement tumoral 12,13.

Ces dernières années, les scientifiques ont étudié cet organite en utilisant l’observation EM14,15,16,17; par exemple, les chercheurs ont analysé la dynamique mitochondriale à l’aide de techniques de reconstruction 3D 6,7,18,19. Le concept général et la méthode de reconstruction 3D d’images de microscopie électronique ont été formellement établis dès 196820 et impliquaient la combinaison de la microscopie électronique, de la diffraction électronique et du traitement d’images par ordinateur pour reconstruire la queue du phage T4. Jusqu’à présent, la technologie d’imagerie 3D par microscopie électronique a fait des progrès significatifs en termes de résolution d’image21, de degré d’automatisation 22 et de volume de traitement 23 et a été utilisée à une échelle de plus en plus large dans la recherche biologique, du niveau tissulaire à l’ultrastructure des organites à l’échelle nanométrique24. Ces dernières années, l’imagerie 3D par microscopie électronique est également devenue une technologie prometteuse pour un large éventail d’applications25,26,27.

L’attention croissante portée aux cristae mitochondriales illustre particulièrement les exigences essentielles de l’imagerie ultrastructurale du volume. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour visualiser des échantillons prélevés sur une grille de cuivre (400 mesh)28, le faisceau d’électrons traversant la section. Cependant, en raison de la portée limitée de la grille de cuivre, il est impossible d’imager complètement des tranches continues du même échantillon29. Cela complique l’étude des structures cibles lors de l’imagerie TEM. De plus, la GDT repose sur des tâches manuelles longues et sujettes aux erreurs, y compris la découpe et la collecte de plusieurs tranches et leur imagerie séquentielle21, de sorte qu’elle n’est pas adaptée aux reconstructions ultrastructurales d’échantillons de grand volume23. À l’heure actuelle, la reconstruction à haute résolution d’échantillons d’échantillons de grand volume est réalisée grâce à l’utilisation d’équipement spécialisé, comme le réseau de caméras TEM (TEMCA)30 ou deux systèmes TEMCA de deuxième génération (TEMCA2)31, qui permettent d’obtenir rapidement des images automatisées à haut débit. Cependant, ce type d’imagerie n’a pas l’avantage d’être facile à obtenir et universel en raison de la nécessité d’un équipement personnalisé.

Par rapport à la TEM, la méthode de génération automatique de milliers d’images volumétriques série pour de grandes surfaces basée sur SEM32,33 améliore l’efficacité et la fiabilité de l’imagerie série et offre des résolutions z34 plus élevées. Par exemple, la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont toutes deux permis de réaliser la reconstruction 3D de l’ultrastructure avec une vitesse, une efficacité et une résolution élevées35,36. Cependant, il est inévitable que la surface du bloc soit rasée mécaniquement par le couteau diamanté du SBF-SEM ou par fraisage avec le faisceau d’ions focalisé de FIB-SEM33,37. En raison du caractère destructeur des deux méthodes pour les échantillons, il n’est pas possible de reconstruire la même structure cible pour une analyse plus approfondie38,39,40. De plus, peu d’études ont tenté de reconstruire l’ultrastructure 3D des organites des cellules cancéreuses en utilisant EM pour observer des changements pathologiques12. Pour ces raisons, afin d’élucider davantage les mécanismes pathologiques des cellules cancéreuses, telles que les cellules cancéreuses du pancréas, nous proposons une nouvelle technologie pour la reconstruction 3D d’images de coupe en série à l’aide d’un ultramicrotome et d’un microscope électronique à balayage par émission de champ (FE-SEM) pour analyser l’ultrastructure mitochondriale au niveau des crêtes; Grâce à cette technologie, des données haute résolution peuvent être acquises à l’aide d’une méthode efficace et accessible. Les sections ultraminces en série réalisées à l’aide d’un ultramicrotome peuvent être stockées de manière semi-permanente dans un boîtier de grille et réimagées plusieurs fois, même après plusieurs années41. FE-SEM est un outil très apprécié dans divers domaines de recherche en raison de sa capacité à fournir une imagerie haute résolution, un grossissement élevé et une polyvalence42. Dans une tentative d’afficher la structure fine des organites en 3D, la technique de production d’empilements d’images 2D en série avec une résolution utile en utilisant des électrons rétrodiffusés produits par FE-SEM 43,44 peut également être utilisée pour obtenir une imagerie à haut débit et multi-échelle des régions cibles ou de leurs structures associées sans équipement spécial 45. La génération d’artefacts de charge affecte directement la qualité des images acquises, il est donc particulièrement important de garder le temps de séjour court.

Ainsi, la présente étude développe les procédures expérimentales employées dans cette technique SEM pour reconstruire la structure 3D des cristae mitochondriales46. Plus précisément, nous montrons le processus développé pour réaliser la segmentation semi-automatique des régions mitochondriales et numériser la reconstruction 3D à l’aide du logiciel Amira, ce qui implique également de faire des échantillons de tranches en utilisant la méthode conventionnelle de préparation des échantillons OTO44,47, de compléter la collection de sections en utilisant le découpage ultramicrotome et d’acquérir des données 2D séquentielles par FE-SEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation du matériel

  1. Culture de 2 x 106 cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h.
  2. Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 107 cellules), sinon les étapes de fixation et de déshydratation suivantes ne fonctionneront pas bien.
  3. Ajouter 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % comme fixateur pour fixer les cellules fraîches de Panc02 dans les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Les échantillons doivent être centrifugés à 1 006 x g pendant 5 minutes dans chacune des étapes suivantes (étapes 1.3-1.11).
  4. Aspirer le fixateur et rincer les échantillons deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M, puis rincer deux fois à l’eau bidistillée (ddH2O) à température ambiante pendant 10 minutes chacun.
  5. Ajouter 50 μL d’une solution contenant 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium dans un rapport de 1:1 à 4 °C pendant 1 h. Ensuite, rincez deux fois avec 0,1 M PBS pendant 10 minutes à chaque fois, et rincez avec ddH2O pendant encore 10 min.
  6. Ajouter 1 mL de thiocarbohydrazide (TCH) à 1 %, incuber à température ambiante pendant 30 min à 1 h, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 min à chaque fois.
  7. Ajouter 50 μL d’OsO4 à 1%, fixer à température ambiante pendant 1 h, puis rincer avec du ddH2O quatrefois pendant 10 min à chaque fois.
  8. Ajouter 1 mL d’acétate d’uranyle à 2 % à 4 °C pendant une nuit, puis rincer avec duddH2Oquatre fois pendant 10 minutes à chaque fois.
  9. Ajouter 1 mL de solution Walton (0,066 g de nitrate de plomb dissous dans 10 mL de solution mère d’acide aspartique 0,03 mol/L) à 60 °C pour 1 heure supplémentaire d’incubation.
  10. Rincer avec ddH2O quatre fois pendant 10 min à chaque fois, puis déshydrater en série d’alcool gradué pendant 10 minutes à chaque fois: 50% d’alcool, 70% d’alcool, 80% d’alcool et 90% d’alcool 1x et 100% d’alcool 2x. Ensuite, déshydratez deux fois dans de l’acétone à 100% pendant 10 minutes. Utilisez 1 mL de chaque solution pour la déshydratation.
  11. Mélanger 200 μL d’acétone avec de la résine époxy Pon 812 dans un rapport de 3:1, 1:1 et 1:3. Faire tremper l’échantillon dans de la résine à température ambiante pendant 2 h, 4 h et 4 h, respectivement, puis prélever la résine époxy 100% Pon 812 pour imprégner pendant la nuit.
    REMARQUE: Lors de l’exécution des étapes de coloration et d’incorporation de résine, il est important de fonctionner dans une hotte car ce sont des substances toxiques. De plus, des blouses de laboratoire et des gants résistants aux solvants doivent être portés pendant l’expérience.
  12. Mettre les échantillons dans un moule d’encastrement, puis les placer dans une étuve à 60 °C pendant 48 h pour polymériser. Utilisez un enrobage plat29 pour réduire l’apparence de la résine autour de l’échantillon. Cela simplifie l’installation du spécimen et diminue l’impact des artefacts de charge sur la segmentation ultérieure de l’image.
    REMARQUE: Pour générer par la suite une surface de coupe horizontale, une petite quantité de résine peut être ajoutée dans le trou du moule, en prenant soin de ne pas trop le remplir.
  13. Préparer les plaquettes de silicium en les lavant d’abord puis en les hydrophilisant avec une solution concentrée deH2SO4/H2O2pendant 30 min. Recueillir en série des bandes de tranches d’une épaisseur de 70 nm sur les plaquettes de silicium hydrophilisé à l’aide d’un ultramicrotome et les sécher dans un four à 60 °C pendant 10 min.
    REMARQUE: Capturez lentement la tranche pendant que la tranche flotte à la surface des plaquettes pour éviter la perte ou la déformation de la tranche.

2. Acquisition d’images et reconstruction tridimensionnelle

  1. Avant de monter une plaquette de silicium sur la scène, lavez les sections avec de l’eau distillée trois fois et séchez-les à l’air. Découpez un ruban de carbone conducteur d’une taille de 1 cm x 0,5 cm et collez-le entre la plaquette de silicium et l’étage de l’échantillon MEB pour compléter la configuration de l’échantillon (Figure 2E).
  2. Réglez le paramètre de tension d’accélération FE-SEM sur 2 kV avec une distance de travail de 4 mm (Figure 3B et Tableau 1).
    REMARQUE: Afin d’améliorer le rapport signal sur bruit et de réduire le bruit dans l’image, observez à faible grossissement chaque fois que possible. Au fur et à mesure que le multiple augmente, la portée de balayage du MEB diminue, ce qui entraîne une augmentation de l’accumulation de charge sur les images.
  3. Cliquez sur l’icône H/L dans la barre de menu supérieure. Tout d’abord, à faible grossissement, orientez la première section des bandes de découpe cibles, puis cliquez à nouveau sur l’option H/L (Figure 3A) pour passer en mode de grossissement élevé ; Collectez une image appropriée pour la structure d’intérêt en ajustant la luminosité, le contraste et l’agrandissement de l’image.
  4. Sélectionnez Project View > Open Data et importez les fichiers image à analyser dans le logiciel.
  5. Alignez les images en cliquant sur Aligner les tranches > Modifier (Figure 4B) et ajustez la valeur Plage d’intensité dans la barre de menu inférieure gauche en modifiant la transparence de l’image. Ici, utilisez une stratégie d’alignement semi-automatique; Plus précisément, grâce à l’alignement automatique, faites en sorte que les images se chevauchent avec une image précédente, puis effectuez un réglage manuel fin.
    REMARQUE: Dans ce travail, pendant le processus d’alignement, l’image précédente a été utilisée comme référence, et les opérations de déplacement et de rotation ont été utilisées pour chevaucher au maximum la structure cible des deux images. Cliquer sur Aligner la paire de tranches actuelle peut aider à aligner les images automatiquement, mais un mauvais placement peut se produire.
  6. Sélectionnez le module Extraire le sous-volume et découpez les ensembles de données alignés pour les adapter à la taille de la partie qui se chevauche de l’ensemble de la pile.
  7. Sous la sous-section Segmentation (Figure 4C), sélectionnez Rééchantillonner > segmentation > Enregistrer. Choisissez le seuil de la baguette magique et la taille de l’outil Pinceau pour sélectionner la plage appropriée. Là encore, adoptez une méthode de segmentation semi-automatique en utilisant d’abord la baguette magique pour sélectionner automatiquement une grande surface appropriée, puis utilisez le pinceau pour décrire avec précision les détails.
    REMARQUE: La baguette magique peut être appliquée pour segmenter les images en fonction des différences évidentes d’intensité en pixels existant entre la structure d’intérêt et les structures environnantes en modifiant la valeur de masquage et en utilisant la ligne limite de dessin. Il est incapable de distinguer les artefacts de charge générés lors de l’acquisition d’images. Par conséquent, cela peut entraîner une segmentation incorrecte pour les régions cibles. L’outil Pinceau peut être utilisé pour segmenter manuellement afin de reconstruire avec précision les structures biologiques.
  8. Sous Segmentation > Selection, cliquez sur l’icône + pour ajouter la zone sélectionnée (Figure 4C).
  9. Répétez l’étape ci-dessus (2.8) pour sélectionner la même structure cible dans différentes images jusqu’à ce que la sélection soit terminée pour reconstruire les microstructures d’intérêt.
    REMARQUE: Pendant les processus de remodelage mitochondrial, la sélection de l’objet cible doit être effectuée à partir de l’image au milieu d’un groupe d’images séquentielles. Si la zone requise est sélectionnée à partir de la première ou de la dernière image, le résultat de la reconstruction ne pourra pas présenter une visualisation 3D complète.
  10. Une fois la segmentation régionale terminée, générez le fichier image en fonction des meilleurs résultats pour la taille de l’objet et la résolution de l’image. Cliquez sur Crop Editor (Éditeur de recadrage), puis entrez le chiffre 6 dans la zone Virtual Slider (Figure 4C).
  11. Dans le menu déroulant de gauche, cliquez avec le bouton droit sur la zone grise sous la sous-section Projet , puis sélectionnez Générer une surface > Créer > Appliquer. Dans le fichier généré, utilisez le module Surface View pour créer la structure de surface et la représentation 3D.

3. Quantification

  1. Cliquez sur Remove Small Spots > Apply (Supprimer les petites taches ) (Figure 4D). Dans la sous-section Projet , cliquez avec le bouton droit sur la zone grise, puis sélectionnez Analyse d’étiquette > Appliquer (Figure 4D).
  2. Personnalisez le nom de la colonne et choisissez un groupe de mesures. Sélectionnez Volume3d et Longueur3d dans la zone Mesures natives.
  3. Cliquez sur le bouton Appliquer dans le coin inférieur gauche de l’écran. Copiez les données et le graphique dans le logiciel statistique, tel que GraphPad.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 (figure supp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’une forte reproductibilité des ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274364, 81673607 et 81774011); ainsi que le projet de recherche sur le bien-être public de la subvention scientifique et technologique de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Nous apprécions l’aide, le soutien technique et le soutien expérimental de la plate-forme publique du Centre de recherche médicale, de l’Académie des sciences médicales chinoises, de l’Université médicale chinoise du Zhejiang.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcétoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Acide aspartiqueMCEHY-42068
Dulbecco’s modified Eagle' s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatine-1MCEHY-100579
Sérum fœtal bovinGibco10437010
Microscope électronique à balayage à émission de champHITACHISU8010
GlutaraldéhydeAlfa AesarA10500.22
Plomb nitrateSANTA CRUZsc-211724
Tétroxyde d’osmiumSANTA CRUZsc-206008B
Panc02Collection européenne de cultures cellulaires authentifiées  ;
Pénicilline-streptomycineBiosharpBL505A
Saline tamponnée au phosphateBiosharpBL302A
Pon 812 Résine époxySPI CHEMGS02660
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Acétate d’uranyleRHAWNR032929
98102213 Ferrocyanure de potassium Macklin P816416

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39(2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644(2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610(2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037(2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604(2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673(2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254(2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux' Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350(2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited - New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383(2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118(2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56(2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38(2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804(2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368(2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373(2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068(2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321(2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414(2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021(2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371(2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431(2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340(2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740(2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916(2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036(2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699(2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996(2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer's disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial UltrastructurePancreatic Cancer CellsThree Dimensional ReconstructionScanning Electron MicroscopySerial Ultrathin SectionMitochondrial CristaeElectron MicroscopyOrganelle MorphologyOTO MethodMitochondrial Dysfunction

Related Articles